Protocolo para tridimensional confocal morfométrica Análise de astrócitos

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a morfologia dos astrócitos analisando imagens tridimensionais de astrócitos que foram adquiridas por microscopia confocal. Este método pode ser usado para avaliar alterações morfológicas que podem aparecer em vários tipos de células, seja em condições patológicas ou como efeito de uma estratégia de intervenção. A principal vantagem desta técnica é que muitos parâmetros associados à arquitetura celular podem ser estudados simultaneamente.

A Dra. Mariam Bodel demonstrará este procedimento Após a preparação das lâminas para coloração imuno-histoquímica, desparize as seções submergindo-as em xileno duas vezes por 10 minutos. Incube as lâminas por 10 minutos em cada um dos 99,8%95% e 70% de etanol para reidratar as seções após a lavagem. A PBS incuba as lâminas em uma diluição de um a 1500 de proteína ácida fibrilar glial ou solução de anticorpo primário GFAP a quatro graus Celsius durante a noite.

Após a incubação, lavar as secções em PB S3 vezes durante cinco minutos. Em seguida, incubar as lâminas com uma solução de anticorpos secundários conjugados com fosfatase alcalina de um a 100 durante uma hora à temperatura ambiente. Novamente, lave a seção em PB S3 vezes por cinco minutos, menos de 30 minutos antes do uso.

Adicione uma gota de solução de cromogênio vermelho a três mililitros de tampão de substrato. Incube cada lâmina em 100 microlitros desta solução por 15 a 20 minutos no escuro. Em seguida, lave as lâminas em PB S3 vezes por cinco minutos.

Finalmente, corar os núcleos com DPI diluído um a 500 em PBS. Aplique uma a duas gotas de meio Antifa na seção e sele imediatamente com uma lamínula. Incube as lâminas a quatro graus Celsius por 24 a 48 horas antes da microscopia para garantir a vedação.

Para iniciar a microscopia confocal, coloque uma lâmina no microscópio stage e selecione a objetiva de 63 x. Depois de abrir o software de aquisição, clique em configuração inteligente na guia de aquisição e selecione o andar de quatro adequado. Aqui, dappy e Alexa, andar 5 55 são usados.

Em seguida, clique em melhor sinal, seguido de aplicar. Em seguida, clique em definir exposição para permitir que o computador determine os parâmetros de exposição ideais Para otimizar a imagem, abra a janela de canais e mude a imagem para ao vivo. Ajuste o foco, se necessário.

Em seguida, clique em um au para otimizar o orifício, ajuste o ganho para obter a melhor intensidade. Por fim, defina o ganho digital entre dois e três. Após essa otimização, pare a imagem ao vivo e abra a janela do modo de aquisição.

Ajuste o tamanho do quadro clicando em X por Y e selecione 10 24 por 10 24. Escolha também uma velocidade lenta. Em seguida, abra a guia de média e selecione um número maior ou igual a quatro.

Em seguida, clique no botão de encaixe e salve a imagem 2D capturada. Para configurar a imagem 3D, abra a guia de configuração inteligente e marque o item da pilha ZS, o que fará com que a janela da pilha Zs seja aberta. Para definir a primeira e a última posições do Zack, novamente, clique ao vivo e ajuste o foco para a posição superior do astrócito.

Clique em definir primeiro. Agora ajuste o foco para a posição mais baixa do astrócito e clique em definir último e, em seguida, pare a visualização ao vivo. Em seguida, escolha o intervalo clicando em ótimo.

Para definir o número de fatias aqui, o intervalo é de 1,01 micrômetros. Por fim, clique em iniciar, experimente e salve as imagens assim que a verificação for concluída. Além disso, adquira uma imagem 2D usando uma objetiva de 10 x ou 20 x.

Para medições de intensidade de fluorescência, selecione a ferramenta retângulo ou círculo na janela de imagem e destaque uma área para medição para quantificar o volume e a área de superfície do corpo celular e território do soma do núcleo do astrócito. Transfira as imagens 3D para um programa de software de análise apropriado, como o Velocity 6.1 no software de análise. Crie uma nova biblioteca e arraste todas as imagens para a coluna cinza esquerda.

Selecione uma imagem 3D e ative um dos canais de interesse adquiridos, como dapi. Para medições nucleares, ajuste manualmente o brilho para otimizar o contraste. Agora selecione o menu de ferramentas.

Escolha make volume e produza uma única imagem 3D a partir das imagens Zack. Abra o menu de edição e clique em propriedades. Verifique se as propriedades X, Y e Z são exibidas.

Em seguida, escolha a ferramenta ROI à mão livre na barra de ferramentas. Usando a ferramenta selecionada, desenhe uma linha ao redor do núcleo rotulado com DPI para medir o volume e a área de superfície do núcleo do astrócitos. Novamente, usando a ferramenta ROI à mão livre, meça o volume e a área de superfície de todo o astrócito desenhando uma linha ao redor do soma seguindo a superfície de todos os ramos.

Clique no menu de medidas na parte superior da janela de imagem, arraste encontrar objetos para o topo da janela e dê um nome descritivo para preencher um, selecione a cor associada e clique em medir, que abrirá uma nova janela. Nesta nova janela. Escolha volume ou área de superfície como parâmetro e clique em OK.

Para salvar os dados, clique no menu de medição e selecione fazer item de medição. Selecione um novo item de medição chamado na janela. Insira um nome de arquivo para os dados e clique em OK.

Por fim, exporte os dados de medição para um pacote de software apropriado para realizar análises estatísticas e gerar gráficos de dados. Aqui, os pesquisadores compararam astrócitos em tecido cerebral fixo de ratos tratados com beta amilóide 40 ou com beta amilóide 40 e Ian. A injeção do tratamento com a proteína amilóide resultou em astrócitos com ramos mais grossos e longos.

Esses astrócitos de animais tratados com Ian exibiam uma forma estrelada com ramos curtos e finos. Os ratos tratados com Ian também demonstraram fluorescência positiva reduzida de astrócitos GFAP nas fatias do cérebro. A análise morfométrica dos volumes específicos dos astrócitos revelou que o volume do astrócitos, núcleo, corpo celular, astrócitos inteiros e território dos astrócitos diminuiu com o tratamento com Ian em comparação com o tratamento com amilóide sozinho.

Uma vez dominada esta imagem, a técnica de análise pode ser concluída em poucos minutos por célula, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante marcar a estrutura com alta precisão. É melhor praticar a marcação manual da estrutura de interesse antes de iniciar o experimento após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia celular, histologia e patologia explorarem a estrutura de uma célula em um ambiente saudável ou de doença. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir 12 parâmetros diferentes para uma única célula usando imagens 3D.