Name: Análise de Desenvolvimento de dente Germ Innervation Utilizar dispositivos microfluídicos Co-cultura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprenda a isolar e co-cultivar gânglios trigeminais e germes dentários em desenvolvimento usando dispositivos microfluídicos. Este método permite visualizar padrões de inervação neuronal e estudar interações entre nervos e tecidos-alvo em biologia do desenvolvimento.

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O trabalho foi financiado pela Universidade de Zurique. Os autores gostariam de agradecer a Estrela Neto e ao Dr. Meriem Lamghari por ajudarem a estabelecer as condições de co-cultura.

Todos os ratos foram mantidos e tratados de acordo com a Lei de Bem-estar animal suíço e em conformidade com os regulamentos do escritório Cantonal Veterinária, Zurique. 1. Preparação da dissecção Material, Meios de Cultura, microfluídicos <ol><li> Autoclave pinças micro-dissecção e tesouras (121 ° C, o tempo de esterilização: 20 min) e armazená-los em um recipiente estéril. </li><li> Esterilizar lamelas de vidro (24 mm x 24 mm), incubando-as em HCl 1 M durante 24 h num agitador orbital a 37 ° C. Lavar três vezes com estéril, H2O destilada e três vezes com etanol a 99%. A seco seguida as lamelas a 37 ° C ou sob câmara de fluxo estéril. Finalmente, autoclave ou expor as lamelas a luz UV (30 min) para completar a esterilização. As lamelas podem então ser armazenados em etanol a 70%. </li><li> Remova cuidadosamente os dispositivos de isolamento AXIS Axon do pacote usando uma pinça estéril e colocá-los em uma placa de Petri estéril. </li&gt; <li> Usando uma biópsia estéril (o: 1 mm) criar um buraco por amostra a ser cultivadas (Figura 1), em correspondência com as câmaras de cultura. NOTA: Não perfurar demasiado perto das estrias, pois eles podem ser danificados pela pressão aplicada. </li><li> Esterilizar os dispositivos de isolamento AXIS Axon por imergindo-los em etanol a 70%. Seca, então AXIS Axon dispositivos de isolamento e lamelas completamente sob uma capela de fluxo estéril. Espere um mínimo de 3 horas antes de prosseguir. NOTA: secagem incompleta resultará em conjunto com defeito de dispositivos microfluídicos. </li><li> Colocar em cada lamela de 35 mm numa caixa de Petri ou num poço numa placa de 6 poços. </li><li> Coloque o dispositivo de isolamento AXIS Axon na lamela e pressione delicadamente mas com firmeza com uma pinça com extremidades dobradas a fim de permitir a adesão completa entre o dispositivo de isolamento ea lamela de vidro. </li><li> Em cada câmara de cultura, pipeta 150 uL de poli-D-lisina (0,1 mg / ml em estéril, destilada H 2O). Colocar os dispositivos de microfluidos sob vácuo durante 5 minutos, a fim de remover todo o ar das câmaras de cultura. </li><li> Se o ar ainda pode ser visto dentro das câmaras, re-pipeta a solução de poli-D lisina para as câmaras. </li><li> Incubar os dispositivos com poli-D-lisina O / N a 37 ° C. </li><li> Lavar três vezes com câmaras estéreis, H2O destilada </li><li> Encha as câmaras com 150 ul de solução de trabalho laminina (Sigma-Aldrich, 5 ug / ml, em PBS ou meio isento de soro), e incubar O / N a 37 ° C. </li><li> Preparar 50 ml de meio de culturas de gânglios do trigémeo 37, composto como se segue: 48 ml de meio Neurobasal, 1 ml de B-27, 100 U de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, fator / ml de penicilina / 5 ng / mL de crescimento do nervo (NGF) , 12:25 citosina arabinósido. </li><li> Preparar 50 ml de meio de culturas de germe de dente 37, a seguinte composição: 40 ml de DMEM-F12, 10 ml de soro fetal bovino (FBS, concentração final: 20%), 100 U / ml de penicilina / estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 150 ug / ml de ácido ascórbico. </li></ol> 2. mouse Embryo Geração e Dissection <ol><li> Determinar a idade embrionária de acordo com plugue vaginal (plug vaginal: dia embrionária de desenvolvimento 0.5, E0.5) e confirmá-la através de critérios morfológicos. Para este protocolo, geralmente usamos embriões E14.5-E17.5 rato. </li><li> Limpe a área de