Name: Protocolo para tridimensional confocal morfométrica Análise de astrócitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprenda análise morfométrica tridimensional de astrócitos por microscopia confocal. Este método permite avaliar alterações estruturais em condições patológicas e intervenções terapêuticas no SNC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores não têm nada a divulgar.

Este estudo foi realizado de acordo com as políticas estabelecidas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH), aprovado pelo Comitê de Ética do Irã Universidade de Ciências Médicas (Teerão, Irão). 1. Os animais, cirurgia e Specimen Preparações NOTA: Prepare o tecido cerebral para análise microscópica confocal 3D. <ol><li> Divida os animais aleatoriamente em dois grupos: Ap 1-40 -injection (n = 8), e Ap 1-40 -injection tratamento com genisteína (n = 8); administrar a genisteína (10 mg / kg, diluída em um veículo tal como óleo de rícino polietoxilado) por gavagem 1 hora antes da cirurgia. </li><li> Anestesiar os animais com cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Confirme anestesia adequada por falta de reflexo de retirada depois de beliscar o dedo do pé. Use pomada nos olhos durante a cirurgia para prevenir o ressecamento. </li><li> Coloque animais no aparelho estereotáxico e cabeça de barbear. Aplicar iodINE solução para limpar o couro cabeludo antes da incisão e manter o local da operação estéril durante a cirurgia para reduzir o risco de infecção. Injectar Ap 1-40 estereotaxicamente (4 ul) no hipocampo a -3,5 mm posterior ao bregma, ± 2 mm lateral à linha média, e -2.8 mm abaixo da dura-máter, de acordo com o atlas de cérebro de rato 8. Para o método estereotáxico por favor veja a publicação anterior 9. </li><li> Fornecer pós-operatório de observação / cuidado até que os animais são totalmente consciente para garantir o conforto dos animais. Mantenha os animais quente durante a recuperação, e não devolvê-los para uma gaiola com outros animais até a recuperação completa. Preste atenção a qualquer sinal de infecção nos animais após a cirurgia. </li><li> Anestesiar os animais profundamente por cetamina (150 mg / kg) três semanas após a cirurgia. Realizar transcardial fixação por perfusão dos animais com solução salina a 0,9%, seguido por paraformaldeído a 4% em PBS 0,1 M (pH = 7,4), em seguida, remover e corrigir cérebro, tal como descrito em 10 &lt;/ sup&gt;. </li><li> Pós-corrigir os cérebros em paraformaldeído a 4% durante 2-3 dias a 4 ° C. </li><li> Incorporar o tecido em blocos de parafina pelo uso de equipamentos de tecido de incorporação, e evitar sub-enchimento ou sobre-enchimento a cassete, pois pode interferir com o alinhamento ou de corte correta. Prestar atenção à orientação do tecido no bloco de parafina. NOTA: O hipocampo de ratos, por exemplo, está perto de parte posterior do hemisfério cerebral. Assim, o tecido deve ser incorporado em uma forma de seccionamento que começa na parte posterior do cérebro. Utilizar o atlas Paxinos 8 como um guia para alcançar a desejada estrutura anatómica. </li><li> Coloque o micrótomo longe de correntes de ar ou portas desde movimentos aéreos fazer a manipulação de partes mais difíceis. </li><li> Use seções com um de espessura ≥20 como com esta profundidade seja necessário para produzir imagens Z-pilha de astrócitos completos. Não use as primeiras seções casal, como eles podem ter espessura indesejada devido a e térmicaXpansion. </li><li> Coloque as seções sobre a superfície da água quente (5 ± 2 C, abaixo da temperatura de fusão para parafina) apenas o tempo suficiente para achatar as seções. NOTA: Ao longo da secção de expansão pode perturbar a morfologia da estrutura. Use pincel pequeno para transferir cuidadosamente seções. Recolha de dois a três seções em cada slide. </li><li> Armazenar as lâminas em um rack na posição vertical e deixe-os secar a 37 C durante várias horas ou O / N. </li></ol> 2. A imuno-histoquímica <ol><li> Desparafinar secções em xileno, 2 x 10 min, e re-hidratados através de gradiente de álcool (99,8%, 95%, e 70%, 10 min cada) e PBS. </li><li> Incubar com anticorpos contra a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) diluído 1: 1500 em PBS contendo 0,25% de albumina de soro bovino (BSA), 