Name: Protocolos para analisar o papel das células Paneth em Regenerar o Intestino Murino utilizando Condicional Cre-lox Mouse Models (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Aprenda a isolar e preparar o intestino murino para análise de células-tronco epiteliais e células de Paneth. Este método utiliza modelos condicionais Cre-lox para estudar regeneração intestinal.

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Os autores gostariam de agradecer a Mark Bishop, Mathew Zverev, Victoria Marsh-Durban, Adam Blackwood e Sylvie Robine. Este trabalho foi financiado por uma bolsa do programa Cancer Research UK.

<ol><li>Cheng, H., Origin Leblond, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((differentiation+and+renewal+of+the+four+main+epithelial+cell+types+in+the+mouse+small+intestine.+V.+Unitarian+Theory+of+the+origin+of+the+four+epithelial+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types.</a> Am J Anat. 141 (4), 537-561 (1974).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).</li>
<li>Clevers, H. The gut, a clonal conveyor belt. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.molecularmovies.com/movies/view/96">http://www.molecularmovies.com/movies/view/96</a> (2015).</li>
<li>Snippert, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143 (1), 134-144 (2010).</li>
<li>Lopez-Garcia, C., Klein, A. M., Simons, B. D., Winton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+stem+cell+replacement+follows+a+pattern+of+neutral+drift%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intestinal stem cell replacement follows a pattern of neutral drift.</a> Science. 330 (6005), 822-825 (2010).</li>
<li>Buczacki, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+label-retaining+cells+are+secretory+precursors+expressing+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal label-retaining cells are secretory precursors expressing Lgr5.</a> Nature. 495 (7439), 65-69 (2013).</li>
<li>Basak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+early+fate+determination+in+Lgr5%2B+crypt+stem+cells+using+a+novel+Ki67-RFP+allele%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Mapping early fate determination in Lgr5+ crypt stem cells using a novel Ki67-RFP allele.</a> EMBO J. 33 (18), 2057-2068 (2014).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).</li>
<li>Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+the+best+routes+to+effectively+model+human+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+oncology%22%5BJournal%5D)">What are the best routes to effectively model human colorectal cancer.</a> Molecular oncology. 7 (2), 178-189 (2013).</li>
<li>Sauer, B., Henderson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+DNA+recombination+in+mammalian+cells+by+the+Cre+recombinase+of+bacteriophage+P1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85 (14), 5166-5170 (1988).</li>
<li>Brault, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+beta-catenin+gene+by+Wnt1-Cre-mediated+deletion+results+in+dramatic+brain+malformation+and+failure+of+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the beta-catenin gene by Wnt1-Cre-mediated deletion results in dramatic brain malformation and failure of craniofacial development.</a> Development. 128 (8), 1253-1264 (2001).</li>
<li>Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%CE%B2-catenin+is+essential+for+intestinal+homeostasis+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Wnt/β-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (21), 7551-7559 (2007).</li>
<li>Ireland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+Cre-mediated+control+of+gene+expression+in+the+murine+gastrointestinal+tract%3A+effect+of+loss+of+beta-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Inducible Cre-mediated control of gene expression in the murine gastrointestinal tract: effect of loss of beta-catenin.</a> Gastroenterology. 126 (5), 1236-1246 (2004).</li>
<li>Kemp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+background+recombination%3A+somatic+induction+of+Cre+by+combined+transcriptional+regulation+and+hormone+binding+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity.</a> Nucleic Acids Res. 32 (11), e92(2004).</li>
<li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis+elements+of+the+villin+gene+control+expression+in+restricted+domains+of+the+vertical+%28crypt%29+and+horizontal+%28duodenum%2C+cecum%29+axes+of+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cis elements of the villin gene control expression in restricted domains of the vertical (crypt) and horizontal (duodenum, cecum) axes of the intestine.</a> J Biol Chem. 277 (36), 33275-33283 (2002).</li>
<li>Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+crucial+role+of+paneth+cells+in+mediating+the+intestinal+response+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Evidence for a crucial role of paneth cells in mediating the intestinal response to injury.</a> Stem Cells. 31 (4), 776-785 (2013).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).</li>
<li>el Marjou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+and+inducible+Cre-mediated+recombination+in+the+gut+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium.</a> Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).</li>
