Investigação de Synaptic Tagging / Captura e-captura Cruz usando aguda fatias do hipocampo de roedores

O objetivo geral deste procedimento é estudar a plasticidade de longo prazo e seus processos associativos, como marcação sináptica, captura e marcação cruzada, em neurônios paramentais do CA um, utilizando fatias hipocampais Q de roedores. Isso é realizado primeiramente pela dissecação do cérebro e rápida isolamento do hipocampo em fluido cerebroespinhal artificial oxigenado e frio. O segundo passo consiste em preparar fatias hipocampais agudas utilizando um fatiador manual de tecidos e incubá-las em uma câmara de interface.

A seguir, dois eletrodos estimulantes e dois eletrodos de gravação são posicionados na região CA1 para registrar respostas de EPSP de campo e picos de população provenientes de duas entradas sinápticas. O passo final consiste em induzir uma forma transitória de plasticidade em uma entrada sináptica e uma forma persistente de plasticidade em outra entrada dentro de uma janela de tempo específica. Por fim, as respostas de EPSP de campo de ambas as entradas são registradas por durações prolongadas para investigar os mecanismos de marcação sináptica, captura e captura cruzada.

A marcação e captura sináptica fornece uma base conceitual para a transformação da memória de curto prazo em memória de longo prazo dentro de um período de tempo específico. A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos experimentais são difíceis de aprender, já que envolvem estimulação e registro de múltiplas entradas sinápticas. O procedimento será demonstrado por Mahesh Shira, Machete e Maima Sharma, estudantes de pós-graduação do meu laboratório.

Para iniciar este procedimento, prepare o LCR A e borbulhe com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Encha a parte inferior da câmara de interface com água destilada até cerca de 70% da sua capacidade. Em seguida, ligue o controlador de temperatura pré-ajustado para 32 graus Celsius.

Em seguida, lave a câmara superior por 10 a 15 minutos, passando água destilada pela tubulação de entrada em alta vazão, antes de mudar para o LCR A a uma vazão de um mililitro por minuto. Em seguida, coloque uma tela na câmara superior para fornecer uma superfície de repouso para as fatias. Inicie o carbogênio na câmara inferior e mergulhe a tubulação de entrada no LCR A que está sendo continuamente carbogenado.

Permita 20 minutos para que o LCR A seja saturado com carbogênio e preencha a câmara superior. Nesta etapa, fixe uma lâmina de barbear no cortador de tecidos e certifique-se de que a borda de corte esteja alinhada uniformemente. Teste cortando um pequeno papel filtro para garantir que a lâmina esteja firmemente presa.

Em seguida, posicione o micrômetro vernier deslizante em sua posição inicial. Agora, obtenha a cabeça de uma rata eutanasiada e, com uma tesoura de íris, faça um corte através do crânio posterior para remover o bulbo raquidiano. Em seguida, faça uma pequena incisão ao longo do lado direito do crânio e uma incisão mais longa no lado esquerdo.

Remova cuidadosamente o crânio com uma pinça óssea começando pelo lado esquerdo e seguindo até o lado direito do crânio. Para expor o córtex e a fina camada de dura que o recobre, remova cuidadosamente a dura com uma espátula fina e, em seguida, remova as placas frontais com a pinça óssea. Posteriormente, remova a dura remanescente especificamente na junção entre o córtex e o cerebelo com a extremidade plana de uma espátula, evitando danificar o cérebro mantendo a pressão para cima.

Usando a espátula, retire suavemente o cérebro e coloque-o em uma placa de Petri sobre um bloco refrigerador de alumínio contendo A CSF frio e carbonatado para isolar o hipocampo. Com um bisturi número 11, faça um corte reto para remover o cerebelo e outro corte para remover um quarto da porção anterior do cérebro. Em seguida, faça um corte sagital superficial ao longo da linha média. A partir da linha média.

Remova cuidadosamente o córtex com o escalpelador em forma de foice para expor o hipocampo dorsal. Em seguida, remova a camada de córtex acima do hipocampo. Faça um pequeno corte no corpo caloso do hipocampo.

Remova suavemente o hipocampo com o escalpelete em forma de foice, começando pela extremidade dorsal utilizando movimentos de rolagem. Em seguida, remova qualquer córtex e tecidos conjuntivos ao redor do hipocampo isolado usando a extremidade curva do escalpelete em forma de foice. Para cortar o tecido hipocampal, coloque um pedaço de papel filtro Watman de 30 milímetros embebido em LCR sobre a plataforma de corte do cortador manual.

Transfira o tecido hipocampal para o papel filtro. Usando a extremidade plana do bisturi em forma de foice, mova o papel filtro para alinhar o hipocampo em uma orientação adequada em relação à lâmina do fatiador, de modo que o hipocampo seja seccionado em um ângulo de aproximadamente 70 graus em relação ao fia. Em seguida, remova a solução em excesso ao redor do tecido hipocampal.