0,25% de Triton X-100 e 3,5% de soro normal (O / N a 4 ° C). </li><li> Lavar as secções em PBS durante 3 x 5 min. </li><li> Incubar com fosfato alcalino antibodie secundário conjugados durante 1 h (1: 100, 21 C, diluiu-se em PBS). </li><li> Lavam-se as secções em PBS durante 3 x 5 min. NOTA: É importante lavar as seções corretamente após anticorpos secundários para minimizar a coloração de fundo. </li><li> Incubar seções na escuridão com líquido Cromógena Red Permanente (15-20 min). Nota: Preparar a solução não mais do que 30 minutos antes do uso. </li><li> Lavar as secções em PBS durante 3 x 5 min. </li><li> Finalmente, os núcleos coram com 4-6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; 1: 500, diluído em PBS) antes da cobertura deslizante. Armazenar os slides na geladeira 24-48 h antes de microscopia. </li></ol> 3. Microscopia Confocal NOTA: Para a avaliação quantitativa (ver abaixo), seleccionar um dos astrócitos com um núcleo com manchas de DAPI claramente visível com um mínimo de sobreposição ramos para reduzir o risco de erros. Produzindo imagens Z-Stack é demorado. Seja paciente e não parar durante o processamento. Confocal na vertical a laser microscópio de varredura é used para criar imagens 3D a partir de astrócitos. <ol><li> Coloque o slide no palco microscópio, e selecione o objetivo 63X. </li><li> Abra o software de imagem e clique em sistema Start. Clique na aba Localize. Ir para Atribuir e selecione GFP para ajustar a luz adequada. </li><li> Abra o obturador para refletir a luz. Encontre o refletor Revolver no lado direito do Obturador e escolher a cor que deve ser reflectido pelos astrócitos (verde, vermelho ou violeta); cor vermelha (FSet20 WF) foi utilizado aqui. NOTA: Não se esqueça de focar a imagem diretamente na ocular do microscópio. </li><li> Para encontrar o melhor foco, clique em todas fechadas, colocar o pino microscópio no modo de tela, e clique na guia Acquisition. </li><li> Clique na configuração inteligente sob a guia de Aquisição; uma janela se abre. Selecione o fluoróforo adequado (ou seja, DAPI e Alexa Fluor 555, no projeto atual) da lista. A cor é selecionado automaticamente. </li><li> Clique na melhor sinal, e aplicar, em seguida, clique em Definir Exposição; o computador irá então automaticamente os parâmetros de exposição. </li><li> Para otimizar a imagem, vá para a janela Channels. Desmar Track2, realce Track1 e clique em Live. Foque a imagem, se necessário. </li><li> Na janela Canais ajustar as seguintes chaves; clique no 1AU para otimizar automaticamente o pinhole. É muito importante fazer esta etapa caso contrário, as imagens confocal será não-ideal. Ajuste de Ganho de ter a melhor intensidade (manter essa configuração abaixo de 800 para reduzir o ruído adicional). Finalmente, defina o Ganho Digital entre 2 e 3. </li><li> Desmar Track1, clique em Track2 e repita o Passo 3.8 para Track2. Então pare Live. </li><li> Vá para a janela no modo de aquisição. Melhorar a imagem, otimizando Frame Size e Média. Para mudar tamanho do quadro ir para X * Y e selecione 1024 x 1024. Escolha uma velocidade lenta para criar uma imagem melhor. </li><li> Ir para a Média e selecione um número ≥4. Este valor indica o número de média de exames que serão em média de producè A imagem adquirida. Agora clique no botão Snap, e salvar a imagem em 2D capturado. </li><li> Para geração de imagens 3D, marcar o item Z-Stack em Configuração inteligente fazendo com que a janela Z-Stack para abrir. </li><li> Definir as primeiras e últimas posições para o Z-pilha, isto é, a profundidade da célula. Primeiro, clique em Live. Em seguida, use a unidade de foco do microscópio para se concentrar em sua posição mais elevada de astrócitos no tecido, onde o Z-Stack é começar. Clique em Set First. Em seguida, concentrar até a posição mais baixa do astrócito no tecido, onde Z-Pilha de varrimento deve ser interrompido. Clique em Set Último. Então pare Live. </li><li> Escolha o intervalo; 1,01 uM é utilizado no presente estudo; intervalo de escolha pode ser feito clicando no Optimal para definir o número de fatias. </li><li> Clique em Iniciar Experiment. Salve as imagens uma vez que a verificação for concluída. Esta imagem será utilizada para a medição dos parâmetros seguintes: área superficial e