dissecção eo estereoscópio com etanol 70%. </li><li> Sacrifique a mãe grávida via deslocamento cervical. Bloquear o pescoço do rato com o primeiro e segundo dedo dentro de uma grade, e puxar com a decisão da cauda. </li><li> Dissecar a pele ao redor do abdômen inferior, e abrir o abdômen com uma tesoura. Localize o útero: durante estas fases tardias da gravidez, o útero abundantemente encher a cavidade abdominal. </li><li> Dissecar o útero e coloque em um tubo cheio de PBS em gelo. Quando em gelo, o tecido pode ser deixado para várias horas. Descarte o cadáver da mãe de acordo com as diretrizes institucionais </li> &lt;li&gt; Dissecar os embriões do útero e libertá-los de seus tecidos extra-embrionário. Coloque os embriões em PBS em gelo. </li><li> Decapitar os embriões utilizando uma tesoura, e separar o maxilar inferior do resto da cabeça com uma tesoura de micro-dissecção (Figura 2A). Remover precisamente o maxilar inferior, sem danificar o gânglio trigeminal; em que esta última está localizada na proximidade da mandíbula inferior, o seu dano acidental é possível. Preservar a mandíbula e o resto da cabeça em PBS frio, em gelo. </li><li> Para dissecar TG, pegue a cabeça e colocá-lo em uma placa de Petri de vidro dissecação, anteriormente preenchido com PBS frio. Usando fórceps, remover a pele e o crânio. Remove então o telencéfalo e ao cerebelo, colocando uma pinça abaixo do telencéfalo e elevador; do telencéfalo e ao cerebelo vai virar em conjunto, deixando a parte inferior da cabeça exposta. </li><li> Localizar o gânglio trigeminal (mostrado na Figura 2B). Use a pinçapara separar o TG a partir dos nervos trigeminais. Elimine os restos das projeções do trigêmeo utilizando as agulhas de dissecação como facas. Inserir o TG dissecados numa caixa de Petri cheio com PBS frio e mantê-los em gelo. </li><li> Para dissecar dentes embrionárias, coloque a mandíbula inferior, previamente separado do crânio, sobre o vidro dissecção placa de Petri, cheio de frio PBS. Usando agulhas de dissecação como facas, retirar a língua ea pele ao redor da mandíbula. Separa-se o hemi-mandíbulas esquerdo e direito através do corte ao longo da linha média da mandíbula. Os germes dentários são facilmente visíveis, como mostrado na Figura 1C. Isolar os germes dentários utilizando agulhas de dissecação e remover o excesso de tecidos não dentais. Coloque os germes dentários dissecados em uma placa de Petri preenchido com PBS frio e mantê-los no gelo. </li></ol> 3. microfluídicos Co-culturas <ol><li> Após a dissecção, remova laminina a partir dos dispositivos microfluídicos. Encha as câmaras com 200 ul da respective mídia. </li><li> Com uma pinça, transferir suavemente os TG e dente germes dissecados nos orifícios criados por perfuração (Figura 1D). Certifique-se de que os germes dentários não flutuam e que eles afundam até que entre em contato com as lamelas. </li><li> Cultura as amostras em estufa a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Alterar o meio de cultura a cada 48 horas. Não esvaziar as câmaras completamente, e não pipetar diretamente para as câmaras de cultura. O esvaziamento completo de câmaras que resultam na formação de bolhas de ar no interior das câmaras; pipetagem direto para a câmara iria resultar em lesão axonal. Para evitar estes problemas, o meio de remover a pipeta apontando para o lado externo das cavidades; Do mesmo modo, pipetar o meio fresco no lado das cavidades localizadas de frente para as câmaras. </li><li> Durante o período de cultura, co-culturas podem ser facilmente visualizados por microscopia de lapso de tempo. Co-culturas pode ser mantida por mais de 10 dias. </li><li> Após a cultura period, lavar as câmaras por pipetagem de 150 ul de PBS por poço para uma câmara, e permitindo PBS fluir através das câmaras de três vezes. </li><li> Remover o PBS e fixar as amostras por pipetagem de 150 uL de paraformaldeído a 4% (em PBS) por poço em uma câmara; incubar à TA durante 15 min. </li><li> Lavam-se as câmaras duas vezes com PBS como descrito em 3.6. </li><li> Avançar com a análise. </li></ol>

