Name: Investigação de Synaptic Tagging / Captura e-captura Cruz usando aguda fatias do hipocampo de roedores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Aprenda a investigar marcagem sináptica e captura cruzada em neurônios piramidais de CA1 usando fatias agudas de hipocampo de roedores. Este método permite estudar plasticidade de longo prazo e formação de memória.

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Este artigo em vídeo é patrocinado pela Cerebos Pacific Limited. Este trabalho é apoiado pela Bolsa de Pesquisa Colaborativa do Conselho Nacional de Pesquisa Médica (NMRC-CBRG-0041/2013) e pelo Financiamento de Pesquisa Acadêmica do Ministério da Educação (MOE AcRF- Tier 1 - T1-2012 Oct -02).

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade Nacional de Cingapura. 1. Preparação de Cerebrospinal Artificial Fluid (ACSF) <ol><li> Prepara-se o ACSF que consiste em (em mM) 124 de NaCl, 3,7 de KCl, 1,0 MgSO 4 .7H 2 O, 2,5 CaCl 2 .2H 2 O, 1,2 KH 2 PO 4, 24,6 NaHCO3, e 10 D-glucose. Assegurar o pH da ACSF entre 7,2-7,4 quando é feito borbulhar para a saturação com 95% de O2 e 5% de CO 2 a mistura (carbogénio). 21 A utilização deste ACSF tanto para a dissecção, a preparação e para a fatia de perfusão durante as gravações electrofisiológicos. NOTA: Use aparelho limpo para medir e segurando o ACSF. Usando o aparelho impuro pode conduzir a soluções turvas ou formação de precipitados. Use água deionizada por todos os preparativos. </li><li> Prepare a 2 L de 10x estoque ACSF excluindo NaHCO3 </sUB&gt; e D-glucose numa balão volumétrico. Adicionar os reagentes em água desionizada na seguinte ordem: NaCl (144.96g), KCl (5,52 g), MgSO 4 .7H 2 0 (4,92 g), CaCl2 .2H 2 0 (7,56 g), KH 2 PO 4 (3,28 g) e de topo até um volume de 2 L. Agita-se continuamente durante pelo menos 30 min utilizando um agitador magnético para garantir que todos os reagentes são dissolvidos. Armazenar o estoque em 4 ° C e usar dentro de 2 semanas. </li><li> Antes da dissecção e as experiências, diluir o estoque ACSF num balão volumétrico, juntamente com a adição de quantidades necessárias de NaHCO3 e D-glucose. Para uma solução de L, dilui-se 100 ml de solução stock para 1 L, após a adição de 2,07 g de NaHCO 3 e 1,802 g de D-glucose. O ACSF deve ser uma solução transparente livre de qualquer precipitado ou partículas não dissolvidas. </li><li> Fresco cerca de 200-300 ml de ACSF no gelo, para ser usado durante a dissecção. Certifique-se de que a ACSF utilizado para dissecção é entre 2-4 ° C. Use a ACSF restante para electropexperimentos hysiological. Bolha todas as soluções até à saturação ACSF com carbogénio (5% de CO2, 95% de O 2) continuamente. Enquanto espera para o ACSF para esfriar, preparar a área de dissecção e da câmara de fatia. </li></ol> 2. Preparação de interface Secção NOTA: Uma câmara de fatia interface cérebro, utilizados para incubação as fatias e mantê-los durante registos electrofisiolicos (Figura 2B), consiste em dois compartimentos. A câmara inferior contém água mantida a 32 ° C destilada por um controlador de temperatura e continuamente borbulhada com carbogénio. <ol><li> Ligue o controlador de temperatura predefinida e que a 32 ° C. Lavou-se a câmara superior por 10 a 15 minutos de corrida água destilada através do tubo de entrada. Certifique-se de que a câmara superior é limpo antes de colocar o líquido. Verificar que o nível de água na câmara inferior é cerca de 70% cheio com água destilada. </li><li> Coloque olíquido na câmara superior para proporcionar uma superfície de descanso para as fatias (Figura 2C). Ajustar o tubo de saída para assegurar que o nível da solução é suficientemente molhar toda a área da rede. Coloque a tampa acima da rede para manter uma atmosfera humidificada carbogénio dentro da câmara superior. </li><li> Ajustar o caudal de 1 ml / min. Manter esta taxa de fluxo ao longo do período de incubação e a fatia experimento. Comece carbogenating a ACSF 1x preparados e mergulhe o tubo de influxo para o ACSF. Permitir 20 min para o ACSF para ser saturada com carbogéneo e para a câmara superior para ser enchido com ela. </li></ol> 3. Preparação de agudos fatias do hipocampo NOTA: O protocolo de dissecção consiste de (1) remoção do cérebro do animal em ACSF frio e (2) Isolamento e corte do hipocampo. Para que os neurônios para permanecer viável, isolar e colocar o cérebro em ACSF frio rapidamente e completar o todoprocesso que inclui o corte dentro de 3-5 min. <ol><li> A remoção do cérebro em ACSF frio <ol><li> Separe as ferramentas de dissecação na maneira mostrada na Figura 1A. Organizar as ferramentas de acordo com a ordem de uso para facilitar o processo de dissecação. Antes de começar, certifique-se de todas as ferramentas de dissecação estão prontos. </li><li> Montar uma lâmina de barbear, limpos com acetato de etilo, etanol absoluto e água destilada, para o cortador de tecidos manual (Figura 1B), fixe-o com firmeza e assegurar que a