Name: Estudar mitocondrial estrutura e função em Drosophila ovários (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprenda métodos para analisar estrutura e função mitocondrial em tecidos vivos e fixos de Drosophila melanogaster. Esta técnica permite estudar mecanismos regulatórios da funcionalidade mitocondrial em biologia celular.

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Agradecemos a Leena Patel e Diamond Woodard por ajudarem na preparação do meio Drosophila e ao Dr. Igor Chesnokov por fornecer acesso ao estereomicroscópio acoplado à câmera.

<ol><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li>
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<li>Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+4%2C+Analysis+of+mitochondrial+dynamics+and+functions+using+imaging+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter. , 21-21 (2010).</li>
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<li>Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defects+in+mitochondrial+axonal+transport+and+membrane+potential+without+increased+reactive+oxygen+species+production+in+a+Drosophila+model+of+Friedreich+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia.</a> J Neurosci. 30 (34), 11369-11378 (2010).</li>
<li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation%3A+another+inconvenient+truth%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).</li>
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<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+cell+cycle+progression+during+development+as+revealed+by+the+tenured+mutation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila.</a> Dev Cell. 9 (6), 843-854 (2005).</li>
<li>Tipping, M., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+context-dependent+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis.</a> J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2014).</li>
<li>Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+in+Drosophila%3A+Imaginal+Discs+as+a+Model+for+Epithelial+Tumor+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation.</a> Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).</li>
<li>Pandey, U. B., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+disease+models+in+Drosophila+melanogaster+and+the+role+of+the+fly+in+therapeutic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery.</a> Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Passos críticos dentro do Protocolo Fotodegradação: Prevenção de fotodegradação indevida de amostras fluorescentes é absolutamente necessário para a realização de microscopia confocal eficiente. Portanto, o tempo usado para localizar amostras através da ocular ou para definir os parâmetros de aquisição de imagem através do modo de varredura ao vivo deve ser minimizado para minimizar a fotodegradação. O dano tecidual: Uma vez que as mitocôn...