<li>Guillemot, F., Nagy, A., Auerbach, A., Rossant, J., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+Mash-2+in+extraembryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Essential role of Mash-2 in extraembryonic development.</a> Nature. 371 (6495), 333-336 (1994).</li>
<li>Gregorieff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+Wnt+signaling+components+in+the+adult+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of Wnt signaling components in the adult intestine.</a> Gastroenterology. 129 (2), 626-638 (2005).</li>
<li>van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OLFM4+is+a+robust+marker+for+stem+cells+in+human+intestine+and+marks+a+subset+of+colorectal+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells.</a> Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).</li>
<li>Merritt, A., Allen, T., Potten, C., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+small+intestinal+epithelial+from+p53-null+mice%3A+evidence+for+a+delayed%2C+p53-independent+G2%2FM-associated+cell+death+after+gamma-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in small intestinal epithelial from p53-null mice: evidence for a delayed, p53-independent G2/M-associated cell death after gamma-irradiation.</a> Oncogene. 14 (23), 2759-2766 (1997).</li>
<li>Marshman, E., Ottewell, P., Potten, C., Watson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activation+during+spontaneous+and+radiation-induced+apoptosis+in+the+murine+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Caspase activation during spontaneous and radiation-induced apoptosis in the murine intestine.</a> J Pathol. 195 (3), 285-292 (2001).</li>
<li>Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+is+essential+for+intestinal+homeostasis+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells.</a> Mol Cell Biol. 27 (21), 7551-7559 (2007).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crypt+stem+cells+as+the+cells-of-origin+of+intestinal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer.</a> Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).</li>
<li>Tian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reserve+stem+cell+population+in+small+intestine+renders+Lgr5-positive+cells+dispensable%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable.</a> Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486 (7404), 490-495 (2012).</li>
<li>Adolph, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+as+a+site+of+origin+for+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells as a site of origin for intestinal inflammation.</a> Nature. 503 (7475), 272-276 (2013).</li>
<li>Marsh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Pten+is+dispensable+for+intestinal+homeostasis+but+suppresses+adenoma+development+and+progression+after+Apc+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Epithelial Pten is dispensable for intestinal homeostasis but suppresses adenoma development and progression after Apc mutation.</a> Nat Genet. 40 (12), 1436-1444 (2008).</li>
<li>Jardé, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+models+for+the+therapeutic+targeting+of+Wnt+signaling+using+a+Tet-O%CE%94N89%CE%B2-catenin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro models for the therapeutic targeting of Wnt signaling using a Tet-OΔN89β-catenin system.</a> Oncogene. 32 (7), 883-893 (2013).</li>
<li>Hung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+mouse+model+for+sporadic+and+metastatic+colon+tumors+and+its+use+in+assessing+drug+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1565-1570 (2010).</li>
<li>Dacquin, R., Starbuck, M., Schinke, T., Karsenty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+alpha1%28I%29-collagen+promoter+is+the+best+known+promoter+to+drive+efficient+Cre+recombinase+expression+in+osteoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Mouse alpha1(I)-collagen promoter is the best known promoter to drive efficient Cre recombinase expression in osteoblast.</a> Dev Dyn. 224 (2), 245-251 (2002).</li>
<li>Hinoi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+colonic+adenoma-carcinoma+progression+based+on+somatic+Apc+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse model of colonic adenoma-carcinoma progression based on somatic Apc inactivation.</a> Cancer Res. 67 (20), 9721-9730 (2007).</li>
<li>Sansom, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Apc+allows+phenotypic+manifestation+of+the+transforming+properties+of+an+endogenous+K-ras+oncogene+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (38), 14122-14127 (2006).</li>
