Análise de Desenvolvimento de dente Germ Innervation Utilizar dispositivos microfluídicos Co-cultura

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como isolar e co-cultivar os gânglios trigêmeos em desenvolvimento e os germes dentários. Isso é realizado primeiramente esterilizando, montando e revestindo os dispositivos microfluídicos. O segundo passo é dissecar os gânglios trigêmeos e os germes dentários de um estágio de desenvolvimento específico no camundongo de interesse.

Em seguida, os gânglios trigêmeos e as gemas dentárias são colocados nos dispositivos microfluídicos e cultivados em co-cultura. O passo final consiste em fixar as células e corá-las utilizando imunofluorescência. Por fim, a microscopia é utilizada para mostrar o padrão de inervação resultante da co-cultura.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como as coculturas convencionais, é que este método permite a cocultura de diferentes órgãos e tecidos, cada um em seu meio de cultura ideal. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da inovação artificial, como o papel de diferentes moléculas na inovação dentária e a função da inovação no desenvolvimento dentário. Comece pela autoclavação das ferramentas de dissecação, que incluem um par de pinças de microdissecação e um par de tesouras.

Em seguida, esterilize um lote de lamínulas de vidro de 24 milímetros por 24 milímetros colocando-as em uma solução de ácido clorídrico um molar em um agitador orbital a 37 graus Celsius por 24 horas. Lave então as lamínulas três vezes com água destilada estéril, seguido por três enxágues em etanol a 99%, seque-as sob uma cabine de fluxo estéril; quando secas, ligue a luz UV da cabine por 30 minutos. Em seguida, armazene as lamínulas em etanol a 70% até o momento de utilizá-las.

Em seguida, use pinças estéreis para remover cuidadosamente os dispositivos microfluídicos de isolamento de axônios de suas embalagens e coloque-os em uma placa de Petri estéril utilizando um punch estéril de biópsia de um milímetro. Crie um orifício nos dispositivos para cada amostra, na correspondência das câmaras de cultura.

Tenha cuidado para não furar muito próximo às micro-ranhuras, pois elas podem ser danificadas pela pressão. Em seguida, esterilize os dispositivos mergulhando-os em etanol 70%, tomando o cuidado de remover todo o ar aprisionado.

Em seguida, remova os dispositivos do etanol e seque-os completamente sob uma cabine de fluxo estéril. Além disso, remova as lamínulas da solução de etanol a 70% e deixe-as secar sob a cabine de fluxo estéril. Aguarde no mínimo três horas antes de prosseguir.

Coloque cada lamínula em um poço de uma placa de seis poços. Em seguida, posicione o dispositivo microfluídico sobre a lamínula e pressione suave, porém firmemente, com a pinça para permitir a adesão completa entre o dispositivo de isolamento e a lamínula de vidro. A seguir, pipete 150 microlitros de poli D-lisina a 0,1 miligrama por mililitro em cada uma das câmaras de cultura.

Em seguida, coloque os dispositivos microfluídicos sob vácuo por cinco minutos para remover todo o ar das câmaras. Se ainda for possível observar ar no interior das câmaras, repita a adição da solução de poli-D-lisina nas câmaras.

Incube os dispositivos com poli-L-lisina durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte. Lave as câmaras três vezes com água destilada estéril e, em seguida, preencha as câmaras com 150 microlitros de cinco microgramas por mililitro de solução de trabalho de laminina e incube-as durante a noite a 37 graus Celsius. Em seguida, prepare o meio para os cultivos de gânglios trigêmeos e de germe dentário conforme descrito no protocolo de texto acompanhante.

Limpe a área de dissecação e o estereoscópio com etanol 70% e posicione os instrumentos de dissecação após o sacrifício. Disseque a pele ao redor do abdômen inferior de um camundongo prenhe com embriões entre as fases E 14,5 e E 17,5. Em seguida, abra cuidadosamente o abdômen usando tesoura.

Localize o útero, remova-o e coloque-o em um tubo contendo gelo. Em PBS frio, dissecar os embriões e colocá-los individualmente em uma nova placa de Petri preenchida com PBS gelado. Após todos os embriões terem sido removidos dos tecidos extraembrionários, seccionar suas cabeças utilizando tesoura.

Seccione a mandíbula inferior do restante da cabeça usando tesoura de microdissecção, tomando cuidado para não danificar os gânglios trigeminais. Em seguida, coloque a cabeça sobre uma placa de Petri de vidro resfriada. Utilize pinças para remover a pele e o crânio.

Em seguida, posicione a pinça abaixo do cefalão e levante. Para remover o cefalão e o cerebelo, localize os gânglios trigêmeos e utilize a pinça e as agulhas de dissecação para separar os gânglios trigêmeos dos nervos trigêmeos e limpe os gânglios. Preserve-os em PBS frio, utilizando as agulhas de dissecação como se fossem facas.

Remova a língua e a pele ao redor da mandíbula. Separe as hemimandíbulas esquerda e direita cortando ao longo da linha média da mandíbula. Em seguida, localize os germes dentários e isole-os usando agulhas de dissecação. Após a dissecação dos gânglios trigêmeos e dos germes dentários, remova a laminina dos dispositivos microfluídicos e preencha as câmaras com 200 microlitros do respectivo meio.

Com pinça, transfira cuidadosamente os gânglios trigêmeos e os germes dentários dissecados para os orifícios criados com um punch de biópsia. Certifique-se de que os germes dentários não flutuem e que afundem até entrarem em contato com as lamínulas. Incube as amostras em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Substitua o meio de cultura a cada 48 horas durante 10 dias para trocar o meio. Primeiro, remova o meio direcionando a pipeta para o lado externo das cavidades. Em seguida, adicione o meio pré-aquecido fresco ao lado das cavidades localizado oposto às câmaras durante o período de cultura.

Observe os cultivos em co-cultura a qualquer momento utilizando microscopia de luz. Após o período de cultivo, lave as câmaras pipetando 150 microlitros de PBS em um poço por câmara e permitindo que o PBS flua através das câmaras. Repita a lavagem um total de três vezes após a última lavagem.

Remova o PBS e fixe as amostras pipetando 150 microlitros de paraformaldeído a 4% em PBS em um poço por câmara, permitindo que o reagente flua para a outra câmara. Incube o dispositivo à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, lave as câmaras duas vezes com PBS e prossiga com análises adicionais, como coloração por imunofluorescência e obtenção de imagens do crescimento celular.

Durante a cultura de co-cultivo, neuritos dos gânglios trigeminais ramificam-se a partir do seu compartimento de cultura e estendem-se em direção ao germe dentário em desenvolvimento. Em maior aumento, pode-se observar os neuritos estendendo-se através das câmaras axonais e dos microcanais no dispositivo microfluídico. O progresso do crescimento nervoso pode ser monitorado ao longo do tempo para descrever o desenvolvimento da inovação.

Após este procedimento, outros métodos como RNA ou PROTEINIZAÇÃO podem ser realizados para estudar, por exemplo, alterações na expressão gênica ou na secreção de proteínas nos tecidos-alvo após a inovação.