volume de território dos astrócitos, o astrócitos inteiro, incluindo branches, corpo da célula, e núcleo. </li><li> Adquirir uma imagem 2D usando uma objetiva de 10X ou 20X conforme descrito nos Passos 3.6-3.11. Esta imagem pode ser utilizada para a medição da intensidade de fluorescência a imunorreactividade de anticorpos, e a densidade de astrócitos (número / 1.000 mM 2). </li></ol> 4. Astrocyte Densidade e GFAP + Intensidade de Fluorescência <ol><li> Abra a imagem 20X 2D. Clique na Histo (Hisogram) no lado esquerdo da janela da imagem. </li><li> Para calcular a densidade de astrócitos, selecione três campos visuais consecutivos no âmbito do objectivo 20X. Contar o número de astrócitos que exibem uma soma claro com mínima, a sobreposição de ramos nos campos. </li><li> Para quantificar a intensidade de fluorescência, selecione uma ferramenta adequada (retângulo ou círculo) no rodapé da janela de imagem e escolher uma área para a medição. Observe o valor médio eo desvio padrão aparecer automaticamente sob a imagem. No estudo atual, 0,7 mm2 área retangular entre strfoi utilizado iatum e lâmina medial do giro denteado. </li></ol> 5. Ramos astrócitos <ol><li> Para quantificar o comprimento eo número total de sucursais, usar imagens 3D (adquiridos com 20X) no software analisando a imagem. Desenhar uma linha manualmente ao longo do comprimento de cada ramo da astrocyte selecionado. Em seguida, selecione a ferramenta de medição que é especializada para medir a linha de comprimento. Para quantificar o número de agências, selecione a ferramenta de contagem para contar o número de itens selecionados. </li></ol> 6. Volume e Área de Superfície NOTA: A marcação de uma estrutura manualmente em 3D software de análise de imagem requer foco e treinamento. Pratique várias vezes antes de iniciar um experimento. <ol><li> Para quantificar o volume ea área de superfície do núcleo astrócitos, soma, corpo celular e território, transfira as imagens 3D (adquiridos nos Passos 3.1-3.16) para um software de análise de imagens 3D, como Volocity 6.1. </li><li> Abra o software e criar um novobiblioteca. Arraste todas as imagens para a coluna cinza à esquerda na nova biblioteca. Em seguida, selecione uma imagem 3D. À direita, há diferentes canais com cores diferentes. Ligue um canal de interesses; por exemplo, o canal de azul para DAPI quando se mede o núcleo. Alterar o brilho manualmente para obter um contraste ideal. </li><li> Selecione o menu Ferramentas, GO para fazer volume e produzir uma única imagem 3D a partir de imagens Z-stack. Clique em Propriedades no menu Editar e ter certeza de que X, Y e Z propriedades são apresentados; caso contrário, é impossível realizar uma análise 3D. </li><li> Clique no ícone da ferramenta Freehand RIO na barra de ferramentas. Para medir o volume ea área de superfície de astrócitos núcleo a desenhar uma linha ao redor do núcleo marcado com DAPI. </li><li> Para medir o volume ea área de superfície do corpo celular astrocyte a desenhar uma linha ao redor da soma excluindo ramos. </li><li> Para medir o volume ea área de superfície de astrócitos inteiro (corpo celular, incluindo filiais) a desenhar uma linha ao redor da soma após asuperfície de todos os ramos. </li><li> Para avaliar o volume ea área de superfície do território astrocyte a desenhar uma linha entre pontas dos ramos. NOTA: Pressione a tecla Delete no teclado para apagar desenhos indesejados. </li><li> Clique no menu Medições na parte superior da janela de imagem para criar um protocolo de medição; uma janela contendo diferentes ferramentas abre. </li><li> Arraste Encontre objetos para parte superior da janela (painel). Dê um nome descritivo à População 1, selecione a cor associada, e clique em Medida. Outra janela se abre. </li><li> Escolha um parâmetro ou seja, o volume ou a superfície. Clique em OK. Os dados serão exibidos em uma tabela. </li><li> Para salvar os dados clica no menu de medição e selecione Criar item de medição. </li><li> Selecionar um novo item de medida chamada a partir da janela aberta. Em seguida, dê um nome para os dados e clique em OK. </li><li> Finalmente, exportar os dados para software estatísticas, como Graph pad ou excel programa. Use t-teste para analisar os dados, em seguida, traçar 2D grAPHS. </li></ol>