vanguarda é uniformemente alinhadas. Teste cortando um pedaço de papel de filtro para assegurar que a lâmina está fixada firmemente. Definir o deslizamento Vernier micrômetro à sua posição inicial. </li><li> Eutanásia dos animais utilizando o dióxido de carbono (CO 2) numa câmara de indução e decapitar com tesouras ligadura ou guilhotina. Usando uma tesoura de íris, retire a pele e pêlo acima do crânio. Faça um corte através do posterior para remover a brainstem.Make uma pequena incisão ao longo thum e lado direito do crânio e uma longa incisão na parte esquerda. CUIDADO! Adicione apenas uma pequena incisão para o lado que é utilizado para as experiências para evitar danos. Ao inserir as tesouras, certifique-se de que a força aplicada é para cima a fim de evitar danos no cérebro. </li><li> Cuidadosamente remover o crânio com um osso rongeur a partir da esquerda para a direita do crânio para revelar o córtex. Uma fina camada de dura-máter pode também ser visto. Remova cuidadosamente as placas frontais com o rongeur. Remover a maior parte da dura-máter, juntamente com as placas frontais. CUIDADO! Tenha cuidado para que a dura-máter não cortar o tecido cerebral. </li><li> Remover a dura-máter restante, se houver, especificamente na junção entre o córtex e cerebelo com a extremidade plana de uma espátula. Para obter etapas 3.1.5 e 3.1.6, ou seja, manter uma pressão para cima, longe do cérebro para evitar danos. Utilizando a espátula, colher suavemente o cérebro para uma placa de petri cheia com água fria e ACSF carbogenated (2-4 ° C), PLAced sobre um bloco de alumínio de arrefecimento. </li></ol></li><li> O isolamento do hipocampo <ol><li> Usando um bisturi, fazer um corte em linha reta para remover o cerebelo e outro corte para remover a parte anterior do cérebro (cerca de um quarto). Faça um corte raso ao longo da linha média. </li><li> Remover cuidadosamente o córtex com um raspador de foice, a partir da linha média para revelar as hipocampo dorsal. Remover a camada de córtex acima do hipocampo. Use dedos ou uma pinça angular para apoiar o cérebro. Faça um pequeno corte para a comissura do hipocampo. Remova cuidadosamente o hipocampo com o scaler foice a partir do hipocampo dorsal usando movimentos ondulantes. CUIDADO! Seja gentil para evitar esticar e rasgar o hipocampo. </li><li> Remova qualquer córtex e tecidos conjuntivos em torno do hipocampo isolado com o scaler foice. </li></ol></li><li> Cortando o tecido do hipocampo e transferir as fatias para a câmara de interface <ol><li> Coloque um pedaço de ACSF-papel de filtro embebido (Grau 1, 30 mm) na fase de corte do cortador manual. Colher e colocar o tecido do hipocampo para o papel de filtro. Mover o papel de filtro para alinhar o hipocampo numa orientação adequada em relação à lâmina do cortador de modo a que o hipocampo é cortado com um ângulo de cerca de 70 O para a fímbria. </li><li> Seque a solução em excesso em torno do tecido do hipocampo com um papel de filtro dobrado (Grau 1, 85 mm), deixando o hipocampo ligeiramente molhado. Começar a cortar transversalmente o hipocampo. Fatia e eliminar o tecido a partir do extremo do hipocampo onde a morfologia fatia não é clara. </li><li> Corte o tecido remanescente em 400 fatias mm de espessura. Pegue fatias do hipocampo suavemente da lâmina com uma escova com cerdas macias usando movimentos suaves swiping e coloque as fatias em um pequeno copo cheio com ACSF carbogenated frio. Executar os passos 3.3.1-3.3.3 tão rapidamente quanto possível uma vez que o tecido do hipocampo é exposta ao ar. NOTA: De um modo geral, dois terços do hipocampo é cortado, e 4-6 fatias com morfologia clara pode ser preparado. </li><li> Transfira as fatias suavemente sobre a rede na câmara de fatia usando uma pipeta de Pasteur de plástico limpo com uma ponta larga (feito com a retirada de 2-3 cm da ponta). Ajustar cuidadosamente a posição das fatias na rede, usando uma pequena seringa com uma ponta dobrada. Posicione as fatias de uma maneira que facilita a localização do eletrodo e gravação. Verificar para assegurar que as fatias são suficientemente rodeado por ACSF mas não estão submersos ou flutuante (Figura 2C-D). Cubra a câmara e incubar as fatias de 2-3 horas. NOTA: A camada de células piramidais nas fatias saudáveis ​​devem mostrar alguma transparência. </li></ol></li></ol> 4. A gravação de Respostas CA3-CA1 Synaptic NOTA: O electrofisiologia set-up usado para gravação de campo potencial é mostrado na Figura 2A. A Faragaiola dia é fortemente recomendada se a interferência elétrica está além do controle após o aterramento adequado dos ajustes elétricos. Muitos tipos diferentes de câmaras submersas e de interface estão disponíveis comercialmente. No entanto, câmaras de interface são preferidos como fatias apresentam respostas sinápticas mais robustos em si. <ol><li> Posicionamento de eletrodos <ol><li> Ligue o aparelho eléctrico (estimuladores) e amplificadores para ser utilizado. Montar