<li>Wong, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lrig1+controls+intestinal+stem-cell+homeostasis+by+negative+regulation+of+ErbB+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling.</a> Nat Cell Biol. 14 (4), 401-408 (2012).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+Derivation+of+a+Living+Organoid+Biobank+of+Colorectal+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective Derivation of a Living Organoid Biobank of Colorectal Cancer Patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Usando camundongos transgênicos cre-lox condicionais para dissecar a função dos genes e células é um método comumente usado. Estes modelos têm sido utilizados com grande sucesso no intestino para identificar e caracterizar as células-tronco 2,4-6 e compreender o seu papel na doença 25. Para explorar plenamente destes modelos requer uma caracterização global do sistema para permitir que os dados sejam interpretados corretamente. Uma compreensão completa destes sistemas é difícil de realizar devido a genes raramente ser específico para um tipo celular ou localização solitária, uma falta de conhecimento biológico e ineficiência dos sistemas utilizados para induzir a expressão de Cre. Os métodos descritos aqui demonstrar como podemos superar esses problemas através de planejamento experimental e aplicação do conhecimento existente. Embora tenhamos usado esses métodos para responder a uma pergunta de investigação específico das técnicas apresentadas aqui são genéricas e podem ser explorado para qualquer pesquisa que investiga o muriintestino ne. Preparação de tecido intestinal O passo fundamental para garantir resultados robustos é a colheita e processamento do tecido, o que precisa ser processado de uma maneira oportuna e de fixação protocolos rigorosamente respeitados. Como quase todos os problemas significativos a jusante podem ser atribuídas a artefactos associados com a secagem do tecido para fora e / ou fixação incompleta. O tempo é essencial para evitar a degradação da arquitectura do tecido e / ou os ácidos nucleicos e proteínas. Fixação incompleta ou exagerada pode resultar em perda de resolução histoquímica. Fixação incompleta por falta de tempo ou seções muito grossas para permitir a penetração fixador pode resultar em perda de resolução dentro das criptas intestinais que podem ser observados como uma &quot;marca da maré&quot; na análise IHC. Além disso, é fundamental que a fixação não se estenda por muito tempo, como nuclear β-catenina pode difundir para fora do núcleo, a menos que imediatamente pronão transformados e cera incorporado seguinte fixação em formalina. Papel de Paneth Células no nicho ISC Os dados aqui apresentados demonstram de forma eficaz a importância das células de Paneth na regeneração cripta no intestino adulto após perda ISC. No entanto, há a possibilidade de que permaneceu Ah-cre poupa uma população de ISC que as metas T2 vil-Cre-ER. 26 Tian et al. Elegantemente demonstrou que as ISC hi Lgr5 são substituídos por uma população de Lgr5 lo ISC reserva. Agora parece provável que estes ISC são poupadas no sistema cre-Ah devido à população de reserva tenham sido identificados como precursores de células secretoras 6,7. A importância da célula de Paneth maduro no apoio a estes precursores de células secretoras quando necessário para reverter a um estado ISC continua a ser respondida. Como as células de Paneth constituem o ISC nicho 8 e desempenham um papel na regulação das respostas do ISC a ingestão de calorias 27 e 28 de inflamação permanece provável que as suas funções de enfermagem se estenderá para os seus próprios precursores. Novas abordagens e tecnologias para efetivamente Modelo Câncer Colorretal Humano A descoberta do ISC levou à identificação de genes que estão agora a ser utilizados para gerar novos modelos de ratos para investigar os papéis de genes e células em biologia intestinal e doença, revisado por Clarke et al 9. As únicas limitações para esta técnica é a identificação de genes para expressar a proteína Cre. Actualmente ISC são rotineiramente investigada utilizando ratinhos transgénicos condicionais baseados no padrão de expressão do gene Lgr5. Os ratinhos que expressam Cre a partir do promotor Lgr5 foram utilizados para excluir APC, o gene mais comummente mutado no cancro colo-rectal (CRC), Demonstrando a ISC como a célula de origem 25. Seletivamente apagar outros genes nessas células CRC está fornecendo informações sobre a progressão da doença e se espalhou por exemplo. PTEN 29. Uma visão mais aprofundada função ISC está sendo recuperado por especificamente ablação Lgr5 -expressing células em camundongos usando um receptor de toxina da difteria humana (DTR) gene bateu na Lgr5 lócus 26. Outras estratégias usar o sistema Tet-O que permite a expressão reversíveis em curso de proteínas mutantes 30. O uso dessas ferramentas para modificar gene (s) em diferentes células 31 e locais 32,33 é usado para entender como câncer de iniciar, o progresso ea metástase 34. Alternativamente mutagénese utilizando o sistema de beleza transposon dormir é identificar novos drivers de CRC. O desenvolvimento contínuo de ratinhos, técnicas e estratégias de alteração genética continua a desenvolver modelos mais relevantes do paciente. New métodos têm sido desenvolvidos para a caracterização dos epitélios intestinais e ISC. Caracterização do rácio de tipos de células epiteliais podem ser alcançados utilizando citometria de fluxo com base na expressão diferencial de lectina e de CD24 35. Potencialmente o maior progresso na compreensão da biologia ISC eo seu papel na doença será feita utilizando o sistema vivo organï¿½de ex cultura 36. Este sistema permite ISC normais e malignas à cultura em 3D, onde eles diferenciam e replicar de um modo mais fisiologicamente relevante. Espera-se que estes irão permitir o teste direto de drogas em amostras de pacientes in vitro, abrindo o caminho para a medicina personalizada 37.