<ol><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li>
<li>Pellerin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+regulation+of+energy+metabolism+by+astrocytes%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update.</a> Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).</li>
<li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).</li>
<li>Pekny, M., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+activation+and+reactive+gliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocyte activation and reactive gliosis.</a> Glia. 50 (4), 427-434 (2005).</li>
<li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).</li>
<li>Anderova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death%2Fproliferation+and+alterations+in+glial+morphology+contribute+to+changes+in+diffusivity+in+the+rat+hippocampus+after+hypoxia-ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).</li>
<li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22A+stereotaxic+atlas+of+the+rat+brain%22">A stereotaxic atlas of the rat brain</a>. , Academic. New York. (1998).</li>
<li>Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+surgery+for+excitotoxic+lesion+of+specific+brain+areas+in+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat.</a> J Vis Exp. (65), e4079(2012).</li>
<li>Bagheri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta%281-40%29-induced+astrogliosis+and+the+effect+of+genistein+treatment+in+rat%3A+a+three-dimensional+confocal+morphometric+and+proteomic+study%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study.</a> PloS One. 8 (10), e76526(2013).</li>
<li>Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+confocal+morphometry+-+a+new+approach+for+studying+dynamic+changes+in+cell+morphology+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices.</a> J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).</li>
<li>Kulkarni, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3-D+analysis+of+GFAP+labeled+astrocytes+from+fluorescence+confocal+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroscie+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images.</a> J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).</li>
<li>Wagner, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Object-based+analysis+of+astroglial+reaction+and+astrocyte+subtype+morphology+after+ischemic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiol+Exp%22%5BJournal%5D)">Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury.</a> Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).</li>
</ol>