As mitocôndrias são classicamente descritos como a potência celular, uma vez que eles são os principais lugares de produção de energia em células diferenciadas. Além disso, as mitocôndrias desempenham um papel crítico no metabolismo, a geração de calor, a modificação lipídica, o cálcio e homeostase redox, a orquestração de processos de sinalização de células, etc 1. As mitocôndrias desempenham também um papel activo na indução de morte celular 2, bem como na regulação do ciclo celular 3. Essa multifuncionalidade levanta as seguintes questões fundamentais: a) como mitocôndrias desempenhar todas estas funções em simultâneo e b) existem piscinas mitocondriais específicos ou subzonas que são especializados para funções distintas? Neste contexto, é importante notar que as mitocôndrias são multifuncionais dinâmica na sua forma, tamanho e estrutura dentro das células individuais e que a forma de estado estacionário de mitocôndrias pode variar entre os tipos de células. Décadas de pesquisa de vários laboratóriooratórios sugerem que a alteração da forma mitocondrial, tamanho e estrutura, chamados coletivamente de dinâmica mitocondrial, é crucial para a manutenção de várias funções mitocondriais 4,5,6. Estes resultados levantam a possibilidade de que mitocôndrias podem cumprir a sua multi-funcionalidade em virtude do seu dinamismo estrutural. grandes esforços estão em curso para entender a relação estrutura-função mitocondrial. A dinâmica da estrutura mitocondrial é mantida principalmente pela sua capacidade de sofrer eventos de fissão e de fusão com o outro. Fissão de grandes mitocôndrias converte-os em elementos mitocondriais menores, enquanto a fusão entre duas mitocôndrias menores funde-os em um elemento mitocondrial maior 7. Além disso, a fusão de duas mitocôndrias transiente pode ocorrer para permitir a mistura do seu conteúdo. Os eventos de fissão e de fusão das membranas mitocondriais interior e exterior são cuidadosamente regulada pela especificaçãoific conjuntos de proteínas. A maquinaria do núcleo fissão é composto de proteína relacionada com dinamina 1 (Drp1), que é recrutados a partir do citosol para a mitocôndria pela sua interacção com certos bona proteínas mitocondriais fide (por exemplo, Fis1 ou Mff1), enquanto função Drp1 também pode ser regulado por outras proteínas na superfície mitocondrial 4. Embora Drp1 opera na membrana externa, as suas capacidades de fissão impacto da membrana interior assim. A orquestração da cisão das membranas mitocondriais exteriores e interiores não é bem compreendido. Por outro lado, a fusão da membrana interna é regulada no núcleo pelas actividades de OPA1, enquanto mitofusins governar a fusão da membrana externa 5. O saldo das contrariando fissão e fusão eventos de mitocôndrias ditar a forma mitocondrial steady-state em uma célula. Por exemplo, a repressão da fissão mitocondrial resultaria em fusão completa e sem oposição, enquanto que a sobre-actividade das mitocôndriasl fissão resultaria em fragmentação da mitocôndria 3. O estudo da relação estrutura-função mitocondrial envolve principalmente duas abordagens complementares: a) análise dos fenótipos celulares e organismais após a manipulação genética de proteínas fissão / fusão mitocondrial e b) as avaliações diretas de estrutura e função mitocondrial. É digno de nota que as análises genéticas podem nem sempre revelar a funcionalidade directa da molécula no lado (neste caso, as proteínas de fissão / fusão mitocondriais), como os fenótipos podem surgir devido a efeitos secundários. Portanto, é de extrema importância para desenvolver e usar ferramentas para estudar a estrutura e função mitocondrial diretamente. Qualquer avaliação da estrutura mitocondrial envolve várias ferramentas de microscopia. Uso de microscopia de fluorescência de células vivas tem avançado muito nos estudos de dinâmica mitocondrial, uma vez que o dinamismo mitocondrial pode ser monitorado de forma qualitativa e Quantitätvamente utilizando as ferramentas e técnicas apropriadas 8 de microscopia de fluorescência. Ferramentas com base em microscopia de fluorescência foram desenvolvidos para estudar a estrutura e a função mitocondrial em tecidos vivos e fixos de Drosophila melanogaster, elucidar a importância de dinamismo mitocondrial in vivo 9. Estes e os métodos relacionados são descritos aqui, com o objectivo de estudar a estrutura e a função mitocondrial no ovário de Drosophila. O ovário Drosophila consiste em germinativas e somáticas linhagens, que surgem a partir de suas respectivas células-tronco adultas que residem no germário 10,11. Dezesseis células germinativas sincicial (GCs) se encapsulado por células do folículo somáticas (FCS) para formar câmaras de ovos individuais que emergem fora do germário (Figura 1). Um dos 16 GCs se comprometeu a tornar-se um oócito, e os restantes 15 GCs desenvolvem em células enfermeira que suportam o crescimento da câmara de oócito, Facilitando a maturação do ovo, antes de ser colocado. A maioria dos CFs submetidos a 9 ciclos de divisões mitóticas antes de sair do ciclo celular mitótico para diferenciar terminalmente em uma camada de células epiteliais modelado que consiste de células anterior dos folículos (AFCs), células foliculares posterior (PFC), e as células do corpo principal (CBMs) . As câmaras de ovo consecutivos são ligados por células haste, que são células que são também derivados das CFs no início do desenvolvimento diferenciadas. Forma mitocondrial regulado pelo Drp1 proteína fissão mitocondrial está ativamente envolvido no processo de diferenciação durante o desenvolvimento normal da camada FC ovário Drosophila 9,12. Os métodos utilizados nestes estudos para identificar o envolvimento de Drp1 em Drosophila desenvolvimento da camada de células do folículo são descritos aqui.

