Protocolo para tridimensional confocal morfométrica Análise de astrócitos
11 de dezembro de 2015
Os astrócitos no SNC mudam suas propriedades funcionais e estruturais em resposta a estímulos nocivos. Este relato apresenta um protocolo para avaliação da morfologia tridimensional de astrócitos em condições de doença ou após intervenções terapêuticas.
O objetivo geral deste procedimento é avaliar a morfologia de astrócitos por meio da análise de imagens tridimensionais de astrócitos obtidas por microscopia confocal. Este método pode ser utilizado para avaliar alterações morfológicas que podem surgir em diversos tipos celulares, seja em condições patológicas ou como efeito de uma estratégia de intervenção. A principal vantagem desta técnica é que muitos parâmetros associados à arquitetura celular podem ser estudados simultaneamente.
A Dra. Mariam Bodel demonstrará este procedimento. Após o preparo dos lâminas para coloração imunohistoquímica, desparafinize as seções imersas em xilol duas vezes durante 10 minutos. Incube as lâminas por 10 minutos em cada etapa com etanol a 99,8%, 95% e 70% para reidratar as seções após a lavagem. Incube as lâminas em uma diluição de 1:1500 de solução de anticorpo primário proteína ácida fibrilar da glia ou GFAP em tampão fosfato salino (PBS) a quatro graus Celsius durante a noite.
Após a incubação, lave as seções em PBS três vezes por cinco minutos. Em seguida, incube as lâminas com uma solução de anticorpo secundário conjugado à fosfatase alcalina na diluição de um para 100 durante uma hora à temperatura ambiente. Novamente, lave as seções em PBS três vezes por cinco minutos, menos de 30 minutos antes do uso.
Adicione uma gota de solução cromogênica vermelha a três mililitros de tampão substrato. Incube cada lâmina em 100 microlitros dessa solução por 15 a 20 minutos no escuro. Em seguida, lave as lâminas em PBS 3 vezes por cinco minutos.
Por fim, corar os núcleos com DPI diluído na proporção de um para 500 em PBS. Aplicar uma a duas gotas do meio Antifa na seção e selar imediatamente com uma lamínula. Incubar as lâminas a quatro graus Celsius por 24 a 48 horas antes da microscopia para garantir o selamento.
Para iniciar a microscopia confocal, coloque uma lâmina sobre a platina do microscópio e selecione a objetiva de 63 x. Após abrir o software de aquisição, clique em configuração rápida na guia de aquisição e selecione o filtro adequado. Aqui, são utilizados dapi e Alexa, filtro 555.
Em seguida, clique em melhor sinal, seguido por aplicar. Depois, clique em definir exposição para permitir que o computador determine os parâmetros ideais de exposição. Para otimizar a imagem, abra a janela de canais e alterne a imagem para modo ao vivo. Ajuste o foco, se necessário.
Em seguida, clique em um au para otimizar o pinhole e ajuste o ganho para obter a melhor intensidade. Por fim, defina o ganho digital entre dois e três. Após essa otimização, pare a imagem ao vivo e abra a janela do modo de aquisição.
Ajuste o tamanho do quadro clicando em X por Y e selecione 10 24 por 10 24. Escolha também uma velocidade lenta. Em seguida, abra a guia de média e selecione um número maior ou igual a quatro.
Em seguida, clique no botão de captura e salve a imagem 2D capturada. Para configurar a imagem 3D, abra a guia de configuração rápida e marque o item pilha ZS, o que fará com que a janela de pilha Zs seja aberta. Para definir as posições inicial e final do Zack, clique novamente em modo ao vivo e ajuste o foco até a posição mais superior do astrócito.
Clique em definir primeiro. Agora, ajuste o foco para a posição mais baixa do astrócito e clique em definir último, depois interrompa a visualização ao vivo. Em seguida, escolha o intervalo clicando em ideal.
Para definir o número de fatias aqui, o intervalo é de 1,01 micrômetro. Por fim, clique em iniciar, experimento e salve as imagens assim que a varredura for concluída. Além disso, adquira uma imagem 2D utilizando uma objetiva de 10 x ou 20 x.