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<li>Connor, R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+maxillary+factor%2C+a+maxillary+process-derived+chemoattractant+for+developing+trigeminal+sensory+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Identification of maxillary factor, a maxillary process-derived chemoattractant for developing trigeminal sensory axons.</a> Neuron. 24, 165-178 (1999).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Anterior estudos in vitro de inervação do dente foram baseados em co-culturas convencionais de gânglios do trigémeo e tecidos dentais ou células 26,28,29. Estes estudos foram conduzidos para investigar principalmente os efeitos atraentes dessas células ou tecidos em axônios sensitivos 38. Apesar de trazer avanços significativos no campo, várias questões técnicas foram levantadas. Germes dentários começar a degenerar após alguns dias de cultura 37. Com base nessas observações, os...

Inervação desempenha um papel chave no desenvolvimento, homeostase e regeneração de órgãos e tecidos 1,2. Além disso, a inervação está envolvido na regulação da proliferação de células estaminais, diferenciação e mobilização 3-5. Com efeito, estudos recentes realizados em tecidos do complexo orofacial têm mostrado que os nervos parassimpáticos são necessários para a função de células progenitoras epiteliais durante o desenvolvimento e regeneração das glândulas salivares 6,7. Da mesma forma, foi demonstrado que a inervação é necessário para o desenvolvimento e manutenção de paladar 8-11. Assim, é importante analisar as funções ainda negligenciadas de inervação no desenvolvimento de outros órgãos e tecidos orofaciais importantes, tais como os dentes. Apesar da rica inervação dos dentes adultos, e em contraste com todos os outros órgãos e tecidos do corpo, desendentes de ping começar a ser inervados nas primeiras fases pós-natais. Os dentes se desenvolvem como resultado de interações seqüenciais e recíprocas entre o ectoderma oral e cranial mesênquima derivado da crista neural. Estas interacções dar origem ao derivado ameloblastos-epiteliais e mesenquimais derivadas de odontoblastos que são responsáveis ​​pela formação do esmalte e dentina, respectivamente 12. Nervos sensoriais do gânglio trigeminal e nervos simpáticos do gânglio cervical superior inervam os dentes adulto 13-15. Durante a embriogênese, fibras nervosas que emana do projeto gânglios trigeminal para os germes dentários em desenvolvimento e, progressivamente, cercá-los, mas eles não penetram no mesênquima papila dentária 13. As fibras nervosas entrar no mesênquima polpa dental em estágios mais avançados de desenvolvimento que se correlacionam com diferenciação de odontoblastos e matriz dentinária deposição 16. Inervação polpa dentária é complETED logo após a erupção dos dentes na cavidade oral 13. Estudos anteriores revelaram que vários semaforinas e neurotrofinas estão envolvidos na regulação da inervação durante odontogenesis 16-19. Estudos anteriores demonstraram claramente que a inervação é um pré-requisito para a formação dos dentes em peixes 20. Estudos mais recentes têm mostrado que a homeostase das células-tronco mesenquimais dentária em incisivos de rato é regulada por nervos sensoriais através da secreção de sonic hedgehog (Shh) 21. No entanto, o papel da inervação em dente de iniciação, desenvolvimento e regeneração ainda é altamente controversa em mamíferos 22-24. Uma infinidade de estudos in vivo têm fornecido informações importantes sobre os padrões de inervação dos tecidos dentários durante os processos de vários modelos animais 13,25,26 desenvolvimento e reparação. No entanto, a maioria destes Approdores não são ideais para destacar a base molecular das interacções entre as fibras nervosas e os órgãos e tecidos alvo. Co-culturas constituem um método valioso para estudar e manipular as interacções entre as fibras nervosas e os dentes num ambiente controlado e isolado 26-29. Ao mesmo tempo, a co-cultura é sujeita a várias adaptações técnicas. Por exemplo, nervos e tecidos dentais específicos (por exemplo, polpa dentária, folículo dental, epitélio dental) muitas vezes requerem diferentes meios de cultura, a fim de garantir a sobrevivência do tecido por longos períodos de tempo de 30-32. Nas últimas décadas, co-culturas convencionais, utilizando o mesmo meio de cultura foram efectuadas por períodos muito curtos (por exemplo, dois dias) para investigar os efeitos atractivas ou repulsivas de desenvolvimento de tecidos orais e dentais em fibras nervosas sensoriais 27-29.No entanto, a extensão do período de cultura é necessária para investigar os efeitos da inervação na morfogénese e citodiferenciação dente, e para estudar a dinâmica de fibras nervosas de ramificação dentro de órgãos alvo. Portanto, não contíguas co-culturas seria mais apropriada para realizar estudos sobre as interacções de tecidos neuronais-dentário. Sistemas microfluidicos permitir co-culturas de neurónios e diferentes tipos de células no seu meio de cultura apropriado. Nestes dispositivos, os tecidos dentais e neurónios são separados em diferentes compartimentos, permitindo que o crescimento dos axónios dos corpos celulares neuronais através de microcanais para o compartimento que contém o seu tecido alvo 33. Microcanais têm já sido usadas para estudar as interacções entre neurónios e microglia 34,35, bem como de células para as interacções das células no cancro e neovascularização 35. Além disso, estes sistemas têm sido usados ​​para estudar as interacções entre dorsal gânglios da raiz e osteoblastos 36. Nós demonstramos recentemente que gânglios trigeminais (TG) e os dentes são capazes de sobreviver durante longos períodos de tempo quando co-cultivadas em microcanais 37. Além disso, demonstrámos que os dentes de diferentes estádios de desenvolvimento em manter estas condições in vitro, os mesmos efeitos repulsivos ou atractivos da inervação do trigémio que mostram in vivo 37. Este protocolo fornece informações sobre uma maneira simples, poderosa e flexível para co-cultura gânglios / nervos e tecidos-alvo e para estudar os papéis de moléculas específicas sobre tais interações em um ambiente controlado e isolado.

