Ablação a Laser e Microscopia Intravital no Estudo do Remodelamento Intestinal

Modelos de lesão são indispensáveis para o estudo da regeneração in vivo, no entanto, investigar a regeneração no intestino é comprovadamente um desafio técnico. A falta de protocolos de imagem longitudinais impediu uma visão mais profunda da dinâmica da escala celular e tecidual que orquestra a regeneração intestinal. Neste protocolo, descrevemos um método de microscopia intravital que induz localmente dano tecidual em escala de cripta única e segue a resposta regenerativa do epitélio intestinal em camundongos vivos a danos por ablação a laser baseados em fótons de cripta única ou campos intestinais maiores de forma controlada no tempo e no espaço.

Imagens intravitais subsequentes, repetitivas e de longo prazo permitem o rastreamento da área danificada ao longo do tempo e permitem o monitoramento da dinâmica das criptas durante a recuperação do tecido durante um período de várias semanas. Induzir camundongos injetando tamoxifeno dissolvido em óleo de girassol em quatro a seis semanas antes da cirurgia. Aplicar analgesia, injetar 200 microlitros de buprenorfina por via subcutânea 30 minutos antes da cirurgia.

Administrar carprofeno em água potável 24 horas pré-cirurgia. Introduzir ferramentas cirúrgicas estéreis autoclavadas no gabinete de risco biológico. Ligue a almofada de aquecimento e ajuste a temperatura em 37 graus Celsius.

Ligue a câmara de controle de temperatura do microscópio pelo menos quatro horas antes da aquisição de imagens. Mantenha a temperatura dentro da câmara climática estável em 37 graus Celsius. Ligue o microscópio de dois fótons, o scanner e o laser.

Inicie o software de geração de imagens. Ajuste o comprimento de onda do laser para 960 nanômetros e abra o obturador. Anestesiar o rato utilizando dois a 3% de isoflurano e colocá-lo numa almofada de aquecimento coberta com um pano estéril.

Verifique a profundidade da anestesia avaliando a frequência e a qualidade da respiração uma respiração por segundo e verificando o reflexo do mouse. Cubra os olhos do rato com pomada para os olhos. Injetar 200 microlitros de soro fisiológico estéril pré-aquecido por via subcutânea.

Faça a barba no abdômen e remova os pelos. Troque o pano estéril na área cirúrgica. Insira a sonda retal para monitorar a temperatura do mouse.

A temperatura deve ficar aproximadamente em 37 graus Celsius. Use um novo par de luvas estéreis. Limpar a área cirúrgica de forma circular com esfregaços alternados de solução antisséptica seguida de etanol 80% três vezes.

Cubra o rato com um campo cirúrgico estéril. Verifique o reflexo do mouse. Faça uma incisão vertical de 10 milímetros na linha média através da pele usando um bisturi estéril.

Incise a linha alba usando a tesoura para separar os músculos abdominais retos e abrir o abdômen. Encontre o ceco do rato usando um cotonete estéril embebido em soro fisiológico pré-aquecido para usá-lo como ponto de referência. Faça um pequeno corte em pedaço de gaze, molhe-o em soro fisiológico estéril pré-aquecido e coloque-o acima da incisão.

Retire o intestino com cotonetes estéreis embebidos em soro fisiológico estéril pré-aquecido. Mantenha o intestino hidratado adicionando soro fisiológico pré-aquecido esterilizado. Transfira o mouse para uma caixa de imagem estéril pré-aquecida.

Coloque o intestino no vidro estéril. Coloque a cabeça do rato dentro do tubo de inalação da caixa de imagem. Se necessário, prenda o mouse com filme e fita flexíveis estéreis.

Coloque a caixa de imagem que contém o rato na câmara do microscópio. Monitore o mouse durante a aquisição de imagens verificando a frequência e a profundidade da respiração e a temperatura por meio de uma sonda retal a cada 15 minutos. O isoflurano deve ser mantido entre um a 2% e encontrar uma região no intestino usando os IPs do microscópio.

Obtenha uma visão de campo ampla da região de interesse usando a câmera interna do microscópio. Imagem da região de interesse usando o laser de 960 nanômetros de microscópio multifóton. Ajustar a potência e o comprimento de onda do laser de acordo com as fluoroformas utilizadas no experimento.

