Investigação de Synaptic Tagging / Captura e-captura Cruz usando aguda fatias do hipocampo de roedores

O objetivo geral deste procedimento é estudar a plasticidade de longo prazo e seus processos associativos, como marcação sináptica, captura e marcação cruzada nos neurônios parametálicos CA um usando fatias Q do hipocampo de roedores. Isso é feito primeiro dissecando o cérebro e isolando rapidamente o hipocampo em líquido cefalorraquidiano artificial oxigenado frio. O segundo passo é preparar fatias agudas do hipocampo usando um cortador manual de tecidos e incubá-las em uma câmara de interface.

Em seguida, dois eletrodos estimulantes e dois eletrodos de registro são colocados na região CA uma para registrar EPSP de campo e respostas de pico populacional de duas entradas sinápticas. A etapa final é induzir uma forma transitória de plasticidade em uma entrada sináptica e uma forma persistente de plasticidade em outra entrada dentro de uma janela de tempo específica. Em última análise, as respostas EPSP de campo de ambas as entradas são registradas por períodos prolongados para investigar a captura de marcação sináptica e os mecanismos de captura cruzada.

A marcação e captura sináptica fornece uma base conceitual de como a memória de curto prazo se transforma em memória de longo prazo dentro de um determinado período de tempo. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas experimentais são difíceis de aprender porque envolvem estimulação e registro de múltiplas entradas sinápticas. Demonstrando o procedimento estarão Mahesh Shira, machete e maima Sharma alunos de pós-graduação do meu laboratório.

Para iniciar este procedimento, prepare um LCR e borbulhe-o com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Encha o fundo da câmara de interface com água destilada até cerca de 70% de sua capacidade. Em seguida, ligue o controlador de temperatura predefinido para 32 graus Celsius.

Em seguida, lave a câmara superior por 10 a 15 minutos, passando água destilada pela tubulação de entrada a uma alta taxa de fluxo antes de mudar para A CSF a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto. Em seguida, coloque uma rede na câmara superior para fornecer uma superfície de descanso para as fatias. Inicie o carbogênio na câmara inferior, mergulhe a tubulação de entrada no A CSF que está sendo continuamente carbogênio.

Aguarde 20 minutos para que o A CSF seja saturado com carbogênio e encha a câmara superior. Nesta etapa, monte uma lâmina de barbear no picador de tecidos e certifique-se de que a aresta de corte esteja alinhada uniformemente. Teste cortando um pequeno papel de filtro para garantir que a lâmina esteja firmemente presa.

Em seguida, coloque o micrômetro vernier deslizante em sua posição inicial. Agora obtenha a cabeça de um rato sacrificado e, usando uma tesoura de íris, faça um corte na parte posterior do crânio para remover o tronco cerebral. Em seguida, faça uma pequena incisão ao longo do lado direito do crânio e uma incisão mais longa à esquerda.

Remova cuidadosamente o crânio com um UR ósseo começando do lado esquerdo e indo para o lado direito do crânio. Para revelar o córtex e a fina camada de dura-máter que o cobre, remova cuidadosamente a dura-máter com uma espátula fina e, em seguida, remova as placas frontais com o osso. Posteriormente, remova a dura-máter restante especificamente na junção entre o córtex e o cerebelo com a extremidade plana de uma espátula e evite danificar o cérebro mantendo a pressão para cima.

Usando a espátula, coloque suavemente o cérebro em uma placa de Petri em um bloco de resfriamento de alumínio cheio de A CSF frio e carbonatado para isolar o hipocampo usando um bisturi número 11, faça um corte reto para remover o cerebelo e outro corte para remover um quarto da porção anterior do cérebro. Em seguida, faça um corte sagital raso ao longo da linha média. A partir da linha média.

Remova cuidadosamente o córtex com o raspador de foice para revelar o hipocampo dorsal. Depois disso, remova a camada do córtex acima do hipocampo. Faça um pequeno corte na comissura do hipocampo.

Remova suavemente o hipocampo com o raspador de foice, começando pela extremidade dorsal usando movimentos de rolamento. Posteriormente, remova qualquer córtex e tecidos conjuntivos ao redor do hipocampo isolado usando a extremidade curva do raspador de foice. Para fatiar o tecido do hipocampo, coloque um pedaço de papel de filtro watman de 30 milímetros embebido em LCR no estágio de fatiamento do fatiador manual.

Transfira o tecido do hipocampo para o papel de filtro. Usando a extremidade plana do scalor da foice, mova o papel de filtro para alinhar o hipocampo em uma orientação adequada em relação à lâmina do fatiador, de modo que o hipocampo seja cortado em um ângulo de cerca de 70 graus em relação à fia. Em seguida, seque o excesso de solução ao redor do tecido do hipocampo.