e fixar os eletrodos de estimulação e gravação nos suportes de acrílico dos micromanipuladores. NOTA: Nós usamos monopolar, revestido de laca, eletrodos de aço inoxidável de resistência 5 mohms, tanto para fins de estimulação e gravação. </li><li> Antes de usar, inserir esses eletrodos no interior dos capilares de vidro puxado e prenda com cola epóxi expondo apenas uma pequena porção da ponta do eletrodo (Figura 2E). Isto dá força para os eletrodos de outra forma delgado e ajuda a protegê-los firmemente no ELEctrode titulares. </li><li> Guiado sob o microscópio, posicione o eletrodo (s) estimulante no estrato radiante da região de CA1 para estimular as fibras colaterais Schaffer e do eletrodo de registro na região apical dendrítica de CA1 para gravar (fEPSP) respostas de campo-EPSP. NOTA: Aproximando-se da superfície do líquido acima da fatia com os eléctrodos dá um som que ajuda a localizar rapidamente a superfície da fatia (fornecida, o amplificador está ligado a um altifalante). </li><li> Em experiências de marcação e de captura sinápticos, de acordo com a necessidade do experimento, posição dois ou três eléctrodos estimulantes (S1, S2 ou S3) de cada lado do eléctrodo de registo para estimular a duas ou mais entradas independentes, mas que se sobrepõem. Posicione os eletrodos estimulantes e de gravação cerca de 200 mm de distância. </li><li> Se necessário, localizar outro eléctrodo de registo na camada de estrato pyramidale para gravação de pico população (Figura 3A) .Quando a amboseletrodos ter tocado a fatia, usando o software de aquisição, dar um estímulo de teste para garantir um sinal fEPSP adequada. NOTA: Nós usamos bifásicos, pulsos de corrente constante (duração de impulso de 0,1 ms / meia onda) para a estimulação de teste. </li><li> Uma vez que um sinal fEPSP adequada é obtida, baixe cuidadosamente os eletrodos cerca de 200 um profundo usando botões Movimento Belas dos manipuladores. Permitir que 20 min durante as fatias para recuperar. Teste a independência caminho com um protocolo de facilitação emparelhado pulso 27,28. </li></ol></li><li> Relação de entrada-saída <ol><li> Determinar a relação de entrada-saída (estimulação aferente vs fEPSP inclinação) para cada entrada através da medição do valor da inclinação a uma gama de intensidades de corrente. Execute esta entre 20 mA a 100 mA. Em seguida, definir a intensidade de estimulação para cada entrada para se obter 40% da inclinação máxima fEPSP. Manter esta constante ao longo da experiência. </li><li> Após 15-20 minutos, começar a gravar a linha de base. Monitorar o fEPSP inclinação de perto durante este período e repor a intensidade do estímulo se a inclinação varia mais de 10% do valor definido e iniciar uma nova linha de base. Grave, pelo menos, 30 min ou 1 hr linha de base estável antes de prosseguir. NOTA: Para o teste ou a estimulação da linha de base, usamos quatro varreduras de 0,2 Hz bifásicos, pulsos de corrente constante (0,1 ms por polaridade) dadas a cada 5 minutos. Uma inclinação média destas quatro respostas é então considerado como uma repetição. Os sinais são filtrados e amplificados por um amplificador diferencial, digitalizadas utilizando um conversor analógico-para-digital e monitorizada on-line com o software feito por encomenda. </li></ol></li><li> A indução da LTP / LTD utilizando os protocolos de estimulação NOTA: Ambos LTP e LTD foram classificados como precoce e tardia-LTP / LTD com base nos requisitos de síntese de proteínas; a tradução exigindo último e / ou transcrição para sua manutenção tarde [para revisão ver 4]. Uma variedade de paradigmas de estimulação eléctrica pode specifically induzir as diferentes formas de LTP e LTD. <ol><li> WTET: 100 Hz, 21 bifásicos pulsos de corrente constante (0,2 ms por fase). </li><li> STET: Três explosões de 100 pulsos por um segundo (100 Hz) a cada 10 minutos (Pulse largura de 0,2 ms por fase). </li><li> 900 rajadas mais de 15 minutos de duração. 1 explosão consiste de 3 impulsos de largura (0,2 mseg) com um intervalo interpulso de 50 ms (20 Hz). O intervalo inter explosão é de 1 seg (número total de pulsos 2.700). </li></ol></li></ol> 5. Limpeza da Câmara Slice e Perfusão Sistema <ol><li> Após a gravação terminar, recolher as fatias do hipocampo para posterior análise bioquímica ou então descartar adequadamente. Desligue o abastecimento de carbogênio e controlador de temperatura. Lave o bubbler carbogénio em água destilada. </li><li> Limpe o líquido cuidadosamente com uma escova e água destilada. Lava-se a sonda para 15-20 min com água destilada a um caudal mais elevado. Uma vez em 3-4 dias, alterar a água destilada nocompartimento inferior da câmara, e também limpos regularmente com a câmara de solução de peróxido de hidrogénio a 3% para evitar o crescimento de fungos. </li></ol>

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</ol>

O acesso aberto para este artigo vídeo é patrocinado pela Cerebos Pacific Limited.

