Engenharia de Tecido Tridimensional de Redes de Astrócitos Alinhadas para Recapitular Mecanismos de Desenvolvimento e Facilitar a Regeneração do Sistema Nervoso

Este protocolo visa orientar a fabricação de feixes tridimensionais auto-montados de somata astrocítica alinhada longitudinalmente e processos dentro de uma micro-coluna de hidrogel do tamanho de mícrons para uso como modelo neurobiológico in vitro ou como terapia neuro-regenerativa. Trauma e doença neurodegenerativa são particularmente prejudiciais aos pacientes devido à capacidade neurogênica restrita em ambiente inibitório que limita a regeneração no sistema nervoso central. Os feixes astrocíticos projetados abordam as limitações das estratégias de tratamento atuais, tentando replicar as principais características neuroanatômicas e mecanismos de desenvolvimento mediados pela glia para promover a migração celular direcionada e a descoberta de caminhos de axônios.

A arquitetura desses andaimes astrocíticos é inspirada principalmente nos processos astrocíticos alinhados nos tubos gliais do fluxo migratório rostral. Comece preparando uma solução de agarose a 3% por volume e DPBS em um béquer estéril. Mantenha o aquecimento e a agitação para evitar que a solução solidifique prematuramente.

Insira uma agulha de acupuntura na abertura inferior do dispensador de lâmpada. Coloque um tubo capilar sobre a agulha exposta e prenda os dois inserindo parte dele na seção de borracha do cilindro dispensador de bulbo. Tampe o cilindro para concluir a montagem.

Transfira um mililitro de agarose líquida para a superfície de uma placa de Petri vazia. Enquanto aperta a tampa de borracha do dispensador de lâmpada, insira uma extremidade do tubo capilar na agarose e libere a pressão na tampa para puxar a agarose para dentro do tubo. Coloque os conjuntos de bulbo, tubo e agulha em uma placa de Petri e deixe a agarose solidificar dentro dos tubos capilares por 5 minutos.

Em seguida, puxe a agulha para fora do tubo capilar, deixando a microcoluna ainda ao redor da agulha. Use as pontas dos antecedentes para empurrar a microcoluna até o final da agulha, depois segure a agulha sobre uma placa de Petri contendo DPBS aberta e empurre a microcoluna para dentro da DPBS. Para fabricar barcos de microcolunas, que facilitam o manuseio posterior dessas construções, comece fazendo uma solução de agarose de 4% de peso por volume e mantendo a solução aquecida e agitada.

Use uma pinça para mover uma microcoluna para uma placa de Petri vazia. Em seguida, enquanto trabalha sob um estereoscópio, use um microbisturi para aparar as microcolunas no comprimento desejado, com as extremidades cortadas em um ângulo de 45 graus. Depois de aparar mais três microcolunas, alinhe as quatro colunas em paralelo.

Carregue uma pipeta com 50 microlitros de solução de agarose a 4% e dispense uma linha de líquido sobre a matriz de microcolunas para conectar e agrupar as construções em um barco. Deixe esfriar por 1 a 2 minutos para permitir a gelificação da agarose 4%. Em seguida, use uma pinça fina para pegar o barco de micro-coluna pela ponte de conexão agarose.

E mova-o para uma placa de Petri contendo DPBS. Transfira o barco de microcoluna para um gabinete de biossegurança e esterilize com exposição à luz ultravioleta por trinta minutos. Dentro de um gabinete de biossegurança, prepare uma solução de 1 miligrama por mililitro de colágeno tipo 1 de cauda de rato em meio de co-cultura.

E então coloque-o no gelo. Ajuste o pH da solução de MEC com ácido ou base, conforme necessário, até que o pH esteja estável na faixa de 7,2 a 7,4. Transfira o barco de micro-coluna para uma placa de Petri de 35 ou 60 mL com fórceps.

Usando o estereoscópio para orientação, posicione a ponta de 10 mL de uma micropipeta em uma extremidade de cada microcoluna e aspire para esvaziar o lúmen de DPBS e bolhas de ar. Carregue uma micropipeta P10 com a solução de colágeno. Coloque a ponta de 10 mL contra uma extremidade de cada microcoluna e forneça solução suficiente para preencher o lúmen.

Em seguida, pipete um reservatório de ECM em cada extremidade da microcoluna. Depois que todas as colunas estiverem preenchidas, pipete o meio de cocultura em um anel ao redor da placa de Petri para evitar que as colunas sequem. Incube o prato contendo as micro-colunas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por pelo menos uma hora para promover a polimerização do colágeno antes de adicionar as células.

Em seguida, coloque a ponta de uma micropipeta P10 em uma extremidade de uma microcoluna e transfira aproximadamente 5 mL de solução celular para o lúmen para preenchê-la. Depois de assentar todas as micro-colunas em um barco, incube-o a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 1 hora para promover a fixação dos astrócitos ao ECM. Após o período de incubação, encher cuidadosamente as placas que contêm as micro-colunas assentadas com 3 ou 6 ml de meios de cocultura, para 35 ou 60 ml de placas de Petri, respectivamente.

Manter as micro-colunas revestidas e a cultura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para promover a auto-montagem do alinhamento dos feixes astrocíticos, que devem formar uma estrutura semelhante a um cabo após seis a dez horas. Uma hora após o revestimento, os astrócitos têm forma esférica e se dispersam por toda a construção. Cinco horas após o revestimento, os astrócitos iniciam a extensão e contração do processo.

Oito horas após o revestimento, os astrócitos se alinharam e se contraíram. 24 horas após o revestimento, um denso feixe de processos astrocíticos se formou neste exemplo. Este feixe astrocítico totalmente formado, 24 horas após o revestimento, mostra o efeito de zíper, onde as extremidades do cabo se prendem a extremidades distintas da parede do lúmen.

Este vídeo mostra o empacotamento em ação, 3 a 10 horas após o revestimento. A imunomarcação dos andaimes astrocíticos demonstra o alinhamento longitudinal dos processos astrocíticos. Nesta imagem confocal de um feixe astrocítico, o marcador astrocítico GFAP é lido.

E os núcleos são vistos em azul. Essa maior ampliação do feixe permite a visualização da citoarquitetura dos astrócitos dentro das microcolunas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de fabricar andaimes vivos que consistem em feixes astrocíticos alinhados longitudinalmente com uma citoarquitetura biologicamente inspirada dentro de um invólucro de biomaterial.

Após este procedimento, uma estratégia de transplante pode ser projetada para entregar os feixes astrocíticos com ou sem o invólucro do biomaterial ao tecido cerebral lesionado para promover a migração celular direcionada de regiões neurogênicas e atuar na orientação para o microambiente limitante do SNC. Além disso, esta técnica pode ser expandida como um fenômeno neurobiológico mediado por glia de plataforma de modelagem biofidélica beneficiado pela mimetização do ambiente tridimensional nativo e pelo controle experimental inerente de sistemas in vitro.