Para medições da intensidade de fluorescência, selecione a ferramenta retangular ou circular na janela de imagem e destaque uma área para medição, a fim de quantificar o volume e a área superficial do corpo celular do soma nuclear do astrócito e seu território. Transfira as imagens 3D para um programa apropriado de análise, como o Velocity 6.1 no software de análise. Crie uma nova biblioteca e arraste todas as imagens para a coluna cinza à esquerda.
Selecione uma imagem 3D e ative um dos canais adquiridos de interesse, como dapi. Para medições nucleares, ajuste manualmente o brilho para otimizar o contraste. Agora, selecione o menu de ferramentas.
Escolha criar volume e produza uma única imagem 3D a partir das imagens Zack. Abra o menu editar e clique em propriedades. Certifique-se de que as propriedades X, Y e Z estão exibidas.
Em seguida, selecione a ferramenta de ROI desenhada à mão livre na barra de ferramentas. Usando a ferramenta selecionada, desenhe uma linha ao redor do núcleo marcado como DPI para medir o volume e a área superficial do núcleo do astrócito. Novamente, utilizando a ferramenta de ROI desenhada à mão livre, meça o volume e a área superficial de todo o astrócito desenhando uma linha ao redor do corpo celular, seguindo a superfície de todos os ramos.
Clique no menu de medições na parte superior da janela da imagem, arraste "encontrar objetos" para o topo da janela e dê um nome descritivo à população um, selecione a cor associada e clique em medir, o que abrirá uma nova janela. Nesta nova janela, escolha volume ou área de superfície como parâmetro e clique em ok.
Para salvar os dados, clique no menu de medição e selecione criar item de medição. Selecione um novo item de medição chamado na janela. Insira um nome de arquivo para os dados e clique em ok.
Por fim, exporte os dados de medição para um pacote de software apropriado para realizar análise estatística e gerar gráficos dos dados. Neste caso, os pesquisadores compararam astrócitos em tecido cerebral fixado de ratos tratados com amiloide beta um 40 ou com amiloide beta um 40 e Ian. A injeção de tratamento com a proteína amiloide resultou em astrócitos com ramificações mais espessas e mais longas.
Esses astrócitos de animais tratados com Ian exibiram uma forma estelar com ramificações curtas e finas. Ratos tratados com Ian também demonstraram redução na fluorescência positiva para GFAP em astrócitos em cortes cerebrais. A análise morfométrica de volumes específicos de astrócitos revelou que o volume do núcleo celular do astrócito, do corpo celular do astrócito inteiro e do território do astrócito foi reduzido com o tratamento com Ian em comparação com o tratamento com amiloide isoladamente.
Uma vez dominada esta técnica de análise de imagem, ela pode ser concluída em poucos minutos por célula, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante marcar a estrutura com alta precisão. É recomendável praticar manualmente a marcação da estrutura de interesse antes de iniciar o experimento após o seu desenvolvimento.
Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biologia celular, histologia e patologia explorarem uma estrutura celular em condições saudáveis ou de doença. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir 12 parâmetros diferentes para uma única célula utilizando imagens 3D.
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Visão Geral
Este relatório apresenta um protocolo para avaliar a morfologia de astrócitos em três dimensões utilizando microscopia confocal. O método avalia alterações morfológicas em astrócitos sob condições patológicas ou após intervenções terapêuticas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Patologia
Contexto
- Os astrócitos no SNC exibem alterações em resposta a estímulos nocivos.
- Compreender a morfologia dos astrócitos é fundamental para estudar diversas condições neurológicas.
- Este protocolo permite a análise simultânea de múltiplos parâmetros de arquitetura celular.
- A microscopia confocal fornece imagens tridimensionais de alta resolução.
Objetivo do Estudo
- Avaliar a morfologia de astrócitos em condições patológicas.
- Avaliar os efeitos de intervenções terapêuticas na estrutura dos astrócitos.
- Desenvolver um protocolo confiável para análise morfológica.
Métodos Utilizados
- Preparação de lâminas para coloração imunohistoquímica.
