Análise das interações do germe dentário e dos gânglios do trigêmeo usando um sistema de co-cultura microfluídica

Pegue um dispositivo microfluídico revestido com um polímero sintético e uma proteína de adesão.

O dispositivo consiste em poços e câmaras de cultura interconectadas separadas por microranhuras.

As câmaras contêm orifícios perfurados para colocação de tecidos.

Obtenha os gânglios do trigêmeo, uma coleção de corpos celulares de neurônios trigêmeos e germes dentários, estruturas pré-natais que se desenvolvem em dentes adultos, de um embrião de camundongo.

Coloque os tecidos nos orifícios e adicione os respectivos meios de cultura.

Nutrientes e vitaminas no meio do gérmen dentário facilitam a sobrevivência do gérmen dentário durante a cultura.

A superfície do dispositivo revestido e os fatores de crescimento nos meios dos gânglios do trigêmeo facilitam o crescimento de neuritos e axônios.

Os axônios alcançam a câmara germinativa do dente através dos microsulcos.

Os sinais derivados do dente levam à repulsão neuronal, permitindo que os axônios circundem o germe do dente sem inervar

Lave as câmaras de cultura com tampão e fixe os tecidos com um fixador.

A co-cultura está agora pronta para uma análise mais aprofundada.

Após a dissecção dos gânglios do trigêmeo e dos germes dentários, remova a laminina dos dispositivos microfluídicos e encha as câmaras com 200 microlitros dos respectivos meios. Com uma pinça, transfira suavemente os gânglios do trigêmeo dissecados e os germes dentários para os orifícios criados com um punção de biópsia. Certifique-se de que os germes dentários não flutuem e que afundem até entrarem em contato com as lamínulas.

Cultive as amostras em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Troque o meio de cultura a cada 48 horas por 10 dias. Para trocar o meio, primeiro remova o meio apontando a pipeta para o lado externo dos poços. Em seguida, adicione o meio fresco pré-aquecido na lateral dos poços localizados em frente às câmaras.

Durante o período de cultura, imagine as co-culturas a qualquer momento usando microscopia de luz. Após o período de cultura, lave as câmaras pipetando 150 microlitros de PBS em um poço por câmara e deixando o PBS fluir pelas câmaras. Repita a lavagem um total de três vezes.

Após a última lavagem, remova o PBS e fixe as amostras pipetando 150 microlitros de paraformaldeído a 4% em PBS em um poço por câmara e permitindo que ele flua para a outra câmara. Incube o dispositivo em temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, lave as câmaras duas vezes com PBS e prossiga com análises adicionais, como coloração por imunofluorescência e imagem do crescimento.