Engenharia de tecidos tridimensionais alinhado Astrocyte redes para recapitular os mecanismos do desenvolvimento e facilitar a regeneração do sistema nervoso

Este protocolo tem como objetivo orientar a fabricação de feixes tridimensionais auto-organizados, compostos por corpos celulares e prolongamentos astrocíticos alinhados longitudinalmente, dentro de uma microcoluna de hidrogel em escala micrométrica, para uso como modelo neurobiológico in vitro ou como terapia neuro-regenerativa. Traumas e doenças neurodegenerativas são particularmente prejudiciais aos pacientes devido à limitada capacidade neurogênica em um ambiente inibitório que restringe a regeneração no sistema nervoso central. Os feixes astrocíticos projetados superam as limitações das estratégias terapêuticas atuais ao tentar replicar características neuroanatômicas essenciais e mecanismos de desenvolvimento mediados por gliócitos, promovendo assim a migração celular direcionada e o direcionamento axonal.

A arquitetura desses suportes astrocitários é inspirada principalmente nos prolongamentos astrocitários alinhados nos tubos gliais do fluxo migratório rostral. Comece preparando uma solução de agarose a 3% peso por volume e DPBS em um béquer estéril. Mantenha o aquecimento e a agitação para evitar que a solução solidifique prematuramente.

Insira uma agulha de acupuntura na abertura inferior do dispensador de bulbo. Coloque um tubo capilar sobre a agulha exposta e fixe os dois inserindo parte dele na seção de borracha do cilindro do dispensador de bulbo. Tampe o cilindro para completar a montagem.

Transfira um mililitro de ágarose líquida para a superfície de uma placa de Petri vazia. Enquanto comprime a tampa de borracha do dispensador de bulbo, insira uma extremidade do tubo capilar na ágarose e libere a pressão sobre a tampa para aspirar a ágarose para dentro do tubo. Coloque os conjuntos de bulbo, tubo e agulha sobre uma placa de Petri e deixe a ágarose solidificar dentro dos tubos capilares por 5 minutos.

Em seguida, retire a agulha do tubo capilar, deixando a microcoluna ainda envolvendo a agulha. Use as pontas da pinça para empurrar suavemente a microcoluna até a extremidade da agulha, depois segure a agulha sobre uma placa de Petri aberta contendo DPBS e empurre a microcoluna para dentro do DPBS. Para fabricar barquinhos de microcoluna, que facilitam o manuseio posterior dessas estruturas, comece preparando uma solução de agarose a 4% peso por volume, mantendo a solução aquecida e sob agitação.

Use uma pinça para mover um microcoluna para uma placa de Petri vazia. Em seguida, trabalhando sob um estereoscópio, use um escalpelo micro para cortar as microcolunas no comprimento desejado, com as extremidades cortadas em um ângulo de 45 graus. Após cortar mais três microcolunas, alinhe as quatro colunas em paralelo.

Carregue uma pipeta com 50 microlitros de solução de agarose a 4% e dispense uma linha de líquido sobre a matriz de microcolunas para conectar e agrupar as estruturas em um barco. Deixe esfriar por 1 a 2 minutos para permitir a gelificação da agarose a 4%. Em seguida, use pinças finas para levantar o barco de microcolunas pela ponte de agarose que as conecta.

E transfira-o para uma placa de Petri contendo DPBS. Transfira o barco da microcoluna para uma cabine de segurança biológica e esterilize com exposição à luz ultravioleta por trinta minutos. Dentro de uma cabine de segurança biológica, prepare uma solução de 1 miligrama por mililitro de colágeno tipo 1 de cauda de rato em meio de co-cultura.

Em seguida, coloque-o no gelo. Ajuste o pH da solução de ECM com ácido ou base conforme necessário até que o pH esteja estável na faixa de 7,2 a 7,4. Transfira o barco de microcoluna para uma placa de Petri de 35 ou 60 mL com pinça.

Usando o estereoscópio como guia, posicione a ponteira de 10 mL de uma micropipeta em uma extremidade de cada microcoluna e aspire para esvaziar a luz de DPBS e bolhas de ar. Carregue uma micropipeta P10 com a solução de colágeno. Coloque a ponteira de 10 mL contra uma extremidade de cada microcoluna e adicione quantidade suficiente de solução para preencher a luz.

Em seguida, pipete um reservatório de MEC em ambas as extremidades da micro-coluna. Depois que todas as colunas tiverem sido preenchidas, pipete o meio de cocultura em um anel ao redor da placa de petri para evitar que as colunas sequem. Incube a placa contendo as micro-colunas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por pelo menos uma hora para promover a polimerização do colágeno antes de adicionar as células.

Em seguida, posicione a ponteira de uma micropipeta P10 em uma extremidade de uma microcoluna e transfira aproximadamente 5 mL da solução celular para dentro da luz, preenchendo-a. Após acomodar todas as microcolunas em um suporte, incube-o a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 1 hora para promover a adesão dos astrócitos à MEC. Após o período de incubação, preencha cuidadosamente as placas contendo as microcolunas acomodadas com 3 ou 6 mL de meio de cocultivo, para placas de Petri de 35 ou 60 mL, respectivamente.

Mantenha os microcolunas cultivados e a cultura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para promover a autoagregação dos feixes astrocíticos, que devem formar uma estrutura agrupada, semelhante a um cabo, após seis a dez horas. Uma hora após o cultivo, os astrócitos têm formato esférico e se dispersam por toda a construção. Após cinco horas do cultivo, os astrócitos iniciam a extensão e contração dos processos.

Oito horas após a semeadura, os astrócitos já se alinharam e contraíram. Após 24 horas da semeadura, formou-se neste exemplo um feixe denso de prolongamentos astrocitários. Esse feixe astrocitário completamente formado, 24 horas após a semeadura, mostra o efeito de fechamento em zíper, no qual as extremidades do cabo se ligam a extremidades distintas da parede da luz.

Este vídeo mostra o agrupamento em ação, de 3 a 10 horas após a semeadura. A imunomarcação dos arcabouços astrocitários demonstra o alinhamento longitudinal dos prolongamentos astrocitários. Nesta imagem confocal de um feixe astrocitário, o marcador astrocitário GFAP é detectado.

Os núcleos são visualizados em azul. Este aumento maior do feixe permite a visualização da arquitetura citoplasmática dos astrócitos dentro das microcolunas. Após assistir a este vídeo, você deverá ser capaz de fabricar scaffolds vivos constituídos por feixes de astrócitos alinhados longitudinalmente, com uma arquitetura citoplasmática inspirada biologicamente, dentro de uma cápsula de biomaterial.

Após este procedimento, pode-se planejar uma estratégia de transplante para entregar os feixes de astrócitos com ou sem o revestimento de biomaterial a tecidos cerebrais lesados, a fim de promover a migração direcionada de células a partir de regiões neurogênicas e atuar como guia no microambiente limitante do SNC. Além disso, esta técnica pode ser expandida como uma plataforma de modelagem biofidelidade para fenômenos neurobiológicos mediados por glia, beneficiada pela imitação do ambiente tridimensional nativo e pelo controle experimental inerente aos sistemas in vitro.