<table><tbody><tr><td>Dispositivos de isolamento de axônio AXIS</td><td>Millipore</td><td>AX15010-TC</td><td>Microcanais de diferentes comprimentos estão disponíveis</td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504</td><td></td></tr><tr><td>Mouse recombinante beta-NGF</td><td>R& D Systems</td><td>1156-NG-100</td><td>beta-NGF humano e rato (R& D Systems) são equivalentes</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr></tbody></table>

análise de desenvolvimento de dente germ innervation utilizar dispositivos microfluídicos co-cultura

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Inervação desempenha um papel chave no desenvolvimento, homeostase e regeneração de órgãos e tecidos. No entanto, os mecanismos subjacentes a esses fenômenos não são bem compreendidas ainda. Em particular, o papel de inervação no desenvolvimento e regeneração de dente é negligenciado. Vários estudos in vivo têm fornecido informações importantes sobre os padrões de inervação dos tecidos dentários durante os processos de vários modelos animais de desenvolvimento e reparação. No entanto, a maioria destas abordagens não são ideais para destacar a base molecular das interacções entre as fibras nervosas e os órgãos e tecidos alvo. Co-culturas constituem um método valioso para estudar e manipular as interacções entre as fibras nervosas e os dentes num ambiente controlado e isolado. Nas últimas décadas, co-culturas convencionais, utilizando o mesmo meio de cultura foram efectuadas por períodos muito curtos (por exemplo, dois dias)investigar os efeitos atractivas ou repulsivas de desenvolvimento de tecidos orais e dentais em fibras nervosas sensoriais. No entanto, a extensão do período de cultura é necessária para investigar os efeitos da inervação sobre a morfogénese do dente e citodiferenciação. Sistemas microfluidicos permitir co-culturas de neurónios e diferentes tipos de células no seu meio de cultura apropriado. Nós demonstramos recentemente que gânglios trigeminais (TG) e os dentes são capazes de sobreviver durante um longo período de tempo quando co-cultivadas em microcanais, e que eles se mantêm em estas condições o mesmo padrão de inervação que mostram in vivo. Nesta base, nós descrevemos como isolar e co-cultura em desenvolvimento e dos gânglios trigêmeo germes dentários em um protocolo de co-cultura microfluídicos system.This descreve uma forma simples e flexível para co-cultura gânglios / nervos e tecidos-alvo e para estudar os papéis moléculas de específicas sobre estas interacções em um controlled e ambiente isolado.

Estes resultados mostram que os gânglios do trigémeo isoladas podem crescer num compartimento do dispositivo de microfluidos e, além disso, que o desenvolvimento das bactérias isoladas de dentes é mantida por um longo período de tempo no outro compartimento do dispositivo de microfluidos. Diferentes meios de cultura são usados ​​nos dois compartimentos, e as micro-ranhuras entre os dois compartimentos de permitir a extensão do axónio do gânglio trigeminal no sentido de os germes de dentes em desenvolvimento. A F...