A superfície luminal do intestino de mamífero apresenta unidades de criptas e repetindo dedo como projecções, denominado vilosidades, que se projectam para dentro do lúmen. Esta superfície é uma folha contínua do epitélio, que é submetido a auto-renovação completa aproximadamente a cada 3 - 4 dias 1. Este tecido dinâmico é suportado por uma população de células estaminais rapidamente bicicleta (ISC, também conhecido como base de cripta células colunares), que foram inicialmente identificadas pela sua expressão do gene Lgr5 2,3. Estas células existir num nicho especializado na parte inferior das criptas de Lieberkuhn. Inicialmente, a descoberta de que ISC foram ciclismo rapidamente foi discordante com a idéia predominante de que uma célula-tronco foi de repouso na natureza. Anterior à identificação do Lgr5 + ISC foi postulado que uma população de células quiescentes etiqueta na posição 4, em relação à base da cripta de retenção, foram a ISC 1. Recentes pesquisas hcomo agora reconciliou essas observações, demonstrando que principalmente há uma piscina de ciclismo equipotent ISC em cada cripta cujo destino são regulados por seus vizinhos 4,5. No caso de serem perdidos estes podem ser substituídos por células quiescentes que normalmente são comprometidos com a linhagem secretora, mas pode reverter a ISC se a população ISC está danificado 6. Vizinhos ISC pode ser ISC ou suas células filhas. As ISC produzir células filhas virgens de tratamento que se multiplicam e se diferenciam em tipos de células especializadas que compõem a folha epitelial que reveste o lúmen intestinal 1. O cálice, enteroendï¿½rina, enterócitos, topete e células M migrar para cima, para a superfície luminal onde eles fornecem várias funções de absorção e de regulamentação, no entanto, as células de Paneth permanecem no fundo da cripta onde eles existem misturados com o ISC. Nos últimos anos, tem sido demonstrado que uma parte do daught naïveer células destinados a uma linhagem secretora são etiqueta de repouso reter células Lgr5 lo capaz de reverter a uma ISC sobre lesão 6,7. Devido a sua importância na regeneração cripta uma prioridade foi colocado na compreensão das interações entre a ISC e os seus vizinhos, particularmente as células de Paneth. As células de Paneth desempenham um papel crucial no nicho que apoia a ISC 8. Em adição aos produtos bactericidas as células de Paneth produzir moléculas de sinalização que activam as vias que regulam ISC renovação ou diferenciação. Estudos anteriores mostraram que o Lgr5 + ISC só poderia existir quando eles poderiam competir para sinais de nicho essenciais prestados por sua filha células Paneth 8. Estes estudos investigaram o papel de células de Paneth em Lgr5 + normais ISC e não numa situação em que eles são danificado e necessitar reabastecimento a partir de uma população Lgr5 Lo. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Para entender a biologia e modelo de doença intestinal que examinar o papel funcional das células e / ou genes utilizando modelos de ratos transgênicos 9,10. Freqüentemente, esses modelos utilizam tecnologia cre-lox para modificar condicionalmente gene (s) 9,10. Cre (Causas recombinação) recombinase é uma recombinase específica do local da família integrase, isolado do bacteriófago P1. Cre catalisa recombinação sítio específica definida entre 34 pb &#39; Lox P &#39;(lócus χ de cruzamento P1) sites. Os ratinhos são geneticamente manipuladas para conter sítios loxP que flanqueiam regiões de interesse que após a expressão da recombinase Cre são excisadas. Ligando a expressão do gene Cre para uma célula ou um promotor específico do desenvolvimento permite a alteração a ser feita de uma forma espacial 9,10, isto é especialmente útil em superar as mutações letais embrionárias. Além disso ligando a expressão de Cre para uma via do receptor,que pode ser activada artificialmente, permite alterações temporais. Utilizando esta tecnologia, o gene inactivado CatnB 11 nos epitélios intestinais. β-catenina, o produto do gene CatnB, é um regulador chave da via de sinalização Wnt canónica que regula a homeostase do ISC. Dois estudos anteriores usando essa estratégia produziu resultados conflitantes 12,13. O estudo de FEVR et al. 12, demonstraram perda de células-tronco e homeostase intestinal. Considerando que o Ireland et al. 14 estudo relatou que a sequência de uma redução na viabilidade das células da cripta-vilosidade eixo foi repovoada a partir de células de tipo selvagem que expressam CatnB. A diferença principal nestes estudos era o promotor utilizado para expressar CRE na epitélios intestinais. O FEVR et ai., Foi utilizado o promotor do gene de vilina ligado ao receptor de estrogénio, que pode ser activado através da administração de tamoxifen (vil-Cre-ER T2) 15,16. Em contraste Ireland et al., Utilizou-se o elemento promotor do gene da citocromo rato P450A1 (CYP1A1) para conduzir a expressão de Cre em resposta ao β-naftoflavona xenobióticos (Ah-CRE). As características destes diferentes sistemas gerado duas hipóteses para explicar essas observações diferentes. A primeira é que CatnB mais eficientemente eliminado na ISC usando o sistema Cre-T2 Vil-ER em comparação com o AH-CRE, reduzindo assim o número de ISCs para níveis sub-repovoamento. Alternativamente, foi devido ao diferencial CatnB deleção na população de células diferenciadas. Os vil-Cre-ER alvos de sistemas T2 todas as células epiteliais da cripta e das vilosidades Considerando que o sistema Ah-cre tem como alvo apenas as células não Paneth do nicho ISC e cripta. Estes sistemas, desde ferramentas ideais para examinar o behavior do ISC e sua interação com as células de Paneth. Aqui nós apresentamos vários protocolos detalhados com base em como usamos estes sistemas para determinar que as células de Paneth desempenham um papel crucial na mediação da resposta intestinal à injúria 17.

