Estudar mitocondrial estrutura e função em Drosophila ovários

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar métodos para estudar a estrutura e função mitocondrial em tecido vivo e fixo no organismo modelo drosophila melanogaster. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da Biologia Mitocondrial. Como os mecanismos regulatórios da função mitocondrial.

A principal vantagem dessa técnica é que ela realiza análises detalhadas da relação estrutura/função mitocondrial. Depois de separar cinco moscas fêmeas anestesiadas de acordo com o protocolo de texto, sob o microscópio de dissecação, use dois pares de pinças para separar o tórax do abdômen. Em seguida, transfira cuidadosamente o abdômen para o segundo poço do prato.

Usando um par de pinças para segurar o abdômen na extremidade posterior, use o outro par de pinças para empurrar lentamente os ovários para fora. Em seguida, use a pinça para segurar um ovário individual pela extremidade posterior opaca e mova-o cuidadosamente para o terceiro poço do prato para provocar ou fixar. Provoque cuidadosamente a bainha protetora ao redor dos ovários, usando um par de pinças para segurar a extremidade posterior e varrendo levemente uma agulha provocante da extremidade posterior para a anterior.

Para preparar câmaras revestidas de poliliseno, coloque duas gotas separadas de 20 microlitros de polilisene na lamínula de uma placa de Petri com fundo de vidro. Seque as placas ao ar a 37 graus Celsius por uma hora e contorne a polilisina na parte inferior da placa. Defina os parâmetros de varredura no microscópio confocal abrindo o software de aquisição de imagem e, na guia de aquisição, defina os parâmetros de varredura apropriados.

Marque as caixas de séries temporais, branqueamento e regiões para abrir as guias individuais. Em seguida, insira os valores de parâmetro de aquisição apropriados em cada guia. Em seguida, coloque um ovário dissecado e provocado em uma região revestida de polilisina marcada e use uma agulha provocadora para espalhar o ovário e separar os ovarials.

Coloque uma gota de 10 microlitros de meio dissecante de inseto em cima do ovário, certificando-se de cobrir toda a área revestida de polilisina. Em seguida, cubra a placa de Petri. Imediatamente após a montagem do ovário, coloque a amostra no microscópio e use a ocular para localizar rapidamente o campo de interesse no tecido vivo.

Clique em tempo real para adquirir uma imagem em tempo real do campo de interesse selecionado e, em seguida, clique em parar para interromper a digitalização em tempo real. Se necessário, ajuste os parâmetros de aquisição para que o sinal fluorescente detectado fique abaixo dos níveis de saturação com o fundo definido conforme definido, ajustando os valores de deslocamento. Na guia gráfica, use a ferramenta de desenho de bézier para desenhar um pequeno ROI para demarcar a zona de branqueamento da foto na imagem adquirida pela digitalização.

Em seguida, execute a aquisição de imagens, clicando em iniciar experimento. Para realizar a coloração viva com corantes mitocondriais fluorescentes, diluir o estoque de corantes em meio de dissecação quente até as concentrações finais de trabalho. Depois que a dissecção e a provocação forem demonstradas anteriormente, coloque os ovários em 200 microlitros de solução de coloração em um poço de uma placa de dissecação.

Cubra o prato com uma caixa embrulhada em papel alumínio para protegê-lo da luz e incube o tecido por 10 minutos. Em seguida, lave os ovários corados usando uma pinça para movê-los cuidadosamente para três poços consecutivos contendo meio sem mancha. Para a coloração conjunta com TMRE, na coloração mitocondrial global compatível, efectuar primeiro a coloração com TMRE e, em seguida, sem lavar o tecido, transferir imediatamente a amostra para a coloração mitocondrial global.

Depois de lavar e montar os ovários, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo, para realizar imagens confocais na amostra, marque a caixa de corte z para abrir a guia. Gire a roda de foco em direção à parte inferior da amostra enquanto ela está sendo digitalizada ao vivo e clique em definir primeiro para definir a seção z mais inferior. Em seguida, mova a roda de foco na direção oposta para definir a seção superior.