<table><tbody><tr><td>Grace's Media (Meio de Dissecção de Insetos)</td><td>Fisher Scientific</td><td>30611031-2</td><td></td></tr><tr><td>41 Paraformaldeído AQ</td><td>Electronic Microscopy Sciences</td><td>50-259-99</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Green (coloração mitocondrial geral)</td><td>Life Technologies</td><td>m7514</td><td>Reconstituir e Aliquot</td></tr><tr><td>Perclorato de éster etílico de tetrametilrodamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>87917-25MG</td><td>Reconstituir e alíquota</td></tr><tr><td>MitoSox (coloração Mito-Ros)</td> <td>Life Technologies</td><td>m36008</td><td>Reconstituir e alíquota</td></tr><tr><td>PolyLysine</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN15017625</td><td></td></tr><tr><td>frascos para moscas</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-515</td><td></td></tr><tr><td>Fly Conicals</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-355</td><td></td></tr><tr><td>Fly Vial Flugs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS273</td><td></td></tr><tr><td>Fly Conical Flugs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS 277</td><td></td></tr><tr><td>Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS153</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647-50G</td><td></td></tr><tr><td>Cyclin E Anticorpo (d-300)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc- 33748</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo ATPB [3D5] - Marcador mitocondrial</td><td>AbCam</td><td>ab14730</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-175-144</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Fisher Scientific</td><td>H100</td><td></td></tr><tr><td>Azer Scientific EverMark Select Lâminas</td> <td>de MicroscópioFisher Scientific</td><td>22-026-252</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de Vidro para Microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Mat Tek Corp&nbsp; Prato Mircrowell com Fundo de Vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Levedura Seca Ativa</td> Microscópio <td>Confocal ICN10140001</td><td></td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fórceps</td><td>Fine Science Technologies</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de Pino Niquelado Moria Fine</td><td>Science</td> Technologies <td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Pins Minutien</td><td>Fine Science Technologies</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7194</td><td></td></tr><tr><td>Fly Pad</td><td>Fly stuff</td><td>59-118</td><td></td></tr><tr><td>Blowgun</td><td>Fly stuff</td><td>54-104</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de zarabatana</td><td>Flystuff</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Software de análise</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zen&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>de análise Microscópio de zoom macro de código aberto</td><td>Image J</td><td></td></tr><tr><td>Research Olympus</td><td></td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono&nbsp;</td><td>QImaging</td><td>QIC-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>QCapture Pro 5.1</td><td>QImaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

estudar mitocondrial estrutura e função em drosophila ovários

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

A análise da relação estrutura-função mitocondrial é necessária para uma compreensão completa dos mecanismos regulatórios da funcionalidade mitocondrial. A microscopia de fluorescência é uma ferramenta indispensável para a avaliação direta da estrutura e função mitocondrial em células vivas e para o estudo da relação estrutura-função mitocondrial, que é modulada principalmente pelas moléculas que governam os eventos de fissão e fusão entre as mitocôndrias. Este artigo descreve e demonstra métodos específicos para estudar a estrutura e função mitocondrial em tecido vivo e fixo no organismo modelo Drosophila melanogaster. O tecido de escolha aqui é o ovário de Drosophila, que pode ser isolado e tornado passível de microscopia confocal ao vivo ex vivo. Além disso, o artigo descreve como manipular geneticamente a proteína de fissão mitocondrial, Drp1, em ovários de Drosophila para estudar o envolvimento da fissão mitocondrial impulsionada por Drp1 na modulação da relação estrutura-função mitocondrial. O amplo uso de tais métodos é demonstrado em dados já publicados, bem como em dados novos. Os métodos descritos podem ser estendidos para entender o impacto direto dos nutrientes e / ou fatores de crescimento nas propriedades mitocondriais ex vivo. Dado que a desregulação mitocondrial está subjacente à etiologia de várias doenças, espera-se que os métodos inovadores descritos desenvolvidos em um organismo modelo geneticamente tratável, Drosophila, contribuam significativamente para a compreensão dos detalhes mecanicistas da relação estrutura-função mitocondrial e para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas direcionadas às mitocôndrias.

Os métodos descritos podem ser utilizados para estudar a estrutura e a função mitocondrial em ovários de Drosophila vivas e fixadas (Figura 2B). São fornecidos alguns exemplos de resultados previstos obtidos com os métodos descritos. A dissecção do ovário Drosophila: Quando dissecados ainda mais, o abdómen cortadas (Figura 3B) a partir do conjunto de Drosophila</em...

A análise da relação estrutura-função mitocondrial é necessária para uma compreensão completa dos mecanismos regulatórios da funcionalidade mitocondrial. Métodos específicos para estudar a estrutura e função mitocondrial em ovários vivos e fixos de Drosophila são descritos e demonstrados neste artigo.