Com um papel de filtro dobrado, corte o hipocampo, transversalmente, e descarte o tecido da extremidade do hipocampo, onde a morfologia do corte não é clara. Em seguida, corte o tecido restante em fatias de 400 mícrons de espessura, ajustando o micrômetro vernier após cada rodada de corte. Após cada corte, transfira a fatia suavemente da lâmina usando uma escova com cerdas macias para um pequeno béquer cheio de A CSF gaseificado a frio.

Em seguida, transfira as fatias suavemente para a rede na câmara de fatias usando uma pipeta de plástico limpa. Com uma ponta larga, ajuste cuidadosamente a posição das fatias de uma maneira que facilite a localização do eletrodo e a verificação do registro para garantir que as fatias estejam suficientemente cercadas por uma camada de A CSF, mas não completamente submersas. Depois disso, cubra a câmara e incube as fatias por duas a três horas em experimentos de marcação e captura sináptica.

Sob o microscópio posicione os dois eletrodos estimulantes no estrato do átomo de rádio do CA uma região para estimular as fibras colaterais de Schaffer e ao registrar o eletrodo na região dendrítica apical de ca um a meio caminho entre os eletrodos de estimulação. Para registrar as respostas F-E-P-S-P, coloque outro eletrodo de registro no estrato parid. Camada DO para registrar o pico da população.

Quando todos os eletrodos tocarem a fatia, forneça uma estimulação de teste para garantir que um sinal EPSP de campo adequado possa ser obtido em ambas as entradas. Uma vez obtido um sinal F-E-P-S-P adequado, abaixe cuidadosamente os eletrodos cerca de 200 mícrons usando os botões de movimento fino dos manipuladores. Em seguida, aguarde 20 minutos para que a fatia se recupere.

Depois disso, determine a relação de entrada e saída medindo a inclinação do campo EPSP em uma faixa de intensidades de corrente de 20 microamperes a 100 microamperes. Em seguida, para cada entrada, defina a intensidade de estimulação que evoca 40% da inclinação máxima do campo EPSP como os estímulos constantes ao longo do experimento. Após 15 a 20 minutos, comece a registrar a linha de base registre uma linha de base estável de pelo menos 30 a 60 minutos antes da indução LTP em uma entrada, induza uma LTP precoce usando um protocolo de tetina fraco que consiste em uma única estimulação de alta frequência.

Enquanto a outra entrada continua a registrar a linha de base 30 minutos após a indução inicial da LTP, induza uma LTP tardia na entrada S dois, usando um protocolo de tetina forte envolvendo estimulação repetida de alta frequência com um intervalo de 10 minutos. Em seguida, registre as respostas EPSP de campo para durações estendidas para revelar a transformação do LTP inicial na entrada S um para o LTP tardio pela marcação e captura sináptica. Da mesma forma, em um experimento de captura cruzada, primeiro induza um LTP precoce e uma entrada seguida 30 minutos depois pela indução tardia de LTD em outra entrada, usando um protocolo de estimulação de baixa frequência forte que consiste em 900 rajadas em uma duração de 15 minutos.

Em seguida, registre as respostas EPSP de campo por períodos prolongados para revelar a transformação do LTP inicial na entrada S um para o LTP tardio pela captura cruzada. Nesta representação, dois eletrodos estimulantes são posicionados no átomo de raio do estrato da região CA um para estimular duas entradas sinápticas independentes, mas sobrepostas. Em CA um neurônios parametálicos dois eletrodos de registro extracelular.

Um para registrar F-E-P-S-P do compartimento dendrítico apical. E outro para registrar o pico da população somática dos corpos celulares parametálicos estão localizados no estrato átomo de rádio e no estrato para, respectivamente. Esta figura mostra a semana anterior ao forte paradigma para estudar a marcação e captura sináptica.

A tetina fraca é aplicada a S um para induzir LTP precoce, seguida por tetina forte de S dois aos 30 minutos para induzir LTP tardia, e esta figura mostra a semana anterior ao paradigma forte para estudar a marcação cruzada. A LTP precoce é induzida por tetina fraca em S um, seguida pela indução de LTD tardia em S dois usando um protocolo de estimulação forte de baixa frequência. Após 30 minutos em S um, o LTP inicial é transformado em LTP tardio com duração de seis horas, mostrando marcação cruzada e captura.

Uma vez dominada, esta técnica de dissecção e preparação de fatias pode ser realizada muito rapidamente dentro de três a cinco minutos. Assim, a viabilidade das fatias pode ser preservada para gravações de longo prazo. Usando este método, pode-se também testar os efeitos de diferentes agentes farmacológicos nos processos de marcação e captura sináptica.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como conduzir experimentos de plasticidade funcional de longo prazo e os processos de marcação e captura sináptica.