Execute a aquisição de imagens clicando em iniciar experimento. No caso de xvivamicroscopia ao vivo, os dados devem ser obtidos dentro de 15 minutos após a montagem do tecido, caso contrário, os resultados experimentais podem ser afetados por alterações fisiológicas devido à morte do tecido. Imediatamente após a dissecção sob uma capela de exaustão, coloque os ovários em 200 microlitros de PFA fresco em temperatura ambiente no poço de uma placa de dissecação de vidro.

Incube o tecido por 15 minutos para fixá-lo. Depois de lavar os ovários em PBS de acordo com o protocolo de texto, ainda em PBS, provoque os ovários para remover cuidadosamente a bainha de fibra protetora que pode dificultar o acesso ao antígeno do anticorpo. Permeabilize os ovários provocados colocando-os em um tubo de microfusível com 500 microlitros de 0,5% de tritan x 100 em PBS.

Em seguida, coloque o tubo em uma caixa coberta e coloque para balançar a 25 RPM por 30 minutos. Remova o PBS / TX de acordo com o protocolo de texto, bloqueie o tecido adicionando 200 microlitros de BSA dissolvido em 0,5% de PBS / TX. Incube as amostras no balancim em temperatura ambiente por uma hora.

Depois de remover a solução de bloqueio, adicione anticorpos anti-desicilina E anti-raivosa e anti-ATPB de camundongo. Incube o tecido no balancim em temperatura ambiente por duas horas. Após a incubação, use PBS-TX para lavar os ovários três vezes por 15 minutos cada.

Em seguida, adicione 200 microlitros dos anticorpos secundários apropriados e PBS-TX fresco e incube em temperatura ambiente por uma hora. Depois de lavar o lenço duas vezes, adicione ganchos à terceira lavagem. Em seguida, com uma micropipeta de um mililitro, remova os ovários imunocorados do tubo de microfusão para um poço fresco de uma placa de dissecação de vidro contendo 200 microlitros de PBS.

Adicione uma gota de meio de montagem à base de glicerol a uma lâmina de vidro e adicione os ovários imunocorados um a um ao meio de montagem. Sob um microscópio de dissecação, enquanto segura a porção opaca do ovário com uma pinça, use uma agulha provocadora para arrancar suavemente os ovariais transparentes das câmaras opacas dos óvulos maduros. Em seguida, remova as câmaras de ovos maduros do meio de montagem.

Coloque uma lamínula na corrediça e pressione levemente para garantir que o meio de montagem se espalhe uniformemente. Seque as amostras ao ar por 15 minutos antes de usar o esmalte para selar as bordas. Finalmente, realize a microscopia confocal conforme necessário.

Como mostrado aqui, o flip direcionado a uma das nuvens mitocondriais associadas às células nerse leva a uma perda superior a 50% do sinal fluorescente das ROIs azuis e brancas ao redor da ROI de flip vermelho em 200 segundos, enquanto a ROI de controle amarela é minimamente branqueada. Os ovários de drosófila exibiram uma diminuição no sinal com a profundidade do tecido, e é importante discernir a profundidade máxima do tecido dentro da qual os floróforos, como TMRE e mitostain, podem ser detectados durante a imagem ao vivo. Uma análise qualitativa da co-coloração com TMRE e a coloração mitocondrial geral mostra que o germário drisófila exibe maior potencial mitocondrial por unidade de massa no estágio 2B.

Nesta figura, a análise semiqualitativa demonstra a diferença no potencial mitocondrial por unidade de massa entre AFCs e MBCs, conforme analisado a partir de uma câmara de ovos de estágio 9. Essas imagens revelam que a captação de mitosox ocorre nas células foliculares mitóticas e pós-mitóticas da drisophilla. Neste experimento, a coloração co-imunológica identifica o sinal elevado de desciclina sobreposto ao sinal mitocondrial ATPB e aos clones de nole DRP1 negativos para GFP no germânio e em uma câmara de ovos de estágio 9.

Os métodos descritos podem ser modificados e empregados para estudar a função da estrutura mitocondrial em outros tecidos de drisófila. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar, corar e obter imagens de ovários de drisófila fixos e vivos para estudar a estrutura e função mitoconrial.