Fatia hipocampal aguda é um excelente sistema modelo para o estudo da LTP e outros processos de plasticidade funcionais, tais como STC e captura-cruzada. Ela conserva grande parte da rede estrutural laminar dos circuitos do hipocampo, permite que os locais precisos de eléctrodos e oferece ao lado, uma plataforma aberta para manipulação neurofarmacológica rápida sem a barreira sangue-cérebro. Este artigo descreve a metodologia para a preparação de fatias do hipocampo agudas viáveis ​​de ratos adultos jovens e usá-los para investigar STC e cross-tagging. Pesquisas anteriores já haviam enfatizado que o sexo ea idade dos animais são factores importantes a considerar para uso em estudos de eletrofisiologia. 27,28 Portanto animais jovens adultos com funções de receptores adultos plenamente expressos (ratos Wistar machos com idade entre 5-7 semanas) são utilizados. 23 Assimetrias nas ligações entre o hipocampo esquerdo e direito foram observados em roedores e 29grandes diferenças na expressão do receptor de NMDA têm sido relatados como bem 34. Usámos o hipocampo direito, a fim de ser compatível com os nossos estudos anteriores LTP. 23,32 No entanto, qualquer um dos hipocampos pode ser usado contanto que a consistência é mantida. Como em qualquer protocolo, é muito crucial para realizar o isolamento e corte de procedimentos rapidamente, mas tomando cuidado para que o tecido não é esticado, danificado, seja seco ou hipóxica. As variações do pH, da temperatura e da composição iónica das soluções podem ter um efeito profundo sobre a viabilidade das fatias e os resultados. Assim tais variações devem ser evitados. Tem sido observado que a libertação de glutamato dependente do receptor de cálcio que ocorre durante as etapas de preparação pode afectar irreversivelmente a síntese de proteína no tecido nervoso 35,36, 37. Usando máquinas de corte de tecido manuais pode ajudar a minimizar este, permitindo que o processo esteja concluído muito rapidamente em comparação com VIbraslicers. No entanto, muitos laboratórios também utilizam efetivamente vibraslicers com as precauções necessárias para preservar a viabilidade fatia. Outro fator importante a considerar é o longo período de incubação antes do início dos experimentos. Isto foi anotado para ser realmente crucial para alcançar a estabilidade em níveis estadual e ativação da quinase metabólicas em fatias após a perturbação causada durante a preparação 23. Essa estabilidade é necessária para a consistência em gravações a longo prazo. Nós re-enfatizar nesta observação e sugerir as horas de incubação longo de cerca de 3 horas. Uma variedade de parâmetros de estimulação são conhecidos por induzir LTP, mas os mecanismos moleculares induzidos em cada caso pode não ser o mesmo (para revisão ver 38). Este pode influenciar a durabilidade e outras características da LTP, que, por sua vez, pode afectar os resultados de experiências de marcação e de captura sinápticos. Por isso, é importante validar os paradigmas de estimulação e característicasda LTP evocados sob as condições do laboratório que realiza e manter a consistência. Nós geralmente não consideram experiências com grandes rajadas de fibra pré-sinápticos e com fEPSPs máximos inferiores a 0,5 mV e as experiências que envolvem mudanças substanciais no vôlei de fibra durante as gravações também são rejeitadas. Além disso, durante a realização de duas ou três vias vias experiências, é importante para assegurar a independência via. Esta pode ser levada a cabo com um protocolo de facilitação de pulso emparelhado-28. Uma desvantagem dos sistemas de registro de interface é a formação de gotículas de condensação sobre os eletrodos durante as horas de gravações longas, devido às diferenças de temperatura e umidade entre a câmara e os arredores. Estas gotículas devem ser cuidadosamente transferidas ao longo do tempo. Caso contrário, as gotículas podem escorrer para as fatias e causar perturbação ou mesmo perda de sinais. Costumamos fazer face a este by habilmente secar as gotículas guiadas sob o microscópio usando um pavio papel de filtro fino, sem tocar os eletrodos. No entanto, a melhor solução seria a utilização de um sistema de aquecimento centralizado, tais como o sistema de ETC desenvolvido por investigadores da Universidade de Edimburgo. Em uma nota final, uma variedade de metodologias existem nos laboratórios de todo o mundo que são utilizados para a preparação de fatias do hipocampo para diferentes fins experimentais. Cada um dos procedimento oferece algumas vantagens sobre o outro. Uma das necessidades para otimizar cuidadosamente os detalhes minuciosos de o protocolo de acordo com o objectivo da experiência. Esperamos que este artigo ajuda a melhorar alguns aspectos da metodologia para o estudo de processos atrasados ​​associativa como STC e-captura cruz.

A codificação e o armazenamento de informações no cérebro ainda continuam sendo o desafio mais significativo e intensamente perseguido na neurociência. Ao longo dos anos, a potenciação de longo prazo (LTP) e a depressão de longo prazo (LTD) emergiram como os principais correlatos celulares da memória1,2. Essas mudanças dependentes da atividade, que exibem especificidade e associatividade de entrada, resultam na estabilização de traços de memória nas redes neuronais 1,3,4. A manutenção das duas formas de plasticidade sináptica requer a síntese de produtos relacionados à plasticidade (PRPs)5-10. A especificidade da sinapse que envolve a interação de proteínas recém-sintetizadas apenas com sinapses ativadas específicas que expressam LTP ou LTD é crítica para a memória. Essa especificidade é explicada pelo conceito de 'Marcação e Captura Sináptica' (STC), onde os PRPs interagem com sinapses 'marcadas' recentemente ativas11,12. O processo STC oferece uma estrutura para propriedades associativas de memórias no nível celular. Ele nos fornece uma base conceitual de como as formas de plasticidade de curto prazo são transformadas em formas duradouras de plasticidade de maneira associativa e dependente do tempo13.
