Imagem ex vivo da migração de células granulares cerebelares pós-natais usando macroscopia confocal

Comece com uma fatia cerebelar obtida de um cérebro de filhote de rato pós-natal em uma placa de vários poços contendo meio.

Remova o meio e incube a fatia em uma solução de corante fluorescente citoplasmático para marcar as células granulares (GCs).

Transfira a fatia para uma membrana de inserção transwell e remova o excesso de corante.

Remova o inserto e encha o poço com mídia. Em seguida, substitua a inserção e adicione mídia para cobrir o tecido.

Incube para permitir que o tecido se fixe à membrana de inserção.

Transfira a placa para uma incubadora conectada a um macroscópio confocal e coloque uma tampa de vidro sobre a placa.

Defina as condições de cultura, incube ainda mais o tecido e comece a fazer a imagem.

Após a iluminação do laser, os GCs rotulados fluorescem.

Capture imagens de lapso de tempo para visualizar a migração radial dos GCs através da camada molecular do cerebelo.

Usando software de imagem, analise a distância migratória dos GCs.

Depois de fatiar a amostra, use uma pipeta de bulbo branco truncado para transferi-la com um pouco de HBSS para uma placa de seis poços. Carregue até três fatias em cada poço. Em seguida, depois de esvaziar a mídia em cada poço carregado, adicione cinco mililitros de solução de carregamento contendo 10 micromolares do corante fluorescente. Para proteger as amostras da luz, cubra a placa com papel alumínio. Em seguida, coloque a placa em um mutador ajustado para 35 RPM. Deixe a placa incubar por 10 minutos em temperatura ambiente para permitir que o corante rotule as células.

Agora, transfira as fatias como antes para a membrana de uma inserção transwell que tenha poros de três mícrons. Em seguida, aspire o meio de carga, deixando apenas as fatias. Agora, remova a inserção e as fatias para encher o poço com 1,9 mililitros de DMEM. Em seguida, coloque a inserção de volta e adicione mais 100 microlitros de DMEM para cobrir os tecidos.

Incube esta preparação por duas horas, após as quais as células granulares serão visíveis. Transfira a placa sem tampa para uma câmara ambiental com fluxo de gás constante em um macroscópio confocal. Em seguida, coloque uma tampa de vidro na inserção da placa do macroscópio confocal. Para experimentos de lapso de tempo, deixe as células incubarem na câmara por mais duas horas antes de prosseguir.

Para visualizar as células granulares migrando nas fatias de tecido, ilumine a preparação com luz de 488 nanômetros e use uma objetiva seca 2X. Detecte emissões de fluorescência de 500 a 530 nanômetros. Usando ImageJ, para cada imagem do filme de lapso de tempo, execute uma projeção de pilha Z usando o modo de desvio padrão.

Ajuste os níveis de contraste e brilho de cada imagem para que as células granulares rotuladas sejam fáceis de ver. Agora, escolha o plug-in Rastreamento manual no menu de análise de partículas. Use o plug-in para clicar no ponto central de cada corpo celular rotulado ao longo da sequência de imagens de lapso de tempo. Em seguida, exporte os dados brutos de rastreamento para uma planilha para análise posterior.

Reorganize os dados brutos de rastreamento exportados do ImageJ com uma ferramenta caseira inteligente que identifica cada célula e as posições associadas. Usando o programa, calcule a distância total percorrida e a velocidade média de migração para cada célula.