Visualizando a sinaptogênese de neurônios do grânulo cerebelar em diferentes estágios de desenvolvimento

Comece com fatias de tecido cerebral pré-fixadas coletadas de estágios pós-natais iniciais e tardios de camundongos.

A fatia contém neurônios granulares cerebelares, ou CGNs, expressando uma proteína fluorescente.

Usando um microscópio confocal, concentre-se em um único CGN fluorescente.

Capture imagens z-stack em profundidades variadas para criar uma visão tridimensional do neurônio.

Usando um software de imagem, rastreie os neuritos dos neurônios ou projeções longas, incluindo dendritos e axônios.

Meça o comprimento do dendrito do corpo celular até sua ponta.

Analise a formação de garras dendríticas, estruturas especializadas nas pontas dos dendritos onde os sinais de outros neurônios são recebidos.

Além disso, avalie a área de superfície e o volume do neurônio.

No estágio pós-natal inicial, os neurônios mostram um número aumentado de dendritos, sem formação de garras.

Enquanto isso, no estágio pós-natal tardio, há menos dendritos, mas seus comprimentos e o número de garras aumentam.

Assim, com a idade, os CGNs sofrem sinaptogênese e formam conexões com outras células para transmissão de sinal.

Para estudar a morfologia de CGNs eletroporados únicos de seções cerebrais sagitais do filhote experimental, tire imagens de pilha z a 0,5 micrômetros por pilha em um microscópio confocal. Imagem de uma célula por janela de imagem para permitir fácil análise de imagem e reconstrução 3D. Analise o comprimento do neurite e a formação de garras dendríticas de maneira cega usando um rastreador de neurite simples.

Carregue imagens de pilha de canal único de CGNs eletroporados em Fiji e clique em Plugins, Segmentação e Rastreador de neurite simples. Selecione Criar novo visualizador em 3D no menu suspenso. Role até a base de um dendrito que se conecta ao soma celular e inicie um banho clicando na junção. Trace manualmente o caminho clicando nas seções onde o sinal de preenchimento da célula é mais brilhante e pressionando Y para manter o rastreamento.

Trace até o final do dendrito e confirme o caminho pressionando F. Alternativamente, trace até a base da garra. Em seguida, trace a garra da base da estrutura até o final da neurite mais longa. Rastreie ramificações secundárias e terciárias mantendo pressionada a tecla Control no Windows ou Alt em um Mac OS e clicando no caminho. Confirme o caminho pressionando F. Observe que as medições dos traços são visíveis em uma janela separada. Some todos os tamanhos dos galhos da garra para obter o comprimento total de cada garra.