<table><tbody><tr><td>Tampão acetato</td><td>*</td><td>*</td><td>Para fazer 100 ml: 4,8 ml 0,2 M Ácido acético, 45,2 ml 0,2 M Acetato de sódio e 50 ml de água destilada</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Fisher Scientific</td><td>C/0400/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Anidrido acético</td><td>Sigma</td><td>A6404</td><td></td></tr><tr><td>Solução de anidrido acético</td><td>*</td><td>*</td><td>2 M Anidrido acético em cloridrato de trietanolamina 0,1 M</td></tr><tr><td>Alcian Blue</td><td>Sigma</td><td>A5268</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue pH 2,5</td><td>*</td><td>*</td><td>Para fazer 500 ml: 15 ml de ácido acético, 5 g de Alcian Blue e 485 ml de água destilada</td></tr><tr><td>anticorpo conjugado com fosfatase alcalina anti-digoxigenina</td><td>Abcam</td><td>ab119345</td><td></td></tr><tr><td>B(beta)-Naftoflavona</td><td>Sigma</td><td>N3633</td><td>BNF, injete sem permitir que a solução esfrie muito, pois o composto sairá da solução. A solução pode ser reutilizada - armazene a -20 &deg; C entre os usos, não reaqueça mais de duas vezes.</td></tr><tr><td>Bloxall</td><td>Vector Labs</td><td>SP-6000</td><td></td></tr><tr><td>BM roxo</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td>Albumina de soro bovino</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C / 4920/17</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de citrato / solução de desmascaramento de antígeno</td><td>Vector Labs</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de milho</td><td>Sigma</td><td>C8627</td><td></td></tr><tr><td>Solução desmificante</td><td>*</td><td>*</td><td>Para 500 ml: 50 ml de glicerol, 50 ml de Tris 0,1M pH8,8, 100 ml de EtOH, 300 ml de solução salina (0,9% de NaCl em água), DTT 1,7 g. A solução destruidora pode ser feita com antecedência e armazenada, mas o TDT deve ser adicionado imediatamente antes da incubação (340 mg / 100 ml).</td></tr><tr><td>Água tratada com DEPC</td><td>Life Technologies</td><td>750023</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>101509944</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>O3690</td><td>0.5M</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/17</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Whatman</td><td>3000917</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Formalina&nbsp;</td><td>Formamida tamponada neutra</td> <td>Sigma</td><td>SLBL11382V</td></tr><tr><td></td><td></td><td>F5786</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído</td><td>Sigma</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Raymond A Lamb</td><td>12698616</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-053</td><td>HBSS (-MgCl2+; -CaCl2)</td></tr><tr><td>Tampão de hibridização</td><td>*</td><td>*</td><td>&nbsp; 5&vezes; SSC, 50% formamida, 5% SDS, 1 mg/ml de heparina, 1 mg/ml de tRNA de fígado de bezerro</td></tr><tr><td>Hidroquinona Sigma</td><td></td><td>H9003</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB Peroxidase</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Immpress HRP Anti-Mouse IgG Kit</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7402</td><td></td></tr><tr><td>Immpress HRP Anti-Rabbit IgG</td><td>Kit Vector Labs</td><td>MP-7401</td><td></td></tr><tr><td>Pó de tecido intestinal</td><td>*</td><td>*</td><td>Os intestinos delgado de 5 camundongos adultos foram combinados e homogeneizados no volume mínimo de PBS gelado. 4 volumes de acetona gelada foram adicionados ao intestino homogeneizado, que foi bem misturado e incubado em gelo por 30 min. Este foi centrifugado e o pellet foi lavado com acetona gelada. Este foi posteriormente centrifugado e o pellet resultante espalhado em papel de filtro e deixado secar. Depois de completamente seco, o material foi moído em um pó fino usando um pilão e almofariz.&nbsp;</td></tr><tr><td>K-ferricianeto</td><td>Sigma</td><td>P-3667</td><td></td></tr><tr><td>K-ferrocianeto</td><td>Sigma</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>Sigma</td><td>L0380000</td><td></td></tr><tr><td>Metacarna</td><td>*</td><td>*</td><td>60% Metanol:30% Clorofórmio:10% Ácido acético</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4000/17</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Vector Labs</td><td>S-1012</td><td>NGS</td></tr><tr><td>Soro normal de coelho</td><td>Dako</td><td>X0902</td><td>NRS</td></tr><tr><td>NTMT*</td><td></td><td>*</td><td>100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 0,1% Tween20, 2 mM Levamisol</td></tr><tr><td>PAP caneta Vector</td><td></td><td>H-400</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBT</td><td>*</td><td>*</td><td>0,5 M NaCl, 10 mM TrisHCL pH7,5, 0,1% Tween 20</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100x solução.</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (10x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td>Diluído 1:10 com água destilada para fazer</td></tr><tr><td>1x lâminas PLL</td> Lâminas de microscópio <td>Sigma</td><td>P0425-72EA</td><td>Poli-L-lisina</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Solução de proteinase k</td><td>*</td><td>*</td><td>Diluir Proteinase K a 200 &micro; g/ml em Tris 50 mM, EDTA 5 mM.</td></tr><tr><td>Ralwax</td><td>BDH</td><td>36154 7N</td><td></td></tr><tr><td>Solução Redutora</td><td>*</td><td>*</td><td>Para fazer 100 ml: 1 g de hidroquinona, 5 g de sulfito de sódio e 100 ml de água destilada</td></tr><tr><td>RnaseA</td><td>Sigma</td><td>R6148</td><td></td></tr><tr><td>Salina</td><td>*</td><td>*</td><td>0,9% NaCl em água destilada</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>I3771</td><td></td></tr><tr><td>Soro de ovelha</td><td>Sigma</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de prata</td><td>Sigma</td><td>S/1240/46</td><td></td></tr><tr><td>Solução de prata</td><td>*</td><td>*</td><td>Para fazer 100 ml: 10 ml Tampão acetato, 87 ml de água destilada, 3 ml de nitrato de prata a 1%</td></tr> de <tr><td>acetato de sódio Fisher</td><td>Scientific</td><td>S/2120/53</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>S6753</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Sulfito de sódio</td><td>Sigma</td><td>239321</td><td></td></tr><tr><td>SSC</td><td>Sigma</td><td>93017</td><td>20x citrato de sódio salino</td></tr><tr><td>Fita cirúrgica</td><td>Fisher Scientific</td><td>12960495</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifeno</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td>TAM, injete sem permitir que a solução esfrie demais, pois o composto sairá da solução. A solução pode ser reutilizada - armazene a -20 &deg; C entre os usos, não reaqueça mais de duas vezes.</td></tr><tr><td>TBS/T</td><td>Cell Signalling</td><td>#9997</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de trietanolamina</td><td>Sigma</td><td>T1502</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>TP9416</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield Hardset Montagem Medium com DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Kit Vectastain ABC</td><td>Vector Labs</td><td>PK-4001</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Promega</td><td>V3941</td><td></td></tr><tr><td>Fixador X-gal</td><td>*</td><td>*</td><td>2% formaldeído, 0,1% glutaraldeído em 1x</td></tr><tr><td>PBS X-gal color</td><td>*</td><td>*</td><td>X-gal stain; 200 &#956; l X-gal (A) em 50 ml de solução B (0,214 g de MgCl2, 0,48 g de K-ferricianeto, 0,734 g de K-ferrocianeto em 500 ml de PBS).&nbsp; A solução B pode ser preparada com antecedência e armazenada a 4 graus; C</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Fisher Científico</td><td>X/0200/21</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolos para analisar o papel das células paneth em regenerar o intestino murino utilizando condicional<em&gt; cre-lox</em&gt; mouse models