Este trabalho foi financiado por subvenções do Conselho do Condado de Östergötland, (Suécia) e da Celular e Molecular Research Center no Irã Universidade de Ciências Médicas (Teerão, Irão).

No protocolo atual, foram empregados morfometria confocal 3D para avaliar 12 parâmetros diferentes que foram associados com morfologia de astrócitos. Para este efeito, o tecido do hipocampo de ratos com Ap 1-40 - foram usadas astrogliose induzida, com ou sem pré-tratamento genisteína como agente anti-inflamatório. Usando imagens 3D e software de morfometria, fomos capazes de mostrar o efeito da genisteína em astrogliosis ou seja, a morfologia de astrócitos. As alterações ...

Em saudável o sistema nervoso central (SNC), os astrócitos desempenham um papel importante na regulação do fluxo sanguíneo, o metabolismo energético, função sináptica e plasticidade, e ião extracelular e neurotransmissor homeostase 1-3. Além disso, os astrócitos respondem a diferentes estímulos nocivos e condições anormais, tais como trauma, infecção, ou isquemia neurodegeneração através astrogliose reactivo que é caracterizada por hipertrofia, proliferação e remodelação funcional dos astrócitos 4,5. Astrogliosis reativa pode projetar a resposta inflamatória e processo de reparo no tecido e, portanto, pode afetar o resultado clínico de intervenções terapêuticas. Por conseguinte, os astrócitos têm recebido atenção de neuroscientist durante as últimas décadas, como alvos potenciais para intervenção terapêutica para uma variedade de doenças que afectam o SNC. Os astrócitos têm normalmente uma forma estrelada com o bem-defined ramos que se espalham ao redor da soma 6. Em uma condição de doença no cérebro, ramos de astrócitos tornar complicado e mostram extremidades inchadas 7, por exemplo na presença de beta-amilóide (Ap). Este artigo apresenta um protocolo para a análise de imagens em 3D de astrócitos adquiridos por meio de microscopia confocal. Doze parâmetros quantitativos diferentes para cada astrócitos foram medidas: as áreas de superfície e volumes do território astrócitos (o tecido coberto por uma astrócitos), célula inteira (incluindo filiais), corpo celular e núcleo; o comprimento total e número de agências; a intensidade de fluorescência dos anticorpos utilizados para a detecção de astrócitos; e a densidade de astrócitos (número / 1.000 mM 2). Para este fim, utilizou-se secções do cérebro de ratos expostos a injecção intra-hipocampal de Ap 1-40, com ou sem tratamento genisteína como uma substância anti-inflamatória. O protocolo descrito pode ser usado para uma morfométricaANÁLISE de diferentes tipos de células, in vitro ou in vivo em diferentes condições.

<table><tbody><tr><td>Beta amilóide 1-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>79793</td><td>Mantenha em -70 &deg; C</td></tr><tr><td>Genisteína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>446-72-0</td><td>manter em -20 &deg; </td></tr><tr><td>Anticorpos policolonais de coelho C contra a proteína ácida fibrilar glial</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>anticorpos anti-coelho IgG suínos conjugados com fosfato alcalino</td><td>DAKO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Permanent Chromogen</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>Liquid permanent Red Substrate Buffer</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>Cremophor EL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>27963</td><td>Óleo de rícino polietoxilado - Etapa 1.1</td></tr><tr><td>LSM 700 Microscopia confocal de varredura a laser</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>Perkin Elmer Inc.,</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Análise de imagem 2000</td><td>Aparelho de estimulação óptica</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tekno Stoelting</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graph pad Prism 5</td><td>Graph pad software Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo para tridimensional confocal morfométrica análise de astrócitos

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Como as células gliais do cérebro, astrócitos têm diversos papéis funcionais no sistema nervoso central. Na presença de estímulos nocivos, astrócitos modificar suas propriedades funcionais e estruturais, uma condição chamada astrogliosis reativa. Aqui, um protocolo para a avaliação das propriedades morfológicas dos astrócitos é apresentado. Este protocolo inclui a quantificação de 12 parâmetros diferentes ou seja, a área de superfície e o volume do tecido coberto por um astrócito (território do astrócito), toda a astrócito incluindo ramos, corpo da célula, e o núcleo, bem como o comprimento total e o número de ramos, a intensidade de fluorescência imunorreactividade de anticorpos utilizados para a detecção de astrócitos, densidade e astrócitos (número / 1.000 mM 2). Para este efeito tridimensional (3D) imagens microscópicas confocais foram criadas, e software de análise de imagem 3D, tais como Volocity 6.3 foi usado para as medições. Tecido cerebral de ratos expostos a beta-amilóide 1-40 </sub&gt; (Ap 1-40) com ou sem uma intervenção terapêutica foi usado para apresentar o método. Este protocolo pode igualmente ser utilizado para a análise morfométrica 3D de outras células a partir de quer in vivo ou em condições in vitro.

Esta secção apresenta alguns exemplos das observações qualitativas e quantitativas produzidos por análise morfométrica 3D. Para os resultados completos de todos os 12 parâmetros mencionados anteriormente, consulte nossa publicação anterior 10. Observações qualitativos Os astrócitos exibiram ramos finos ou grossos que eram geralmente muito tempo em Aâ 1-40 ratos injectados (Figura 1). Algumas pequenas astrócitos em forma de e...

