Imagem tridimensional de astrócitos imunomarcados usando microscopia confocal

Pegue uma seção de cérebro de camundongo imunomarcada com astrócitos marcados com fluorescência. O citoplasma do astrócito fluoresce em vermelho, enquanto o núcleo fluoresce em azul.

Coloque a lâmina em uma platina de microscópio confocal sob uma lente objetiva adequada.

Usando o software de aquisição, ajuste o foco e selecione os fluoróforos que marcam o citoplasma do astrócito e o núcleo.

Inicie a geração de imagens ao vivo e otimize os parâmetros de imagem para reduzir o ruído na imagem adquirida.

Em parâmetros de aquisição, selecione um modo de digitalização de baixa velocidade para capturar uma imagem bidimensional de alta qualidade.

Identifique a posição superior do astrócito como ponto de partida para a pilha Z e a posição mais baixa como ponto final.

Defina o número de fatias que cobrem toda a profundidade da célula.

Mescle as fatias para gerar uma imagem tridimensional do astrócito.

Para iniciar a microscopia confocal, coloque uma lâmina na platina do microscópio e selecione a objetiva 63x. Depois de abrir o software de aquisição, clique em Smart Setup na guia Aquisição e selecione os fluoróforos adequados. Aqui, DAPI e Alexa Fluor 555 são usados.

Em seguida, clique em Melhor sinal, seguido de Aplicar. Em seguida, clique em Definir exposição para permitir que o computador determine os parâmetros de exposição ideais.

Para otimizar a imagem, abra a janela Canais e mude a imagem para Ao vivo. Ajuste o foco, se necessário. Em seguida, clique em 1 UA para otimizar o orifício. Ajuste o ganho para obter a melhor intensidade.

Por fim, defina o ganho digital entre 2 e 3. Após essa otimização, pare a imagem ao vivo e abra a janela Modo de aquisição. Ajuste o tamanho do quadro clicando em X por Y e selecione 1024 por 1024. Além disso, escolha uma velocidade lenta.

Em seguida, abra a guia Média e selecione um número maior ou igual a 4. Em seguida, clique no botão Encaixar e salve a imagem 2D capturada. Para configurar a imagem 3D, abra a guia Smart Setup e marque o item Z-Stack, o que fará com que a janela da pilha seja aberta.

Para definir a primeira e a última posições do Z-Stack, clique novamente em Live e ajuste o foco para a posição mais alta do astrócito. Clique em Definir primeiro. Agora ajuste o foco para a posição mais baixa do astrócito e clique em Definir último. Em seguida, pare a visualização ao vivo.

Em seguida, escolha o intervalo clicando em Ideal para definir o número de fatias. Aqui, o intervalo é de 1,01 micrômetros. Por fim, clique em Iniciar experimento e salve as imagens assim que a verificação for concluída.