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

A superfície epitelial do intestino de mamífero é um tecido dinâmico que renova a cada 3 - 7 dias. Entender esse processo de renovação identificou uma população de células-tronco rapidamente de bicicleta intestinais (ISC) caracterizados pela sua expressão do gene Lgr5. Estas são suportadas por uma população de células estaminais quiescentes, marcado por Bmi-1 expressão, capaz de substitui-los em caso de danos. Investigar as interações entre essas populações é crucial para entender seu papel na doença e cancro. As ISC existir dentro de criptas na superfície intestinal, esses nichos apoiar a ISC na reposição do epitélio. A interação entre ISC ativos e quiescentes provável envolve outras células diferenciadas dentro do nicho, como já foi anteriormente demonstrado que a &#39;&#39; stemness &#39;&#39; do Lgr5 ISC está intimamente ligada à presença de vizinhos as suas células de Paneth. Usando condicional rato cre-loxmodelos testámos o efeito da delecção da maior parte do ISC activo na presença ou ausência das células de Paneth. Aqui nós descrevemos as técnicas e análises realizados para caracterizar o intestino e demonstrar que as células de Paneth desempenham um papel crucial dentro do nicho ISC em ajudar a recuperação após insulto substancial.

Células-tronco do epitélio intestinal (ISC) são misturados com células de Paneth. Estas células são diferenciadas progênie do ISC, que suportam o ISC e fornecer proteção antibacteriana. Aqui demonstramos como nós usamos modelos de ratos transgénicos condicionais para estabelecer que as células de Paneth desempenham um papel crucial na manutenção dos epitélio intestinal.

Protocolos para analisar o papel das células Paneth em Regenerar o Intestino Murino utilizando Condicional<em&gt; Cre-lox</em&gt; Mouse Models