As coculturas representam um método valioso para estudar as interações entre os nervos e os tecidos e órgãos-alvo. Os sistemas microfluídicos permitem a co-cultura de gânglios e órgãos ou tecidos inteiros em desenvolvimento em diferentes meios de cultura, representando assim uma ferramenta valiosa para o estudo in vitro da interferência entre neurônios e seus alvos.

Análise de Desenvolvimento de dente Germ Innervation Utilizar dispositivos microfluídicos Co-cultura

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como isolar e co-cultivar os gânglios trigêmeos em desenvolvimento e os germes dentários. Isso é realizado primeiramente esterilizando, montando e revestindo os dispositivos microfluídicos. O segundo passo é dissecar os gânglios trigêmeos e os germes dentários de um estágio de desenvolvimento específico no camundongo de interesse.Em seguida, os gânglios trigêmeos e as gemas dentárias são colocados nos dispositivos microfluídicos e cultivados em co-cultura. O passo final consiste em fixar as células e corá-las utilizando imunofluorescência. Por fim, a microscopia é utilizada para mostrar o padrão de inervação resultante da co-cultura.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como as coculturas convencionais, é que este método permite a cocultura de diferentes órgãos e tecidos, cada um em seu meio de cultura ideal. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da inovação artificial, como o papel de diferentes moléculas na inovação dentária e a função da inovação no desenvolvimento dentário. Comece pela autoclavação das ferramentas de dissecação, que incluem um par de pinças de microdissecação e um par de tesouras.Em seguida, esterilize um lote de lamínulas de vidro de 24 milímetros por 24 milímetros colocando-as em uma solução de ácido clorídrico um molar em um agitador orbital a 37 graus Celsius por 24 horas. Lave então as lamínulas três vezes com água destilada estéril, seguido por três enxágues em etanol a 99%, seque-as sob uma cabine de fluxo estéril; quando secas, ligue a luz UV da cabine por 30 minutos. Em seguida, armazene as lamínulas em etanol a 70% até o momento de utilizá-las.Em seguida, use pin&ccedil;as est&eacute;reis para remover cuidadosamente os dispositivos microflu&iacute;dicos de isolamento de ax&ocirc;nios de suas embalagens e coloque-os em uma placa de Petri est&eacute;ril utilizando um punch est&eacute;ril de bi&oacute;psia de um mil&iacute;metro. Crie um orif&iacute;cio nos dispositivos para cada amostra, na correspond&ecirc;ncia das c&acirc;maras de cultura.Tenha cuidado para não furar muito próximo às micro-ranhuras, pois elas podem ser danificadas pela pressão. Em seguida, esterilize os dispositivos mergulhando-os em etanol 70%, tomando o cuidado de remover todo o ar aprisionado.Em seguida, remova os dispositivos do etanol e seque-os completamente sob uma cabine de fluxo estéril. Além disso, remova as lamínulas da solução de etanol a 70% e deixe-as secar sob a cabine de fluxo estéril. Aguarde no mínimo três horas antes de prosseguir.Coloque cada lamínula em um poço de uma placa de seis poços. Em seguida, posicione o dispositivo microfluídico sobre a lamínula e pressione suave, porém firmemente, com a pinça para permitir a adesão completa entre o dispositivo de isolamento e a lamínula de vidro. A seguir, pipete 150 microlitros de poli D-lisina a 0,1 miligrama por mililitro em cada uma das câmaras de cultura.Em seguida, coloque os dispositivos microfluídicos sob vácuo por cinco minutos para remover todo o ar das câmaras. Se ainda for possível observar ar no interior das câmaras, repita a adição da solução de poli-D-lisina nas câmaras.Incube os dispositivos com poli-L-lisina durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte. Lave as câmaras três vezes com água destilada estéril e, em seguida, preencha