Estudar mitocondrial estrutura e função em Drosophila ovários

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar métodos para estudar a estrutura e função mitocondrial em tecido vivo e fixo no organismo modelo drosophila melanogaster. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da Biologia Mitocondrial. Como os mecanismos regulatórios da função mitocondrial.A principal vantagem dessa técnica é que ela realiza análises detalhadas da relação estrutura/função mitocondrial. Depois de separar cinco moscas fêmeas anestesiadas de acordo com o protocolo de texto, sob o microscópio de dissecação, use dois pares de pinças para separar o tórax do abdômen. Em seguida, transfira cuidadosamente o abdômen para o segundo poço do prato.Usando um par de pinças para segurar o abdômen na extremidade posterior, use o outro par de pinças para empurrar lentamente os ovários para fora. Em seguida, use a pinça para segurar um ovário individual pela extremidade posterior opaca e mova-o cuidadosamente para o terceiro poço do prato para provocar ou fixar. Provoque cuidadosamente a bainha protetora ao redor dos ovários, usando um par de pinças para segurar a extremidade posterior e varrendo levemente uma agulha provocante da extremidade posterior para a anterior.Para preparar câmaras revestidas de poliliseno, coloque duas gotas separadas de 20 microlitros de polilisene na lamínula de uma placa de Petri com fundo de vidro. Seque as placas ao ar a 37 graus Celsius por uma hora e contorne a polilisina na parte inferior da placa. Defina os parâmetros de varredura no microscópio confocal abrindo o software de aquisição de imagem e, na guia de aquisição, defina os parâmetros de varredura apropriados.Marque as caixas de séries temporais, branqueamento e regiões para abrir as guias individuais. Em seguida, insira os valores de parâmetro de aquisição apropriados em cada guia. Em seguida, coloque um ovário dissecado e provocado em uma região revestida de polilisina marcada e use uma agulha provocadora para espalhar o ovário e separar os ovarials.Coloque uma gota de 10 microlitros de meio dissecante de inseto em cima do ovário, certificando-se de cobrir toda a área revestida de polilisina. Em seguida, cubra a placa de Petri. Imediatamente após a montagem do ovário, coloque a amostra no microscópio e use a ocular para localizar rapidamente o campo de interesse no tecido vivo.Clique em tempo real para adquirir uma imagem em tempo real do campo de interesse selecionado e, em seguida, clique em parar para interromper a digitalização em tempo real. Se necessário, ajuste os parâmetros de aquisição para que o sinal fluorescente detectado fique abaixo dos níveis de saturação com o fundo definido conforme definido, ajustando os valores de deslocamento. Na guia gráfica, use a ferramenta de desenho de bézier para desenhar um pequeno ROI para demarcar a zona de branqueamento da foto na imagem adquirida pela digitalização.Em seguida, execute a aquisição de imagens, clicando em iniciar experimento. Para realizar a coloração viva com corantes mitocondriais fluorescentes, diluir o estoque de corantes em meio de dissecação quente até as concentrações finais de trabalho. Depois que a dissecção e a provocação forem demonstradas anteriormente, coloque os ovários em 200 microlitros de solução de coloração em um poço de uma placa de dissecação.Cubra o prato com uma caixa embrulhada em papel alumínio para protegê-lo da luz e incube o tecido por 10 minutos. Em seguida, lave os ovários corados usando uma pinça para movê-los cuidadosamente para três poços consecutivos contendo meio sem mancha. Para a coloração conjunta com TMRE, na coloração mitocondrial global compatível, efectuar primeiro a coloração com TMRE e, em seguida, sem lavar o tecido, transferir imediatamente a amostra para a coloração mitocondrial global.Depois de lavar e montar os ovários, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo, para realizar imagens confocais na amostra, marque a caixa de corte z para abrir a guia. Gire a roda de foco em direção à parte inferior da amostra enquanto ela está sendo digitalizada ao vivo e clique em definir primeiro para definir a seção z mais inferior. Em seguida, mova a roda de foco na