Os astrócitos no SNC mudam suas propriedades funcionais e estruturais em resposta a estímulos nocivos. Este relato apresenta um protocolo para avaliação da morfologia tridimensional de astrócitos em condições de doença ou após intervenções terapêuticas.

Protocolo para tridimensional confocal morfométrica Análise de astrócitos

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a morfologia de astrócitos por meio da análise de imagens tridimensionais de astrócitos obtidas por microscopia confocal. Este método pode ser utilizado para avaliar alterações morfológicas que podem surgir em diversos tipos celulares, seja em condições patológicas ou como efeito de uma estratégia de intervenção. A principal vantagem desta técnica é que muitos parâmetros associados à arquitetura celular podem ser estudados simultaneamente.A Dra. Mariam Bodel demonstrará este procedimento. Após o preparo dos lâminas para coloração imunohistoquímica, desparafinize as seções imersas em xilol duas vezes durante 10 minutos. Incube as lâminas por 10 minutos em cada etapa com etanol a 99,8%, 95% e 70% para reidratar as seções após a lavagem. Incube as lâminas em uma diluição de 1:1500 de solução de anticorpo primário proteína ácida fibrilar da glia ou GFAP em tampão fosfato salino (PBS) a quatro graus Celsius durante a noite.Após a incubação, lave as seções em PBS três vezes por cinco minutos. Em seguida, incube as lâminas com uma solução de anticorpo secundário conjugado à fosfatase alcalina na diluição de um para 100 durante uma hora à temperatura ambiente. Novamente, lave as seções em PBS três vezes por cinco minutos, menos de 30 minutos antes do uso.Adicione uma gota de solução cromogênica vermelha a três mililitros de tampão substrato. Incube cada lâmina em 100 microlitros dessa solução por 15 a 20 minutos no escuro. Em seguida, lave as lâminas em PBS 3 vezes por cinco minutos.Por fim, corar os núcleos com DPI diluído na proporção de um para 500 em PBS. Aplicar uma a duas gotas do meio Antifa na seção e selar imediatamente com uma lamínula. Incubar as lâminas a quatro graus Celsius por 24 a 48 horas antes da microscopia para garantir o selamento.Para iniciar a microscopia confocal, coloque uma lâmina sobre a platina do microscópio e selecione a objetiva de 63 x. Após abrir o software de aquisição, clique em configuração rápida na guia de aquisição e selecione o filtro adequado. Aqui, são utilizados dapi e Alexa, filtro 555.Em seguida, clique em melhor sinal, seguido por aplicar. Depois, clique em definir exposição para permitir que o computador determine os parâmetros ideais de exposição. Para otimizar a imagem, abra a janela de canais e alterne a imagem para modo ao vivo. Ajuste o foco, se necessário.Em seguida, clique em um au para otimizar o pinhole e ajuste o ganho para obter a melhor intensidade. Por fim, defina o ganho digital entre dois e três. Após essa otimização, pare a imagem ao vivo e abra a janela do modo de aquisição.Ajuste o tamanho do quadro clicando em X por Y e selecione 10 24 por 10 24. Escolha também uma velocidade lenta. Em seguida, abra a guia de média e selecione um número maior ou igual a quatro.Em seguida, clique no botão de captura e salve a imagem 2D capturada. Para configurar a imagem 3D, abra a guia de configuração rápida e marque o item pilha ZS, o que fará com que a janela de pilha Zs seja aberta. Para definir as posições inicial e final do Zack, clique novamente em modo ao vivo e ajuste o foco até a posição mais superior do astrócito.Clique em definir primeiro. Agora, ajuste o foco para a posição mais baixa do astrócito e clique em definir último, depois interrompa a visualização ao vivo. Em seguida, escolha o intervalo clicando em ideal.Para definir o número de fatias aqui, o intervalo é de 1,01 micrômetro. Por fim, clique em iniciar, experimento e salve as imagens assim que a varredura for concluída. Além disso, adquira uma imagem 2D utilizando uma objetiva de 10 x ou 20 x.Para medições da intensidade de fluorescência, selecione a ferramenta retangular ou circular na janela de imagem e destaque uma área para medição, a fim de quantificar o volume e a área superficial do corpo celular do soma nuclear do astrócito e seu território. Transfira as imagens 3D para um programa apropriado de análise, como o Velocity 6.1 no software de análise. Crie uma nova biblioteca e arraste todas as imagens para a coluna cinza à esquerda.Selecione uma imagem 3D e ative um dos canais adquiridos de interesse, como dapi. Para medições nucleares, ajuste manualmente o brilho para otimizar o contraste. Agora, selecione o menu de ferramentas.Escolha criar volume e produza uma única imagem 3D a partir das imagens Zack. Abra o menu editar e clique em propriedades. Certifique-se de que as propriedades X, Y e Z estão exibidas.Em seguida, selecione a ferramenta de ROI desenhada à mão livre na barra de ferramentas. Usando a ferramenta selecionada, desenhe uma linha ao redor do núcleo marcado como DPI para medir o volume e a área superficial do núcleo do astrócito. Novamente, utilizando a ferramenta de ROI desenhada à mão livre, meça o volume e a área superficial de todo o astrócito desenhando uma linha ao redor do corpo celular, seguindo a superfície de todos os ramos.Clique no menu de medições na parte superior da janela da imagem, arraste "encontrar objetos" para o topo da janela e dê um nome descritivo à população um, selecione a cor associada e clique em medir, o que abrirá uma nova janela. Nesta nova janela, escolha volume ou área de superfície como parâmetro e clique em ok.Para salvar os dados, clique no menu de medição e selecione criar item de medição. Selecione um novo item de medição chamado na janela. Insira um nome de arquivo para os dados e clique em ok.Por fim, exporte os dados de medição para um pacote de software apropriado para realizar análise estatística e gerar gráficos dos dados. Neste caso, os pesquisadores compararam astrócitos em tecido cerebral fixado de ratos tratados com amiloide beta um 40 ou com amiloide beta um 40 e Ian. A injeção de tratamento com a proteína amiloide resultou em astrócitos com ramificações mais espessas e mais longas.Esses astrócitos de animais tratados com Ian exibiram uma forma estelar com ramificações curtas e finas. Ratos tratados com Ian também demonstraram redução na fluorescência positiva para GFAP em astrócitos em cortes cerebrais. A análise morfométrica de volumes específicos de astrócitos revelou que o volume do núcleo celular do astrócito, do corpo celular do astrócito inteiro e do território do astrócito foi reduzido com o tratamento com Ian em comparação com o tratamento com amiloide isoladamente.Uma vez dominada esta técnica de análise de imagem, ela pode ser concluída em poucos minutos por célula, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante marcar a estrutura com alta precisão. É recomendável praticar manualmente a marcação da estrutura de interesse antes de iniciar o experimento após o seu desenvolvimento.Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biologia celular, histologia e patologia explorarem uma estrutura celular em condições saudáveis ou de doença. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir 12 parâmetros diferentes para uma única célula utilizando imagens 3D.