as câmaras com 150 microlitros de cinco microgramas por mililitro de solução de trabalho de laminina e incube-as durante a noite a 37 graus Celsius. Em seguida, prepare o meio para os cultivos de gânglios trigêmeos e de germe dentário conforme descrito no protocolo de texto acompanhante.Limpe a área de dissecação e o estereoscópio com etanol 70% e posicione os instrumentos de dissecação após o sacrifício. Disseque a pele ao redor do abdômen inferior de um camundongo prenhe com embriões entre as fases E 14,5 e E 17,5. Em seguida, abra cuidadosamente o abdômen usando tesoura.Localize o útero, remova-o e coloque-o em um tubo contendo gelo. Em PBS frio, dissecar os embriões e colocá-los individualmente em uma nova placa de Petri preenchida com PBS gelado. Após todos os embriões terem sido removidos dos tecidos extraembrionários, seccionar suas cabeças utilizando tesoura.Seccione a mandíbula inferior do restante da cabeça usando tesoura de microdissecção, tomando cuidado para não danificar os gânglios trigeminais. Em seguida, coloque a cabeça sobre uma placa de Petri de vidro resfriada. Utilize pinças para remover a pele e o crânio.Em seguida, posicione a pinça abaixo do cefalão e levante. Para remover o cefalão e o cerebelo, localize os gânglios trigêmeos e utilize a pinça e as agulhas de dissecação para separar os gânglios trigêmeos dos nervos trigêmeos e limpe os gânglios. Preserve-os em PBS frio, utilizando as agulhas de dissecação como se fossem facas.Remova a língua e a pele ao redor da mandíbula. Separe as hemimandíbulas esquerda e direita cortando ao longo da linha média da mandíbula. Em seguida, localize os germes dentários e isole-os usando agulhas de dissecação. Após a dissecação dos gânglios trigêmeos e dos germes dentários, remova a laminina dos dispositivos microfluídicos e preencha as câmaras com 200 microlitros do respectivo meio.Com pinça, transfira cuidadosamente os gânglios trigêmeos e os germes dentários dissecados para os orifícios criados com um punch de biópsia. Certifique-se de que os germes dentários não flutuem e que afundem até entrarem em contato com as lamínulas. Incube as amostras em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Substitua o meio de cultura a cada 48 horas durante 10 dias para trocar o meio. Primeiro, remova o meio direcionando a pipeta para o lado externo das cavidades. Em seguida, adicione o meio pré-aquecido fresco ao lado das cavidades localizado oposto às câmaras durante o período de cultura.Observe os cultivos em co-cultura a qualquer momento utilizando microscopia de luz. Após o período de cultivo, lave as câmaras pipetando 150 microlitros de PBS em um poço por câmara e permitindo que o PBS flua através das câmaras. Repita a lavagem um total de três vezes após a última lavagem.Remova o PBS e fixe as amostras pipetando 150 microlitros de paraformaldeído a 4% em PBS em um poço por câmara, permitindo que o reagente flua para a outra câmara. Incube o dispositivo à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, lave as câmaras duas vezes com PBS e prossiga com análises adicionais, como coloração por imunofluorescência e obtenção de imagens do crescimento celular.Durante a cultura de co-cultivo, neuritos dos gânglios trigeminais ramificam-se a partir do seu compartimento de cultura e estendem-se em direção ao germe dentário em desenvolvimento. Em maior aumento, pode-se observar os neuritos estendendo-se através das câmaras axonais e dos microcanais no dispositivo microfluídico. O progresso do crescimento nervoso pode ser monitorado ao longo do tempo para descrever o desenvolvimento da inovação.Após este procedimento, outros métodos como RNA ou PROTEINIZAÇÃO podem ser realizados para estudar, por exemplo, alterações na expressão gênica ou na secreção de proteínas nos tecidos-alvo após a inovação.