Durante o processo de STC, uma forte tetanização em uma entrada que leva à LTP tardia dependente da síntese de proteínas, resulta no reforço de uma LTP inicial independente da síntese proteica induzida em outra entrada independente para a mesma população de neurônios em uma persistente13. A configuração de uma marca sináptica local por uma atividade neural transitória e a síntese dos PRPs difusíveis pela forte atividade neural são os dois principais eventos durante o STC13,14. A captura dos PRPs pelas sinapses 'marcadas' recentemente potencializadas é fundamental para a manutenção da potenciação de longo prazo. Muitos estudos têm sido feitos para confirmar a existência do fenômenoSTC15-17 e identificar os candidatos 'tags'18 e 'PRPs'19. Proteína quinase II dependente de cálcio/calmodulina (CaMKII) e quinase regulada por sinal extracelular1/2 (ERK1/2); CaMKIV, proteína quinase M (PKM) e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) são algumas das moléculas candidatas a 'tag' e 'PRP', respectivamente19-21. O modelo de marcação sináptica foi expandido para incluir as interações associativas positivas entre LTP e LTD - a "marcação cruzada sináptica" 22 . Na marcação cruzada sináptica, um LTP / LTD tardio em uma entrada sináptica transforma o LTP / LTP inicial independente da síntese de proteína oposta em uma entrada independente em sua forma duradoura ou vice-versa22. 
A preparação do corte hipocampal é o modelo mais utilizado nos estudos de plasticidade sináptica de longo prazo23,24. Grande parte do entendimento sobre os conceitos de marcação sináptica e marcação cruzada surge dos estudos feitos na região CA1 do hipocampo e, devido à complexidade técnica, muitos dos laboratórios ainda não conseguem estudar esses processos. Condições experimentais para a preparação de fatias de hipocampo de ratos e o registro de LTP / LTD tardio estável por horas prolongadas são extremamente importantes para estudar a marcação sináptica / marcação cruzada23 , 25 , 26 . Este artigo descreve os procedimentos experimentais detalhados para estudar processos de plasticidade de longo prazo, como STC e marcação cruzada nos neurônios piramidais CA1 usando registros estáveis e de longo prazo de potencial de campo de fatias agudas de hipocampo de ratos.

<table><tbody><tr><td>I. Ferramentas</td><td></td><td></td><td></td>de dissecação</tr><tr><td>1. Tesoura de bandagem</td><td>KLS Martin, Alemanha</td><td>21-195-23-07</td><td></td></tr><tr><td></td><td>B-Braun/Aesculap, Alemanha</td><td>LX553R</td><td></td></tr><tr><td>2. Tesoura de íris</td><td>B-Braun / Aesculap, Alemanha</td><td>BC140R,</td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td>BC100R</td><td></td></tr><tr><td>3. Bone rongeur</td><td>World Precision Instruments (WPI), Alemanha</td><td>14089-G</td><td></td></tr><tr><td>4. Scalpel</td><td>World Precision Instruments (WPI), Alemanha;</td><td>500236-G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>B-Braun/Aesculap, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>BB73</td><td></td></tr><tr><td>5. Lâmina de bisturi # 11</td><td>B-Braun / Aesculap, Alemanha</td><td>BB511</td><td></td></tr><tr><td>6. Desincrustador de foice</td><td>KLS Martin, Alemanha</td><td>38-685-00</td><td></td></tr><tr><td>7. Pinça angular</td><td>B-Braun/Aesculap, Alemanha</td><td>BD321R</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8. Câmara de anestesia / indução</td><td>MIP Anesthesia Technologies (agora, Patterson Scientific), Oregon</td><td>AS-01-0530-LG</td><td></td></tr><tr><td>II. Produtos químicos</td><td></td><td></td><td></td>componentes da ACSF</tr><tr><td>1. Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>2. Cloreto de potássio (KCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>3. Sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4.7H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>4. Cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2.2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>5. Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>6. Bicarbonato de sódio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>7. D-Glicose anidra (C6H12O6)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>III. Instrumentos</td><td></td><td></td><td></td>de eletrofisiologia</tr><tr><td>1. Microscópio</td><td>Olympus,</td><td>Japão Modelo SZ61</td><td></td></tr><tr><td>2. Controlador de temperatura</td><td>Scientific Systems Design Inc. Canadá</td><td>PTC03</td><td></td></tr><tr><td>3. Amplificador CA Diferencial</td><td>Sistemas AM, EUA</td><td>Modelo 1700</td><td></td></tr><tr><td>4. Sistemas AM de estimulador de pulso isolado</td><td>, EUA</td><td>Modelo 2100</td><td></td></tr><tr><td>5. Osciloscópio</td><td>Rhode & Schwarz</td><td>HM0722</td><td></td></tr><tr><td>6. Conversor Digital-Analógico</td><td>Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, Reino Unido</td><td>CED-Power 1401-3</td><td></td></tr><tr><td>7. Interface Brain Slice</td><td>Chamber Scientific Systems Design Inc. Canadá</td><td>BSC01</td><td></td></tr><tr><td>8. Bomba de tubulação</td><td>Ismatec, Idex Health & Ciência, Alemanha</td><td>REGLO-Analog</td><td></td></tr><tr><td>9. Medidor de Vazão Carbogen</td><td>Cole-Parmer</td><td>03220-44</td><td></td></tr><tr><td>10. Iluminador de Luz de Fibra</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>Fiber Lite MI-150</td><td></td></tr><tr><td>11. Micromanipuladores</td><td>Marzhauser Wetzlar, Alemanha</td><td>00-42-101-0000 (MM-33)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>00-42-102-0000 (MM-32)</td><td></td></tr></tbody></table>

investigação de synaptic tagging / captura e-captura cruz usando aguda fatias do hipocampo de roedores

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

A marcação e captura sináptica (STC) e a marcação cruzada são dois mecanismos importantes no nível celular que explicam como a especificidade e a associatividade das sinapses são alcançadas nos neurônios dentro de um período de tempo específico. Esses processos relacionados à plasticidade de longo prazo são os principais modelos candidatos para estudar a base da formação e persistência da memória no nível celular. Tanto o STC quanto a marcação cruzada envolvem dois processos seriais: (1) configuração da marca sináptica como desencadeada por um padrão específico de estimulação e (2) captura sináptica, pela qual a marca sináptica interage com proteínas relacionadas à plasticidade (PRPs) recém-sintetizadas. Grande parte do entendimento sobre os conceitos de STC e cross-tagging decorre dos estudos realizados na região CA1 do hipocampo e devido à complexidade técnica muitos dos laboratórios ainda não conseguem estudar esses processos. As condições experimentais para a preparação de fatias do hipocampo e o registro de LTP/LTD tardio estável são extremamente importantes para estudar a marcação sináptica/marcação cruzada. Este artigo em vídeo descreve os procedimentos experimentais para estudar processos de plasticidade de longo prazo, como STC e marcação cruzada nos neurônios piramidais CA1 usando gravações estáveis e de longo prazo de potencial de campo de fatias agudas de hipocampo de ratos.