protocol-for-three-dimensional-confocal-morphometric-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós desenvolvemos uma plataforma de software que utiliza Imaris Neuroscience, ImarisXT e MATLAB para medir as alterações na morfologia de uma forma indefinida retirado tridimensional fluorescência confocal de células individuais. Esta nova abordagem pode ser utilizada para quantificar as alterações na forma da célula após a activação do receptor e, portanto, representa um instrumento adicional possível para a descoberta de drogas.

Uma ferramenta analítica que quantifica Alterações morfologia celular de imagens tridimensionais de fluorescência

Este vídeo demonstra o procedimento para imunomarcar uma seção fixa de tecido cerebral de camundongo com astrócitos marcados com fluorescência usando anticorpos primários e secundários e capturar as imagens dos astrócitos corados por meio de microscopia confocal.

Imunocoloração de astrócitos marcados com fluorescência em uma seção de tecido cerebral de camundongo

Fonte: Moye, S. L., et.al.  Visualizando a morfologia dos astrócitos usando a iontoforese amarela de Lúcifer. J. Vis. Exp. (2019).  Este vídeo demonstra o uso de iontoforese de corante fluorescente para estudar a morfologia de astrócitos em fatias fixas de cérebro. Ele detalha a perfuração do soma do astrócito com um eletrodo para fornecer um corante aniônico e hidrofílico no citoplasma sob uma corrente de baixa voltagem, permitindo que o corante se difunda e rotule o soma e os ramos. A...

