Análise de Desenvolvimento de dente Germ Innervation Utilizar dispositivos microfluídicos Co-cultura

O objetivo geral deste procedimento é mostrar como isolar e co-cultivar os gânglios do trigêmeo em desenvolvimento e os germes dentários. Isso é feito primeiro esterilizando, montando e revestindo os dispositivos microfluídicos. O segundo passo é dissecar os gânglios do trigêmeo e os germes dentários de um estágio específico de desenvolvimento no camundongo de interesse.

Em seguida, os gânglios do trigêmeo e os germes dentários são colocados nos dispositivos microfluídicos e co-cultivados. A etapa final é fixar as células e corá-las usando imunofluorescência. Em última análise, a microscopia é usada para mostrar o padrão de inervação que é o resultado da co-cultura.

A principal vantagem desta técnica dos métodos existentes, como as coculturas convencionais, é que este método permite a cocultura de diferentes órgãos e tecidos, cada um em sua própria cultura ideal. Média. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da inovação artificial, como o papel de diferentes moléculas na inovação dentária e a regra da inovação no desenvolvimento dentário. Comece autoclavagem de ferramentas de dissecação, que incluem um par de pinças de microdissecção e uma tesoura.

Em seguida, esterilize um lote de lamínulas de vidro de 24 milímetros por 24 milímetros, colocando-as em uma solução de ácido clorídrico molar em um agitador orbital a 37 graus Celsius por 24 horas. Em seguida, lave as lamínulas três vezes com água destilada estéril, seguidas de três enxágues em etanol a 99%, seque-as sob uma coifa de fluxo estéril depois de secas, acenda a luz UV da coifa por 30 minutos. Em seguida, armazene as lamínulas em etanol 70% até que sejam necessárias.

Em seguida, use uma pinça estéril para remover cuidadosamente os dispositivos microfluídicos de isolamento de axônio de sua embalagem e coloque-os em uma placa de Petri estéril usando um punção de biópsia estéril de um milímetro. Crie um orifício nos dispositivos para cada amostra. Em correspondência das câmaras de cultura.

Tenha cuidado para não perfurar muito perto das micro ranhuras, pois elas podem ser danificadas pela pressão. Em seguida, esterilize os dispositivos emergindo-os em etanol 70%. Tomando cuidado para remover todo o ar preso.

Em seguida, remova os dispositivos do etanol e seque-os completamente sob uma capela de fluxo estéril. Além disso, remova as lamínulas da solução de etanol a 70% e deixe-as secar sob a coifa de fluxo estéril. Aguarde no mínimo três horas antes de prosseguir.

Coloque cada lamínula em um poço dentro de uma placa de seis poços. Em seguida, coloque o dispositivo microfluídico na lamínula e pressione suavemente, mas com firmeza, com a pinça para permitir a adesão total entre o dispositivo de isolamento e a lamínula de vidro. Em seguida, pipete 150 microlitros de 0,1 miligramas por mililitro, poli D licina em cada uma das câmaras de cultura.

Em seguida, coloque os dispositivos microfluídicos sob vácuo por cinco minutos para remover todo o ar das câmaras. Se o ar ainda pode ser visto dentro das câmaras. Repete a solução de poli D lisina nas câmaras.

Incube os dispositivos com poli de lisina durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte. Lave as câmaras três vezes com água destilada estéril e, em seguida, encha as câmaras com 150 microlitros de cinco microgramas por mililitro, solução de trabalho laminada e incube-as durante a noite a 37 graus Celsius. Em seguida, repare os meios para os gânglios do trigêmeo e as culturas de germes dentários, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.

Limpe a área de dissecção e o estereoscópio com etanol 70% e coloque os instrumentos de dissecção após o sacrifício. Dissecar a pele ao redor do abdômen inferior de um camundongo prenhe com embriões de camundongo estágio E 14.5 a E 17.5. Em seguida, abra cuidadosamente o abdômen usando uma tesoura.

Localize o útero, remova-o e coloque-o em um tubo cheio de gelo. PBS frio dissecar os embriões e colocá-los individualmente em uma nova placa de Petri cheia de PBS gelado. Depois que todos os embriões forem removidos dos tecidos embrionários extras, decapite-os com uma tesoura.

Separe a mandíbula inferior do resto da cabeça usando micro dissecção, tesoura, tomando cuidado para não danificar os gânglios do trigêmeo. Em seguida, pegue a cabeça e coloque-a em uma placa de Petri de vidro de dissecção resfriada. Use uma pinça para remover a pele e o crânio.

Em seguida, coloque uma pinça abaixo do céfalo e levante. Para remover o céfalo e o cerebelo, localize os gânglios do trigêmeo e use a pinça e as agulhas de dissecção para separar os gânglios do trigêmeo dos nervos do trigêmeo e limpar os gânglios. Preserve-os em PBS frio usando agulhas de dissecação como facas.

Remova a língua e a pele ao redor da mandíbula. Separe as hemimandíbulas esquerda e direita cortando ao longo da linha média da mandíbula. Em seguida, localize os germes dentários e isole-os usando agulhas de dissecção após a dissecção dos gânglios do trigêmeo e dos germes dentários, remova a laminina dos dispositivos microfluídicos e encha as câmaras com 200 microlitros dos respectivos meios.

Com uma pinça, transfira suavemente os gânglios do trigêmeo dissecados e os germes dentários para os orifícios criados com um punção de biópsia. Certifique-se de que os germes dentários não flutuem e que afundem até entrarem em contato com as lamínulas. Cultura, as amostras em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Troque o meio de cultura a cada 48 horas por 10 dias para trocar o meio. Primeiro, remova o meio apontando a pipeta para o lado externo dos poços. Em seguida, adicione o meio pré-aquecido fresco no lado das entranhas localizado oposto às câmaras durante o período de cultura.

Fotografe as coculturas a qualquer momento usando microscopia de luz. Após o período de cultura, lave as câmaras pipetando 150 microlitros de PBS em um poço por câmara e deixando o PBS fluir pelas câmaras. Repita a lavagem um total de três vezes após a última lavagem.

Remova o PBS e fixe as amostras pipetando 150 microlitros de aldeído paraforme a 4% em PBS em um poço por câmara e permitindo que ele flua para a outra câmara. Incube o dispositivo em temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, lave as câmaras duas vezes com PBS e prossiga com análises adicionais, como coloração imunofluorescente e imagem do crescimento.

Durante a cultura do carvão, os neuritos dos gânglios do trigêmeo se ramificam de seu compartimento de cultura e se estendem em direção ao germe dentário em desenvolvimento. Em uma ampliação maior, pode-se ver os neuritos se estendendo através das câmaras axonais e dos microsulcos no dispositivo microfluídico. O progresso do crescimento do nervo pode ser rastreado ao longo do tempo para descrever o desenvolvimento da inovação.

Após este procedimento, outros métodos como RNA ou PROTEINIZAÇÃO podem ser realizados para estudar, por exemplo, alterações na expressão gênica ou secreção de proteínas nos tecidos-alvo após a inovação.