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

O objetivo geral deste procedimento de dissecação é demonstrar como isolar e preparar o intestino de camundongo para técnicas subsequentes de caracterização. Este método pode ser utilizado para investigar a capacidade das células-tronco intestinais de repovoar o intestino após um procedimento experimental. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser usada após qualquer técnica, procedimento ou manipulação gênica utilizando a tecnologia CRISPR/Cas9. Comece posicionando um camundongo adulto eutanasiado em posição supina e umedecendo o pelo com etanol a 70%.Em seguida, usando tesoura, abra a cavidade intraperitoneal longitudinalmente ao longo da linha média e fixe o estômago com pinça. A seguir, corte a conexão com o esôfago e puxe suavemente o estômago para remover o intestino delgado até o apêndice. Depois, puxe suavemente o apêndice para remover o intestino grosso até o ânus.Uma vez que os intestinos tenham sido isolados, remova o estômago no apêndice e use uma seringa equipada com uma ponteira de pipeta romba para lavar os intestinos com PBS imediatamente após a lavagem, corte o intestino em três partes de tamanho igual: proximal, média e distal. Em seguida, corte cada seção em pedaços de um centímetro e coloque três a cinco fragmentos do tecido no centro de um pedaço de fita cirúrgica de dois por dois centímetros. Em formação de pirâmide, quando todos os tecidos tiverem sido fixados, feche a fita ao redor dos fragmentos longitudinalmente, criando um monte semelhante a uma pilha de toras.Em seguida, coloque a fita em um recipiente de fundo plano contendo um volume de fixador formaldeído tamponado e neutro pelo menos 10 vezes maior que o volume do tecido, e armazene as amostras a quatro graus Celsius antes da inclusão e seccionamento. Após a fixação, transfira o tecido para um recipiente de fundo plano contendo um volume de etanol 70% pelo menos 10 vezes maior que o volume do tecido, para fixar o tecido em Metcon imediatamente após a lavagem. Corte o intestino em três seções de tamanho igual, conforme acabou de ser demonstrado.Em seguida, posicione cada seção lado a lado sobre um pedaço de papel-filtro de 15 por 15 centímetros e use uma tesoura de arco para abrir as seções no FOSS assim que todas as seções tiverem sido divididas. Transfira o papel-filtro para um recipiente de vidro contendo Metcon recém-preparado por três a 24 horas à temperatura ambiente. Ao final da fixação, use uma pinça para segurar a extremidade de cada pedaço de intestino, um de cada vez, e enrole os tecidos ao redor da pin�tica para formar rolinhos suíços individuais. Prenda cada rolo abrindo ligeiramente a pinça e inserindo uma agulha de calibre 25 através do tecido.Em seguida, coloque os tecidos enrolados em um recipiente de fundo plano contendo pelo menos 10 vezes o volume de solução tampão neutra e fixador em relação ao volume dos tecidos, e deixe em repouso por pelo menos uma hora antes do processamento para visualização em montagem total da explosão tecidual. Despeje parafina bruta fundida misturada com óleo mineral em placas de Petri de 15 centímetros. Imediatamente após lavar os intestinos com PBS gelado, lave os tecidos com 25 mililitros de fixador ex cal gelado.Após a fixação, corte os intestinos em três a cinco seções iguais e coloque cada seção em uma das placas de cera resfriadas. Fixe cada extremidade para que as seções fiquem levemente esticadas, com as linhas mesentéricas nas partes superiores das placas. Remova qualquer mesentério em excesso.Em seguida, use uma tesoura de arco para cortar longitudinalmente os intestinos, fixando-os conforme forem sendo abertos, até que todas as secções tenham sido fixadas. Encha as placas com quantidade suficiente de fixador xal para cobrir todos os tecidos, após pelo menos uma hora a quatro graus Celsius. Utilize uma pipeta de 25 mililitros ou uma seringa para remover o fixador e lave os tecidos uma vez com 30 mililitros de PBS.Em seguida, cubra as seções com 30 mililitros de solução unificadora DTTD e incube por 30 a 60 minutos em temperatura ambiente com agitação. Ao final da incubação, remova a solução com uma pipeta ou seringa de 25 mililitros e alague os tecidos com outros 30 mililitros de PBS. Em seguida, use uma pipeta posterior para remover o muco junto com o PBS após a lavagem.Substitua o PBS por 30 mililitros de xal para uma coloração noturna à temperatura ambiente, no escuro, com agitação suave em uma plataforma oscilante. Na manhã seguinte, se as seções apresentarem uma coloração azul-esverdeada, substitua o xal por 30 mililitros de PBS. Após três minutos de agitação suave, faça rolinhos suíços conforme acabou de ser demonstrado e coloque os tecidos em um recipiente de boca larga e fundo plano contendo, no mínimo, 10 vezes o volume do fixador apropriado em relação ao volume do tecido, a quatro graus Celsius, por pelo menos 24 horas antes do inclusão e corte.Utilizando o repórter condicional ROSA 26 R Laxy, pode-se observar 100% de recombinação três dias após a indução no intestino delgado, utilizando DNA extraído dos fragmentos recombinados. A qPCR para os alelos recombinados demonstrou um aumento não significativo na recombinação dentro do sistema VI crease, possivelmente devido à recombinação em células de Paneth não observada. Utilizando o sistema ah crease com o repórter laxy, ambos os sistemas também demonstraram perda completa das células recombinadas três dias após a indução.Os dados de altura celular de mitose e criptas indicaram que o sistema ah H Cree poderia se recuperar, presumivelmente devido à repopulação por células-tronco intestinais não combinadas. Em acentuado contraste, o sistema villain Cree não conseguiu se recuperar, apesar de reter células epiteliais das criptas. Além disso, as células das criptas em camundongos vi Cree Cantin B apresentaram-se não proliferativas e sem expressão do marcador de células-tronco intestinais.EM quatro. Diferentemente das criptas em camundongos ah cre, de forma semelhante, as células PTH sofreram apoptose após a deleção de Caden b somente dentro do sistema VI Cree. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em aproximadamente 10 minutos.É importante minimizar os atrasos para evitar a degradação do tecido. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como remover o intestino de um camundongo para análises posteriores.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Neste vídeo, descrevemos um procedimento cirúrgico para gerar alça de cólon proximal de camundongo ou segmento pcLoop seguido de injeção intraluminal de marcadores fluorescentes no segmento para estudar a permeabilidade epitelial intestinal.