analysis-developing-tooth-germ-innervation-using-microfluidic-co

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este estudo descreve os procedimentos de criação de um axônio neuronal e romance (astro) glia plataforma de co-cultura. Neste sistema de co-cultura, a manipulação da interacção directa entre um único axónio (e única célula glial) torna-se possível, permitindo a análise mecanicista do neurónio mútuo de sinalização gliais.

Análise de imagens de Neuron Glia para Interação em Plataforma Cultura microfluídicos (MCP) baseado Axon Neuronal e Sistema Glia co-cultura

O vídeo demonstra a formação de junções neuromusculares usando um dispositivo microfluídico. As células precursoras neurais e as células progenitoras musculares são semeadas em diferentes poços dentro do dispositivo e deixadas para amadurecer em neurônios motores e miotubos, respectivamente. A criação de um gradiente de volume e químico leva ao desenvolvimento de junções neuromusculares ativas.

Gerando junções neuromusculares usando um dispositivo microfluídico

Este vídeo mostra uma técnica para estabelecer uma co-cultura de neurônios trigêmeos e células primárias da polpa dentária usando um filtro transwell. Nessa condição fisicamente separada, as células mesenquimais obtidas do tecido da polpa dentária secretam moléculas sinalizadoras parácrinas que atravessam os poros, promovendo a diferenciação e migração de neurônios em direção às células mesenquimais, estabelecendo um sistema de co-cultura.

Estabelecendo uma co-cultura de células da polpa dentária e neurônios do trigêmeo para comunicação cruzada

Este vídeo demonstra a utilização de um dispositivo microfluídico para estudar as interações entre a polpa germinativa do dente e os gânglios do trigêmeo. Ele mostra a colocação de tecidos dentro do dispositivo microfluídico e fornece uma visualização detalhada do crescimento do neurite trigêmeo em direção ao germe dentário através dos microsulcos do dispositivo. Além disso, destaca o papel dos fatores moleculares derivados do dente na promoção ou inibição da extensão do neurite para a polpa...

Análise das interações do germe dentário e dos gânglios do trigêmeo usando um sistema de co-cultura microfluídica

Este vídeo demonstra a avaliação da atividade elétrica neuronal em uma co-cultura de neurônios glutamatérgicos corticais derivados de hiPSC e células de glioma usando um dispositivo microfluídico com matrizes de multieletrodos.

Avaliação das interações entre neurônios glutamatérgicos e células de glioma em co-cultura

Aqui detalhamos um método para germes dentários cultura em fatias mandíbula usando um cortador de tecidos. Este método permite acesso exclusivo ao dente durante o desenvolvimento, proporcionando uma excelente oportunidade para a manipulação e linhagem de rastreamento, não está disponível através de métodos de cultura mais tradicionais.

O método de cultura fatia para acompanhar o desenvolvimento de germes dentários Em Explant Cultura

Protocolos para único neurônio microfluídicos arraying e mascaramento de água para a padronização dos revestimentos de biomateriais plasma em-chip são descritos. Altamente interligados co-cultura pode ser preparado através de entradas de células mínima.

Preparação de Neuronal co-culturas com precisão única célula

Descrevemos o isolamento, dispersão e revestimento de células primárias de polpa dentária (DP) com neurônios trigêmeos (TG) cultivados no topo de filtros transwell overover. As respostas celulares das células DP podem ser analisadas com imunofluorescência ou análise de RNA/proteína. A imunofluorescência dos marcadores neuronais com microscopia confocal permite a análise de respostas de crescimento neurite.

Um método de co-cultura para estudar o crescimento da neurita em resposta aos sinais de paracrina da polpa dentária

O método de cultura de órgãos do tipo Trowell tem sido usado para desvendar redes de sinalização complexas que governam o desenvolvimento dentário e, mais recentemente, para estudar a regulação envolvida nas células-tronco do incisivo de camundongos em crescimento contínuo. Modelos animais fluorescentes-repórteres e métodos de imagem ao vivo facilitam análises aprofundadas de células-tronco dentárias e seu microambiente de nicho específico.

Uso da cultura de órgãos do tipo Trowell para estudar a regulação de células-tronco dentárias

Trabalhos recentes revelam o impacto neuronal em células de glioma pediátrico de alto grau (pHGG) e suas interações recíprocas. O presente trabalho mostra o desenvolvimento de um modelo in vitro co-culminando células pHGG e neurônios glutamatergicos e registrou suas interações eletrofisiológicas para imitar essas interatividades.

Co-cultura de neurônios glutamatergicos e células glioma pediátricas de alto grau em dispositivos microfluidos para avaliar interações elétricas

neuroHuMiX é um modelo avançado de gut-on-a-chip para estudar as interações de células bacterianas, epiteliais e neuronais sob condições de co-cultura proximal e representativa. Este modelo permite desvendar os mecanismos moleculares subjacentes à comunicação entre o microbioma intestinal e o sistema nervoso.

Um modelo Gut-on-a-Chip para estudar o eixo microbioma intestinal-sistema nervoso

Aprenda a isolar e co-cultivar gânglios trigeminais e germes dentários em desenvolvimento usando dispositivos microfluídicos. Este método permite visualizar padrões de inervação neuronal e estudar interações entre nervos e tecidos-alvo em biologia do desenvolvimento.

Análise de Desenvolvimento de dente Germ Innervation Utilizar dispositivos microfluídicos Co-cultura

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