A metodologia descrita foi utilizada para estudar formas duradouras de LTP / LTD e suas interações associativas, tais como marcação sináptica e-captura cruzamento fatias do hipocampo agudos de ratos adultos. 23 Esta técnica tem se mostrado eficaz para experimentos com ambos os ratos (Wistar) e uma variedade de estirpes de rato 30,31. A metodologia tem sido utilizada com sucesso para gravações LTP estável de até 8-12 h. 32 O &#39;tag&#39; definido pelo tetanização fraco de uma entrada (S1) capta o induzido pela forte tetanização de outra entrada independente, mas sobreposição »PPR &#39;(S2; Figura 3B, círculos preenchidos) transformando assim a forma de outra forma decadente de LTP (precoce -LTP) em S1 em uma longa duração um (Figura 3B, círculos abertos) (Para efeito de comparação de early-LTP induzida por WTET ver 20,33). Os PPR capturados pelo fracotag conjunto tetanização não precisa vir necessariamente do induzida pela STET de fim de LTP, mas também pode ser fornecida pelo induzida por SLFS late-LTD. Este tipo de interação positiva entre associativa LTP e LTD é referido como &#39;cruz-tagging / capture &quot;. O induzida por WTET early-LTP em S1 fica reforçada a fim de LTP (Figura 3C, círculos abertos), capturando os PPRs fornecidos pelo induzida por SLFS late-LTD em S2 (Figura 3C, círculos preenchidos). Estatisticamente significativa potenciação ou depressão foi mantida em S1 e S2, em ambos os casos, quando comparada com a sua própria linha de base (teste de Wilcoxon; P &lt;0,05). Para a interacção Tag-PRP a ocorrer, a ordem temporal dos dois eventos (fraco-antes-forte /-forte antes-fraco) não é crucial, desde que a janela de tempo entre os dois eventos permanece dentro da gama de 30-60 minutos. Seria sensato para incluir um terceiro, independente, mas a sobreposição sináptica emcolocar e usá-lo como um controle de linha de base para monitorar a estabilidade das gravações. Os protocolos de estimulação elétrica utilizados para induzir formas precoce e tardia da LTP / LTD devem ser validados em experimentos de entrada única para a consistência e confiabilidade antes de usá-los em experimentos STC. Também gostaríamos de enfatizar a importância da metodologia de preparação fatia descrito no protocolo uma vez que o sucesso dessas experiências depende muito da qualidade das fatias. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53008/53008fig1.jpg" /> Figura 1. (A) Ferramentas utilizadas na dissecção das hipocampo: (a) Bandage Scissors (b) Iris tesoura (c) rongeur óssea (d) espátula fina, (e) número 11 Scalpel (f) scaler Sickle (g) Macio -bristle pincel (h) plástico Pasteur pipeta (i) papel de filtro (85 milímetros) (j) papel de filtro (30 mm) (k) taças de vidro (l) blocos de refrigeração de alumínio para caber placa de petri e taçasprato (m) Petri. (B) cortador de tecidos Manual. (a) Platform (b) Corte braço com lâmina titular (c) Vernier micrómetros, resolução de 10 microns. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53008/53008fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53008/53008fig2.jpg" /> Figura 2. Electrofisiologia set-up para gravações potencial de campo consiste em (a) estimuladores (b) um amplificador diferencial (c) um análogo-digital conversor (d) osciloscópio (e) computador com software de aquisição (f) vibratória table-top resistente (g) microscópio com&gt; 4x ampliação (h) interface cérebro-slice de câmara (i) um sistema de perfusão para ACSF e carbogénio alimentação (j) o controlador de temperatura (k) uma fonte de iluminação (l) manipuladores com porta-eletrodos. (B) de interface cérebro-slicecâmara. (C) e (D) fatias do hipocampo na câmara de interface eletrodo de aço. (E) inoxidável selado em um capilar de vidro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53008/53008fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53008/53008fig3.jpg" /> Figura 3. (A) Representação esquemática de uma fatia do eléctrodo e localização transversal do hipocampo para gravação potencial de campo: Nesta representação, dois eléctrodos estimulantes (S1 e S2) estão posicionados no stratum radiatum da região CA1 para estimular dois independente mas sobreposição entradas sinápticas Onto neurônios piramidais CA1. Dois eletrodos de registro extracelular, uma para gravar campo-EPSP (potencial excitatório pós-sináptico) do compartimento dendrítica apical e outro para gravar somática pico população a partir da célula piramidalorganismos, estão localizados no stratum radiatum e estrato pyramidale respectivamente. CA1- cornu Ammonis região 1, CA3- cornu Ammonis região 3, giro denteado DG-, fibras colaterais SC- Schaffer, S1- estimulando eletrodo 1, eletrodo S2 estimulante 2. (B) Fraco antes forte paradigma para estudar STC: tetanização Fraco (WTET) é aplicada a S1 (círculos abertos) para a indução de LTP-precoce seguido de tetanização forte (STET) de S2 (círculos a cheio) aos 30 min para induzir a fim de LTP. A-LTP no início S1 fica reforçada a fim de LTP mostrando a marcação e capturar a interação (n = 6) (C) Fraco antes forte paradigma para estudar cruz-tagging:. Early-LTP é induzida por WTET em S1 (círculos abertos), seguida pela indução de tarde em LTD-S2 (círculos a cheio) usando SLFS após 30 min. Em S1, o início de LTP é transformado em late-LTP duradoura 6 horas mostrando cross-tagging e captura (n = 6). Seta simples representa tetanização fraco aplicado para induzir early-LTP. Triplet de flechas representatetanização forte para induzir late-LTP. A seta a tracejado representa o ponto de tempo em que SLFS foi aplicado à entrada sináptica representante para induzir a fim de LTD. As barras de erro indicam SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53008/53008fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este artigo em vídeo descreve procedimentos experimentais para estudar a plasticidade de longo prazo e seus processos associativos, como marcação sináptica, captura e marcação cruzada nos neurônios piramidais CA1 usando fatias agudas do hipocampo de roedores.