direção oposta para definir a seção superior.Execute a aquisição de imagens clicando em iniciar experimento. No caso de xvivamicroscopia ao vivo, os dados devem ser obtidos dentro de 15 minutos após a montagem do tecido, caso contrário, os resultados experimentais podem ser afetados por alterações fisiológicas devido à morte do tecido. Imediatamente após a dissecção sob uma capela de exaustão, coloque os ovários em 200 microlitros de PFA fresco em temperatura ambiente no poço de uma placa de dissecação de vidro.Incube o tecido por 15 minutos para fixá-lo. Depois de lavar os ovários em PBS de acordo com o protocolo de texto, ainda em PBS, provoque os ovários para remover cuidadosamente a bainha de fibra protetora que pode dificultar o acesso ao antígeno do anticorpo. Permeabilize os ovários provocados colocando-os em um tubo de microfusível com 500 microlitros de 0,5% de tritan x 100 em PBS.Em seguida, coloque o tubo em uma caixa coberta e coloque para balançar a 25 RPM por 30 minutos. Remova o PBS / TX de acordo com o protocolo de texto, bloqueie o tecido adicionando 200 microlitros de BSA dissolvido em 0,5% de PBS / TX. Incube as amostras no balancim em temperatura ambiente por uma hora.Depois de remover a solução de bloqueio, adicione anticorpos anti-desicilina E anti-raivosa e anti-ATPB de camundongo. Incube o tecido no balancim em temperatura ambiente por duas horas. Após a incubação, use PBS-TX para lavar os ovários três vezes por 15 minutos cada.Em seguida, adicione 200 microlitros dos anticorpos secundários apropriados e PBS-TX fresco e incube em temperatura ambiente por uma hora. Depois de lavar o lenço duas vezes, adicione ganchos à terceira lavagem. Em seguida, com uma micropipeta de um mililitro, remova os ovários imunocorados do tubo de microfusão para um poço fresco de uma placa de dissecação de vidro contendo 200 microlitros de PBS.Adicione uma gota de meio de montagem à base de glicerol a uma lâmina de vidro e adicione os ovários imunocorados um a um ao meio de montagem. Sob um microscópio de dissecação, enquanto segura a porção opaca do ovário com uma pinça, use uma agulha provocadora para arrancar suavemente os ovariais transparentes das câmaras opacas dos óvulos maduros. Em seguida, remova as câmaras de ovos maduros do meio de montagem.Coloque uma lamínula na corrediça e pressione levemente para garantir que o meio de montagem se espalhe uniformemente. Seque as amostras ao ar por 15 minutos antes de usar o esmalte para selar as bordas. Finalmente, realize a microscopia confocal conforme necessário.Como mostrado aqui, o flip direcionado a uma das nuvens mitocondriais associadas às células nerse leva a uma perda superior a 50% do sinal fluorescente das ROIs azuis e brancas ao redor da ROI de flip vermelho em 200 segundos, enquanto a ROI de controle amarela é minimamente branqueada. Os ovários de drosófila exibiram uma diminuição no sinal com a profundidade do tecido, e é importante discernir a profundidade máxima do tecido dentro da qual os floróforos, como TMRE e mitostain, podem ser detectados durante a imagem ao vivo. Uma análise qualitativa da co-coloração com TMRE e a coloração mitocondrial geral mostra que o germário drisófila exibe maior potencial mitocondrial por unidade de massa no estágio 2B.Nesta figura, a análise semiqualitativa demonstra a diferença no potencial mitocondrial por unidade de massa entre AFCs e MBCs, conforme analisado a partir de uma câmara de ovos de estágio 9. Essas imagens revelam que a captação de mitosox ocorre nas células foliculares mitóticas e pós-mitóticas da drisophilla. Neste experimento, a coloração co-imunológica identifica o sinal elevado de desciclina sobreposto ao sinal mitocondrial ATPB e aos clones de nole DRP1 negativos para GFP no germânio e em uma câmara de ovos de estágio 9.Os métodos descritos podem ser modificados e empregados para estudar a função da estrutura mitocondrial em outros tecidos de drisófila. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar, corar e obter imagens de ovários de drisófila fixos e vivos para estudar a estrutura e função mitoconrial.

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Biologia

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