Geração do modelo de alça de cólon proximal de camundongo: um procedimento cirúrgico para gerar alça de cólon proximal e medir a permeabilidade intestinal pela detecção de marcadores fluorescentes no soro após injeção intraluminal

A identificação precisa e localização de células epiteliais ao longo da mucosa intestinal são essenciais para definir diferentes linhagens celulares. imagiologia adequado dos tecidos intestinais é crucial para a identificação de padrões de expressão de proteínas com uma resolução máxima. Este estudo visa delinear os métodos ótimos e as condições de processamento do mouse tecidos intestinais.

Técnica Swiss-rolamento melhorado para preparo intestinal tecido por imuno-histoquímica e análises de imunofluorescência

O transparente c. elegans intestino pode servir como uma"em vivo câmara de tecido" para estudar a biogênese de membrana e lúmen apicobasal nível unicelular e subcellular durante tubulogenesis multicelulares. Este protocolo descreve como combinar padrão de rotulagem, genética/perda--função de RNAi e abordagens microscópicas para dissecar esses processos em um nível molecular.

O c. elegans intestino como um modelo para intercelular Lumen morfogênese e In Vivo biogênese de membrana polarizada no nível de célula única: rotulagem por anticorpos, RNAi perda--função de análise e de imagem

Organoides intestinal culturas são estabelecidas de criptas toda e não permitem a análise de auto-renovação e diferenciação em uma célula específica de moda. Este protocolo descreve a reconstituição da haste classificada (Lgr5+) e células (Paneth), que dão origem a organoids permitindo sua prévia modificação genética e bioquímica e análise funcional de nicho.

O ensaio de reconstituição de organoides (ORA) para a análise funcional do tronco Intestinal e nicho de células

Aproveitando a microscopia intravital, o método aqui apresentado permite a visualização em tempo real do derramamento de células epiteliais intestinais em animais vivos. Portanto, a mucosa intestinal topicamente manchada (acriflavina e rhodamineB-dextran) de camundongos anesthetizados é imageda até a resolução unicelular usando microscopia confocal.

Uma abordagem baseada em microscopia intravital para avaliar a permeabilidade intestinal e o desempenho do derramamento de células epiteliais

Função de barreira epitelial intestinal disregulada e respostas imunológicas são marcas de doença inflamatória intestinal que permanecem mal investigadas devido à falta de modelos fisiológicos. Aqui, descrevemos um modelo de alça intestinal de camundongos que emprega um segmento intestinal bem vascularizado e exteriorizado para estudar a permeabilidade mucosa e o recrutamento de leucócitos in vivo.

Avaliação Funcional da Permeabilidade Intestinal e Migração Transepitelial de Neutrófilo em Camundongos usando um Modelo de Laço Intestinal Padronizado

Neste protocolo, descrevemos como gerar monótolais de cólon epitelial primário murina diretamente de criptas intestinais. Fornecemos abordagens experimentais para gerar monocamadas confluentes em filtros permeáveis, monocamadas confluentes para cura de feridas de risco e estudos bioquímicos, e monocamadas esparsas e confluentes para análise de imunofluorescência.

Geração de Monócamas Epiteliais de Cólon Primário Murine de Criptas Intestinais

Este protocolo oferece instruções detalhadas para estabelecer organoides do intestino delgado murine, isolar células linfoides tipo 1 da lamina propria do intestino delgado murina e estabelecer coculturas tridimensionais (3D) entre ambos os tipos de células para estudar interações bidirecionais entre células epiteliais intestinais e células linfoides inatas tipo 1.

Co-Cultura de Organoides Epiteliais do Intestino Delgado Murine com Células Linfoides Inatas

O trato gastrointestinal é um dos órgãos mais sensíveis à lesão no tratamento radioterápico do câncer. É simultaneamente um sistema orgânico com uma das mais altas capacidades regenerativas após tais insultos. O protocolo apresentado descreve um método eficiente para estudar a capacidade regenerativa do epitélio intestinal.

Regeneração Epitelial Intestinal em Resposta à Irradiação Ionizante

Apresentamos aqui um método para obter imagens do intestino após ferimento induzido por laser. Ao expor o intestino do camundongo a um laser multifóton, a perda de uma única ou múltiplas criptas é induzida localmente. Ao obter imagens repetidas da área danificada ao longo de meses, a dinâmica em tempo real da recuperação intestinal é capturada.

Ablação a Laser e Microscopia Intravital no Estudo do Remodelamento Intestinal

Descrevemos um protocolo detalhando o isolamento de criptas colônicas murinas para o desenvolvimento de colonóides tridimensionais. Os colonóides estabelecidos podem então ser terminalmente diferenciados para refletir a composição celular do epitélio do hospedeiro antes de receber um desafio inflamatório ou serem direcionados para estabelecer uma monocamada epitelial.

Estudando os Efeitos Epiteliais da Inflamação Intestinal In Vitro em Colonóides Murinos Estabelecidos

Aprenda a isolar e preparar o intestino murino para análise de células-tronco epiteliais e células de Paneth. Este método utiliza modelos condicionais Cre-lox para estudar regeneração intestinal.

Protocolos para analisar o papel das células Paneth em Regenerar o Intestino Murino utilizando Condicional

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