Investigação de Synaptic Tagging / Captura e-captura Cruz usando aguda fatias do hipocampo de roedores

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar a plasticidade de longo prazo e seus processos associativos, como marcação sináptica, captura e marcação cruzada, em neurônios paramentais do CA um, utilizando fatias hipocampais Q de roedores. Isso é realizado primeiramente pela dissecação do cérebro e rápida isolamento do hipocampo em fluido cerebroespinhal artificial oxigenado e frio. O segundo passo consiste em preparar fatias hipocampais agudas utilizando um fatiador manual de tecidos e incubá-las em uma câmara de interface.A seguir, dois eletrodos estimulantes e dois eletrodos de gravação são posicionados na região CA1 para registrar respostas de EPSP de campo e picos de população provenientes de duas entradas sinápticas. O passo final consiste em induzir uma forma transitória de plasticidade em uma entrada sináptica e uma forma persistente de plasticidade em outra entrada dentro de uma janela de tempo específica. Por fim, as respostas de EPSP de campo de ambas as entradas são registradas por durações prolongadas para investigar os mecanismos de marcação sináptica, captura e captura cruzada.A marcação e captura sináptica fornece uma base conceitual para a transformação da memória de curto prazo em memória de longo prazo dentro de um período de tempo específico. A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos experimentais são difíceis de aprender, já que envolvem estimulação e registro de múltiplas entradas sinápticas. O procedimento será demonstrado por Mahesh Shira, Machete e Maima Sharma, estudantes de pós-graduação do meu laboratório.Para iniciar este procedimento, prepare o LCR A e borbulhe com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Encha a parte inferior da câmara de interface com água destilada até cerca de 70% da sua capacidade. Em seguida, ligue o controlador de temperatura pré-ajustado para 32 graus Celsius.Em seguida, lave a câmara superior por 10 a 15 minutos, passando água destilada pela tubulação de entrada em alta vazão, antes de mudar para o LCR A a uma vazão de um mililitro por minuto. Em seguida, coloque uma tela na câmara superior para fornecer uma superfície de repouso para as fatias. Inicie o carbogênio na câmara inferior e mergulhe a tubulação de entrada no LCR A que está sendo continuamente carbogenado.Permita 20 minutos para que o LCR A seja saturado com carbogênio e preencha a câmara superior. Nesta etapa, fixe uma lâmina de barbear no cortador de tecidos e certifique-se de que a borda de corte esteja alinhada uniformemente. Teste cortando um pequeno papel filtro para garantir que a lâmina esteja firmemente presa.Em seguida, posicione o micrômetro vernier deslizante em sua posição inicial. Agora, obtenha a cabeça de uma rata eutanasiada e, com uma tesoura de íris, faça um corte através do crânio posterior para remover o bulbo raquidiano. Em seguida, faça uma pequena incisão ao longo do lado direito do crânio e uma incisão mais longa no lado esquerdo.Remova cuidadosamente o crânio com uma pinça óssea começando pelo lado esquerdo e seguindo até o lado direito do crânio. Para expor o córtex e a fina camada de dura que o recobre, remova cuidadosamente a dura com uma espátula fina e, em seguida, remova as placas frontais com a pinça óssea. Posteriormente, remova a dura remanescente especificamente na junção entre o córtex e o cerebelo com a extremidade plana de uma espátula, evitando danificar o cérebro mantendo a pressão para cima.Usando a espátula, retire suavemente o cérebro e coloque-o em uma placa de Petri sobre um bloco refrigerador de alumínio contendo A CSF frio e carbonatado para isolar o hipocampo. Com um bisturi número 11, faça um corte reto para remover o cerebelo e outro corte para remover um quarto da porção anterior do cérebro. Em seguida, faça um corte sagital superficial ao longo da linha média. A partir da linha média.Remova cuidadosamente o córtex com o escalpelador em forma de foice para expor o hipocampo dorsal. Em seguida, remova a camada de córtex acima do hipocampo. Faça um pequeno corte no corpo caloso do hipocampo.Remova suavemente o hipocampo com o escalpelete em forma de foice, começando pela extremidade dorsal utilizando movimentos de rolagem. Em seguida, remova qualquer córtex e tecidos conjuntivos ao redor do hipocampo isolado usando a extremidade curva do escalpelete em forma de foice. Para cortar o tecido hipocampal, coloque um pedaço de papel filtro Watman de 30 milímetros embebido em LCR sobre a plataforma de corte do cortador manual.Transfira o tecido hipocampal para o papel filtro. Usando a extremidade plana do bisturi em forma de foice, mova o papel filtro para alinhar o hipocampo em uma orientação adequada em relação à lâmina do fatiador, de modo que o hipocampo seja seccionado em um ângulo de aproximadamente 70 graus em relação ao fia. Em seguida, remova a solução em excesso ao redor do tecido hipocampal.Com um papel-filtro dobrado, seccione o hipocampo transversalmente