Visualizando a morfologia dos astrócitos usando iontoforese de corante fluorescente em uma fatia de cérebro de camundongo fixa

Fonte: Bagheri, M., et. al. Protocolo para Análise Morfométrica Confocal Tridimensional de Astrócitos. J. Vis. Exp. (2015).Este vídeo demonstra a imagem de astrócitos marcados com fluorescência em uma seção do cérebro de camundongo usando um microscópio confocal. A seção do cérebro é posicionada sob a lente objetiva apropriada e fluoróforos e filtros adequados são selecionados. Depois de otimizar a exposição automaticamente, os parâmetros de digitalização são definidos para garantir imagens 2D...

Imagem tridimensional de astrócitos imunomarcados usando microscopia confocal

Uma maneira de ganhar novos insights sobre a complexidade da resposta inflamatória do cérebro é apresentado. Descrevemos protocolos baseados em imunofluorescência, seguido por análise confocal tridimensional para investigar o padrão de co-expressão de marcadores fenotípicos microglia / macrófagos em um modelo de rato de isquemia focal.

Tridimensional Confocal análise de marcadores Microglia / macrófagos de polarização em Experimental Brain Injury

Vamos mostrar o desenvolvimento de feixes Self montados, tridimensionais do somata hamartomas alinhado longitudinalmente e processos dentro de um invólucro de biomaterial romance. Estas engenharia "vida andaimes", exibindo o diâmetro do mícron-escala ainda estendendo centímetros de comprimento, pode servir como teste-camas para estudar os mecanismos do desenvolvimento neurológico ou facilitar Epilepsias pelo diretor de migração neuronal e/ou axonal Pathfinding.

Engenharia de tecidos tridimensionais alinhado Astrocyte redes para recapitular os mecanismos do desenvolvimento e facilitar a regeneração do sistema nervoso

Aqui nós apresentamos um protocolo para avaliar a organização de redes hamartomas. O método descrito minimiza o viés para fornecer medidas descritivas dessas redes tais como a contagem de células, tamanho, área e posição dentro de um núcleo. Anisotropia é avaliada com uma análise vectorial.

Analisando o tamanho, forma e direcionalidade das redes de astrócitos acoplados

O pipeline descrito é projetado para a segmentação de conjuntos de dados de microscopia eletrônica maiores que gigabytes, para extrair morfologias de células inteiras. Uma vez que as células são reconstruídas em 3D, software personalizado projetado em torno de necessidades individuais pode ser usado para executar uma análise qualitativa e quantitativa diretamente em 3D, também usando a realidade virtual para superar a oclusão de visão.

Um método para reconstrução 3D e análise de realidade virtual de células gliais e neuronais

Os astrócitos são células morfologicamente complexas, exemplificadas por seus múltiplos processos e territórios Bushy. Para analisar sua morfologia elaborada, apresentamos um protocolo confiável para a realização de iontoforese intracelular de Lúcifer amarelo em tecido levemente fixo.

Visualizando morfologia Astrocitante usando Lúcifer iontoforese amarela

A combinação de transdução vetorial viral e limpeza cerebral usando o método CLARITY permite a investigação de um grande número de neurônios e astrócitos simultaneamente.

Investigação da interação espacial entre astrócitos e neurônios em cérebros limpos

Este protocolo descreve métodos de seção, coloração e seções de tecido flutuante de imagem do cérebro do camundongo, seguido por uma descrição detalhada da análise do volume de território de astrócito e da sobreposição de território de astrócito.

Análise do volume do território de astutação e revestimento em seções de tecido livre grossa

Aprenda análise morfométrica tridimensional de astrócitos por microscopia confocal. Este método permite avaliar alterações estruturais em condições patológicas e intervenções terapêuticas no SNC.

Protocolo para tridimensional confocal morfométrica Análise de astrócitos

Explorar mais vídeos