Neste exemplo, a membrana expressa das criptas é uma proteína fluorescente vermelha e é marcada estocástico com proteína fluorescente verde após a indução com baixa dose final de tamoxifeno. Adquira uma pilha Z de 10 a 20 passos de três mícrons da região de interesse. Escolha uma única posição ou várias posições na imagem de bloco anteriormente.

Use a função de calibração de ponto de violação no software de imagem com zoom de 32 e resolução de 124 por 124 pixels com velocidade de varredura de 400 hertz usando a propriedade de varredura bidirecional por três a 10 segundos, dependendo do tamanho do dano pretendido. O início do dano na área da cripta pode ser reconhecido por um aumento na autofluorescência tanto no canal verde quanto no vermelho. Após a ablação, adquira pilhas Z das regiões danificadas para confirmar a localização e a extensão do dano.

Repita as duas etapas anteriores para várias regiões no mesmo mouse. Coloque o rato ainda sob anestesia em uma área de sutura estéril e cubra com um campo estéril. Insira o intestino exposto de volta no abdômen usando cotonetes estéreis embebidos em soro fisiológico estéril pré-aquecido.

Sutura da linha alba através da sutura contínua simples com fio absorvível. Fechar as extremidades da sutura com nós cirúrgicos. Repita o mesmo passo com a camada de pele.

Desligue a estação de isoflurano, limpe e esterilize a caixa de imagem e incruste. Deixe o rato recuperar da cirurgia enquanto a gaiola é colocada na almofada de aquecimento durante uma hora. Injetar 200 microlitros de buprenorfina por via subcutânea seis a 12 horas após a cirurgia.

Administrar carprofeno em água potável por 72 horas pós-cirurgia. Pese o rato e monitorize o bem-estar todos os dias durante uma semana pós-cirurgia. No segundo momento, pelo menos uma semana após a primeira sessão de imagem, repetir a cirurgia e os exames de imagem intravitais.

Use o padrão dos vasos sanguíneos para encontrar de volta as mesmas regiões de interesse imagem no primeiro ponto de tempo. Se o rato não for fotografado noutro ponto temporal, sacrifique o rato realizando a luxação cervical sob anestesia. Caso contrário, continuar com o fechamento do sítio cirúrgico e cuidados pós-cirúrgicos.

Camundongos K19-Cre ERT mTmG foram injetados com tamoxifeno para induzir a marcação estocástica de células com GFP quatro a seis semanas antes da cirurgia e da primeira sessão de imagem. Depois de expor cirurgicamente o intestino do camundongo e adquirir imagens de câmera e fluorescentes da região de interesse, as configurações de ponto de violação do laser multifóton são usadas para abater criptas. O início do dano pode ser reconhecido por um aumento na autofluorescência tanto no canal verde quanto no vermelho.

O mesmo procedimento é repetido um mês depois, e a vasculatura é usada como um ponto de referência para encontrar de volta a mesma região. Usando o modelo de confetes Lgr5-eGFP, criptas rotuladas com cores diferentes podem ser seguidas ao longo do tempo para mapear a dinâmica de recuperação. Neste exemplo, criptas em verde estão expressando o Lgr5 Cre, e uma cripta em magenta é rotulada com cor de confete.

Diferentes modos de regeneração são observados duas semanas após a ablação a laser. Algumas regiões permanecem inalteradas, enquanto outras regiões exibem remodelação em formas de fissão de criptas, de modo que a divisão de uma cripta em duas, ou fusão, fusão de duas criptas em uma, ou desaparecimento de criptas. A ablação a laser combinada com o método de microscopia intravital restringe o dano a uma região de interesse definida.

Isso nos permite controlar a localização do dano, bem como a extensão do dano. A gravidade do dano pode ser modulada para criptas ablatas ou campos intestinais inteiros para nos informar sobre a resposta regenerativa na escala de criptas. Além do controle espacial, a ablação a laser também permite cronometrar com precisão o início do dano, além de obter imagens do mesmo órgão em condições homeostáticas e regeneradoras no mesmo camundongo, superando assim a precisão de modelos anteriores de lesão.

A aplicação da ablação a laser e da imagem intravital repetitiva pode ser utilizada como uma plataforma para uma infinidade de questões de pesquisa e diversas áreas científicas que abrangem regeneração, imunologia e pesquisa em câncer.