e descarte o tecido da extremidade do hipocampo onde a morfologia do corte não é clara. Em seguida, seccione o tecido restante em fatias de 400 micrômetros de espessura, ajustando o micrômetro vernier após cada rodada de corte. Após cada corte, transfira cuidadosamente a fatia da lâmina usando uma escova com cerdas macias para um béquer pequeno contendo solução salina carbonatada (A CSF) fria.Em seguida, transfira cuidadosamente as fatias para a tela na câmara de fatias usando uma pipeta de plástico Pasteur limpa. Com uma ponta larga, ajuste cuidadosamente a posição das fatias de modo a facilitar a localização do eletrodo e a verificação da gravação, verificando se as fatias estão suficientemente rodeadas por uma camada de A CSF, mas sem ficar completamente submersas. Depois disso, cubra a câmara e incube as fatias por duas a três horas em experimentos de marcação e captura sináptica.Sob o microscópio, posicione os dois eletrodos estimuladores na camada radiatum do hipocampo CA1 para estimular as fibras colaterais de Schaffer e um eletrodo de registro na região dendrítica apical do CA1, localizado a meia distância entre os eletrodos estimuladores. Para registrar as respostas F-E-P-S-P, coloque outro eletrodo de registro na camada stratum pyramidale. FAÇA a gravação do potencial de ação populacional.Quando todos os eletrodos tocarem o corte, aplique uma estimulação de teste para garantir que um sinal adequado de PEPF possa ser obtido em ambas as entradas. Uma vez obtido um sinal adequado de PEPF, abaixe cuidadosamente os eletrodos cerca de 200 mícrons adicionais utilizando os botões de movimento fino dos manipuladores. Em seguida, aguarde 20 minutos para que o corte se recupere.Após isso, determine a relação entrada-saída mediante a medição da inclinação do PEPS de campo em uma faixa de intensidades de corrente de 20 microampères a 100 microampères. Em seguida, para cada entrada, defina a intensidade de estimulação que evoca 40% da inclinação máxima do PEPS de campo como estímulo constante ao longo do experimento. Após 15 a 20 minutos, comece a gravar a linha de base, registrando uma linha de base estável de pelo menos 30 a 60 minutos antes da indução de LTP-LTD em uma entrada; induza um LTP precoce utilizando um protocolo fraco de tetanização consistindo em uma única estimulação de alta frequência.Enquanto a outra entrada continua registrando a linha de base por 30 minutos após a indução de LTP precoce, induza um LTP tardio na entrada S dois, utilizando um protocolo tetânico forte que envolva estimulação de alta frequência repetida com um intervalo inter-treino de 10 minutos. Em seguida, registre as respostas do PEPS de campo por durações prolongadas para revelar a transformação do LTP precoce na entrada S um em LTP tardio por meio da marcação e captura sináptica. De forma semelhante, em um experimento de captura cruzada, primeiro induza um LTP precoce em uma entrada, seguido, 30 minutos depois, pela indução de LTD tardio em outra entrada, utilizando um protocolo forte de estimulação de baixa frequência, consistindo em 900 rajadas ao longo de um período de 15 minutos.Em seguida, registre as respostas do PEPS de campo por durações prolongadas para revelar a transformação do PLT precoce na entrada S1 em PLT tardio por meio da captura cruzada. Nesta representação, dois eletrodos estimuladores são posicionados na camada radiata do hipocampo CA1 para estimular duas entradas sinápticas independentes, mas sobrepostas. Sobre os neurônios paramedianos do CA1, dois eletrodos de registro extracelular.Um para registrar F-E-P-S-P do compartimento dendrítico apical. E outro para registrar o potencial de ação populacional somático a partir dos corpos celulares parametais localizados no estrato radiatum e no estrato para, respectivamente. Esta figura mostra a semana anterior ao paradigma forte para estudar a marcação e captura sinápticas.Aplica-se um tetanismo fraco em S um para induzir a PLT precoce, seguido por um tetanismo forte em S dois após 30 minutos para induzir a PLT tardia, e esta figura mostra o período anterior ao paradigma forte para estudar a marcação cruzada. A PLT precoce é induzida por tetanismo fraco em S um, seguida pela indução da DLT tardia em S dois utilizando um protocolo de estimulação de baixa frequência intensa. Após 30 minutos em S um, a PLT precoce é transformada em PLT tardia que dura seis horas, demonstrando marcação cruzada e captura.Uma vez dominada, essa técnica de dissecação e preparo de cortes pode ser realizada rapidamente em três a cinco minutos. Assim, a viabilidade dos cortes pode ser preservada para registros de longa duração. Utilizando este método, pode-se também testar os efeitos de diferentes agentes farmacológicos sobre os processos de marcação e captura sináptica.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como conduzir experimentos de plasticidade funcional de longo prazo e dos processos de marcação e captura sinápticas.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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