- Desparafinização de cortes usando xilol.
- Reidratação de cortes por meio de soluções graduadas de etanol.
- Incubação com anticorpo primário anti-GFAP para identificação de astrócitos.
Resultados Principais
- Demonstração de alterações morfológicas em astrócitos.
- Identificação de alterações estruturais em resposta a intervenções.
- Validação do protocolo para estudos futuros.
Conclusões
- O protocolo avalia efetivamente a morfologia dos astrócitos.
- Os achados contribuem para a compreensão dos papéis dos astrócitos na patologia do SNC.
- Aplicações futuras podem aprimorar estratégias terapêuticas para doenças neurológicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação quantitativa da morfologia de astrócitos permite a redução de riscos mecanicistas na validação de alvos neurodegenerativos, vinculando alterações estruturais a intervenções terapêuticas. Essa abordagem morfométrica confocal tridimensional reforça a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta, fornecendo leituras multiparamétricas que refletem respostas gliais específicas de vias. O método aprimora a continuidade translacional de modelos in vitro ou in vivo para tomadas de decisão pré-clínicas, por meio de fluxos de trabalho de imagem padronizados e reprodutíveis.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas mediante a quantificação da remodelação estrutural de astrócitos em resposta ao beta-amiloide e a estratégias de intervenção.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio de análise multiparamétrica da reatividade glial, reduzindo a ambiguidade mecanicista no engajamento de alvos no SNC.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho posteriores, estabelecendo fenótipos morfológicos de linha de base e induzidos por intervenção.
- Valor Operacional: Aborda a padronização e reprodutibilidade de ensaios por meio de saídas morfométricas quantitativas de 12 parâmetros adequadas para adaptação em triagem de alto conteúdo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Discute a relevância para doenças ao modelar a astrogliose reativa em tecido cerebral de rato exposto a amiloide, alinhando-se com vias de biomarcadores translacionais na neurodegeneração.
- Valor Operacional: Descreve a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, permitindo o acompanhamento longitudinal das alterações estruturais dos astrócitos sob diferentes condições de tratamento.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses até a identificação de compostos promissores, fornecendo dados quantitativos sobre a morfologia glial que orientam a seleção de alvos e a redução de riscos nas vias.
- Biologia da Descoberta: Explica como o método apoia a testagem de hipóteses, a clarificação de vias ou a redução de riscos biológicos por meio da fenotipagem estrutural de astrócitos em contextos patológicos e de intervenção.
- Triagem: Descreve a prontidão do ensaio, a reprodutibilidade ou as saídas quantitativas quando apoiadas pelo artigo por meio de imagem 3D padronizada e análise multiparamétrica.
- Análises: Destaca as medições, leituras ou saídas estatísticas que ajudam as equipes a comparar condições, incluindo volume, área superficial, comprimento e número de ramificações, intensidade de fluorescência e densidade.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o método com a continuidade pré-clínica ou o alinhamento de biomarcadores somente quando o artigo o apoiar por meio de modelagem da reatividade de astrócitos relevante para doenças.
- Reutilização Empresarial: Apresenta o método como uma capacidade reutilizável, e não como uma técnica de uso único, por meio de protocolos padronizados de imagem e análise aplicáveis a diferentes tipos celulares e condições.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Decisões de avanço ou interrupção mais precisas, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avançamento ajustadas ao risco.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise científica necessária em microscopia confocal, coloração imunohistoquímica e análise de imagens 3D.
- Necessidades de instrumentação e infraestrutura analítica, incluindo microscópio confocal com capacidade de aquisição em Z-stack e software de análise 3D, como o Volocity.
- Requisitos de padronização entre equipes para protocolos de coloração, parâmetros de imagem e consistência nas medidas morfométricas.
- Considerações de adaptação entre sistemas modelo, incluindo preparações de astrócitos in vivo e in vitro de diversas espécies.
- Limitações práticas apoiadas pelo material de origem, incluindo a necessidade de marcação manual precisa de estruturas e a otimização das configurações de imagem para a relação sinal-ruído.
