Protocolos para analisar o papel das células Paneth em Regenerar o Intestino Murino utilizando Condicional Cre-lox Mouse Models

O objetivo geral deste procedimento de dissecação é demonstrar como isolar e preparar o intestino do camundongo para técnicas de caracterização subsequentes. Este método pode ser usado para investigar a capacidade das células-tronco intestinais de repovoar o intestino após um procedimento experimental. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser usada seguindo qualquer técnica ou procedimento ou após manipulação de genes Usando a tecnologia cray locks Comece colocando um camundongo adulto sacrificado em decúbito dorsal e umedecendo o pelo com 70% de etanol.

Em seguida, usando uma tesoura, abra a cavidade intraperitoneal longitudinalmente ao longo da linha média e prenda o estômago com uma pinça. Em seguida, corte a conexão com o esôfago e puxe suavemente o estômago para remover o intestino delgado até o apêndice. Em seguida, puxe suavemente o apêndice para remover o intestino grosso até o ânus.

Uma vez que os intestinos tenham sido isolados, remova o estômago do apêndice e use uma seringa equipada com uma ponta de pipeta de ponta romba para lavar os intestinos com PBS imediatamente após a lavagem, corte o intestino em três seções de tamanhos iguais, proximal, média e distal. Em seguida, corte cada seção em pedaços de um centímetro e coloque de três a cinco fragmentos do tecido no meio de um pedaço de fita cirúrgica de dois por dois centímetros. Em uma formação piramidal, quando todos os tecidos estiverem presos, sele a fita ao redor das peças longitudinalmente, criando uma pilha de toras.

Em seguida, coloque a fita em um recipiente de fundo plano contendo pelo menos 10 vezes o volume de neutro, tamponado, formal e fixador para o volume de tecido, e armazene as amostras a quatro graus Celsius antes de serem incorporadas e seccionadas. Após a fixação, transfira o tecido para um recipiente de fundo plano contendo pelo menos 10 vezes o volume de etanol a 70% do volume de tecido para fixar o tecido em Metcon imediatamente após a lavagem. Corte o intestino em três seções de tamanhos iguais, conforme demonstrado.

Em seguida, coloque cada seção lado a lado em um pedaço de papel de filtro de 15 por 15 centímetros e use uma tesoura de arco de mola para abrir as seções no FOSS quando todas as seções tiverem sido divididas. Transfira o papel de filtro para um prato de vidro contendo Metcon recém-preparado por três a 24 horas em temperatura ambiente no final da fixação, use uma pinça para pegar a ponta de cada um dos pedaços de intestino, um de cada vez, e enrole os tecidos ao redor da pinça para formar rolos suíços individuais. Prenda cada rolo abrindo levemente a pinça e inserindo uma agulha de calibre 25 no tecido.

Em seguida, coloque os tecidos enrolados em um recipiente de fundo plano contendo pelo menos 10 vezes o volume da fórmula tamponada neutra e fixador como os tecidos por pelo menos uma hora antes de processar para visualização completa do Monte laxy da explosão do tecido. Despeje a cera bruta derretida misturada com óleo mineral em placas de Petri de 15 centímetros. Então, imediatamente após lavar os intestinos com PBS gelado, lave os tecidos com 25 mililitros de fixador ex cal gelado.

Após a fixação, corte os intestinos em três a cinco seções iguais e coloque cada seção em uma das placas de cera resfriadas. Prenda cada extremidade de modo que as seções fiquem ligeiramente esticadas com as linhas mesentéricas no topo das placas. Apare qualquer excesso de mesentério.

Em seguida, use uma tesoura de arco de mola para cortar as entranhas longitudinalmente, prendendo à medida que são abertas quando todas as seções foram fixadas. Inunde as placas com fixador xal suficiente para cobrir todos os tecidos após pelo menos uma hora a quatro graus Celsius. Use uma pipeta de 25 mililitros ou uma seringa para remover o fixador e lave os lenços uma vez com 30 mililitros de PBS.

Em seguida, cubra as seções com 30 mililitros de solução unificadora DTTD para uma incubação de 30 a 60 minutos em temperatura ambiente com balanço. No final da incubação, remova a solução deificante com uma pipeta ou seringa de 25 mililitros e inunde os tecidos com mais 30 mililitros de PBS. Em seguida, use uma pipeta posterior para remover o muco com o PBS após a lavagem.

Substitua o PBS por 30 mililitros de xal para uma mancha durante a noite em temperatura ambiente no escuro com agitação suave em uma plataforma de balanço na manhã seguinte. Se as seções desenvolveram uma mancha verde-azulada, substitua o xal por 30 mililitros de PBS. Após três minutos de agitação suave, fazer rolos suíços como acabamos de demonstrar e colocar os tecidos em um recipiente de boca larga e fundo plano contendo pelo menos 10 vezes o volume de fixador apropriado como o volume de tecido a quatro graus Celsius por pelo menos 24 horas antes de embutir e seccionar.

Usando o repórter condicional ROSA 26 R Lafy, 100% de recombinação pode ser observada três dias após a indução no intestino delgado usando DNA extraído dos berços recombinados. A QPCR para os alelos recombinados demonstrou um aumento não significativo na recombinação dentro do sistema de vincos VI, potencialmente devido à recombinação nas células de paneth não observada. Usando o sistema de vinco ah usando o repórter laxy, ambos os sistemas também demonstraram uma perda completa de células recombinadas três dias após a indução.

Os dados de mitose e altura celular da cripta K indicaram que o sistema ah H Cree poderia se recuperar presumivelmente devido ao repovoamento por células-tronco intestinais não combinadas. Em contraste, o vilão Cree não conseguiu se recuperar, apesar de reter células epiteliais da cripta. Além disso, as células criptas em camundongos Cree Cantin B flocados não eram proliferativas e não tinham expressão do marcador de células-tronco intestinais.

EM quatro. Ao contrário das criptas em camundongos ah cre, as células PTH sofreram apoptose após a deleção de Caden b apenas dentro do sistema VI Cree. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em aproximadamente 10 minutos.

É importante minimizar os atrasos para evitar a degradação do tecido. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como remover o intestino de um camundongo para análise a jusante.