Com um papel-filtro dobrado, seccione o hipocampo transversalmente e descarte o tecido da extremidade do hipocampo onde a morfologia do corte não é clara. Em seguida, seccione o tecido restante em fatias de 400 micrômetros de espessura, ajustando o micrômetro vernier após cada rodada de corte. Após cada corte, transfira cuidadosamente a fatia da lâmina usando uma escova com cerdas macias para um béquer pequeno contendo solução salina carbonatada (A CSF) fria.

Em seguida, transfira cuidadosamente as fatias para a tela na câmara de fatias usando uma pipeta de plástico Pasteur limpa. Com uma ponta larga, ajuste cuidadosamente a posição das fatias de modo a facilitar a localização do eletrodo e a verificação da gravação, verificando se as fatias estão suficientemente rodeadas por uma camada de A CSF, mas sem ficar completamente submersas. Depois disso, cubra a câmara e incube as fatias por duas a três horas em experimentos de marcação e captura sináptica.

Sob o microscópio, posicione os dois eletrodos estimuladores na camada radiatum do hipocampo CA1 para estimular as fibras colaterais de Schaffer e um eletrodo de registro na região dendrítica apical do CA1, localizado a meia distância entre os eletrodos estimuladores. Para registrar as respostas F-E-P-S-P, coloque outro eletrodo de registro na camada stratum pyramidale. FAÇA a gravação do potencial de ação populacional.

Quando todos os eletrodos tocarem o corte, aplique uma estimulação de teste para garantir que um sinal adequado de PEPF possa ser obtido em ambas as entradas. Uma vez obtido um sinal adequado de PEPF, abaixe cuidadosamente os eletrodos cerca de 200 mícrons adicionais utilizando os botões de movimento fino dos manipuladores. Em seguida, aguarde 20 minutos para que o corte se recupere.

Após isso, determine a relação entrada-saída mediante a medição da inclinação do PEPS de campo em uma faixa de intensidades de corrente de 20 microampères a 100 microampères. Em seguida, para cada entrada, defina a intensidade de estimulação que evoca 40% da inclinação máxima do PEPS de campo como estímulo constante ao longo do experimento. Após 15 a 20 minutos, comece a gravar a linha de base, registrando uma linha de base estável de pelo menos 30 a 60 minutos antes da indução de LTP-LTD em uma entrada; induza um LTP precoce utilizando um protocolo fraco de tetanização consistindo em uma única estimulação de alta frequência.

Enquanto a outra entrada continua registrando a linha de base por 30 minutos após a indução de LTP precoce, induza um LTP tardio na entrada S dois, utilizando um protocolo tetânico forte que envolva estimulação de alta frequência repetida com um intervalo inter-treino de 10 minutos. Em seguida, registre as respostas do PEPS de campo por durações prolongadas para revelar a transformação do LTP precoce na entrada S um em LTP tardio por meio da marcação e captura sináptica. De forma semelhante, em um experimento de captura cruzada, primeiro induza um LTP precoce em uma entrada, seguido, 30 minutos depois, pela indução de LTD tardio em outra entrada, utilizando um protocolo forte de estimulação de baixa frequência, consistindo em 900 rajadas ao longo de um período de 15 minutos.

Em seguida, registre as respostas do PEPS de campo por durações prolongadas para revelar a transformação do PLT precoce na entrada S1 em PLT tardio por meio da captura cruzada. Nesta representação, dois eletrodos estimuladores são posicionados na camada radiata do hipocampo CA1 para estimular duas entradas sinápticas independentes, mas sobrepostas. Sobre os neurônios paramedianos do CA1, dois eletrodos de registro extracelular.

Um para registrar F-E-P-S-P do compartimento dendrítico apical. E outro para registrar o potencial de ação populacional somático a partir dos corpos celulares parametais localizados no estrato radiatum e no estrato para, respectivamente. Esta figura mostra a semana anterior ao paradigma forte para estudar a marcação e captura sinápticas.

Aplica-se um tetanismo fraco em S um para induzir a PLT precoce, seguido por um tetanismo forte em S dois após 30 minutos para induzir a PLT tardia, e esta figura mostra o período anterior ao paradigma forte para estudar a marcação cruzada. A PLT precoce é induzida por tetanismo fraco em S um, seguida pela indução da DLT tardia em S dois utilizando um protocolo de estimulação de baixa frequência intensa. Após 30 minutos em S um, a PLT precoce é transformada em PLT tardia que dura seis horas, demonstrando marcação cruzada e captura.

Uma vez dominada, essa técnica de dissecação e preparo de cortes pode ser realizada rapidamente em três a cinco minutos. Assim, a viabilidade dos cortes pode ser preservada para registros de longa duração. Utilizando este método, pode-se também testar os efeitos de diferentes agentes farmacológicos sobre os processos de marcação e captura sináptica.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como conduzir experimentos de plasticidade funcional de longo prazo e dos processos de marcação e captura sinápticas.