Desenvolvimento de uma tira de teste imunocromatográfico baseada em ouro coloidal para a detecção de Cetáceos Myoglobin

O objetivo geral desta tira de teste imunocromatográfica com ouro coloidal é diferenciar a mioglobina de cetáceos daquela de focas e outros animais. Este método pode fornecer triagem rápida e in loco para carne de cetáceos, restringindo assim seu comércio e consumo ilegais. A principal vantagem desta técnica é que um resultado bem-sucedido pode ser observado diretamente em cinco a dez minutos após a homogeneização de 0,3 grama de músculo, com especificidade e sensibilidade notáveis.

Portanto, este método pode proporcionar detecção rápida de carne de cetáceos no campo. Também pode ser aplicado a outras carnes, como carne de cavalo ou de porco. Para projetar peptídeos sintéticos para a produção de anticorpos monoclonais com reatividade frente à mioglobina de cetáceos, são analisadas as sequências de aminoácidos das regiões antígenas reativas da mioglobina de diversos animais.

Comece recuperando do GenBank as sequências de aminoácidos da mioglobina de atum, frango, avestruz, mamíferos domésticos, foca e 18 espécies de cetáceos. Em seguida, alinhe as sequências usando o software apropriado. Inicie o Alignment Explorer selecionando Alinhar Editar/Construir Alinhamento na barra de inicialização.

Selecione Criar Novo Alinhamento e clique em OK. Uma caixa de diálogo aparecerá perguntando se você está criando um alinhamento de sequência de DNA ou proteína. Clique no botão denominado Proteína, selecione Dados Abrir Recuperar sequências do Arquivo e selecione o arquivo de sequência. Selecione o comando de menu Editar Selecionar Tudo para selecionar todos os sítios de cada sequência no conjunto de dados para a criação de um alinhamento múltiplo de sequências.

Selecione Alinhamento Alinhar por ClustalW no menu principal. Selecione BLOSUM como matriz de pesos para proteínas e, em seguida, clique no botão OK. O terceiro passo é analisar o alinhamento de sequência.

Foque-se em cinco sítios reativos antigênicos e identifique o fragmento conservado entre os cetáceos. Um asterisco simboliza o consenso no alinhamento e indica uma posição com um único resíduo totalmente conservado. Foram encontrados dois fragmentos conservados nos cetáceos.

Os fragmentos de sequência candidatos são então sintetizados e utilizados para produzir anticorpos monoclonais. Inicie este procedimento determinando o pH ótimo para a solução de ouro coloidal, definido como o pH mínimo que mantém a mistura de anticorpo monoclonal e solução de ouro coloidal na cor vermelha durante duas horas. Adicione 0,15 microgramas de anticorpo monoclonal purificado de detecção a 100 microlitros de solução de ouro coloidal com valores de pH variando de cinco a nove.

Para fins desta demonstração, testam-se os valores de pH seis e pH oito. O pH oito foi considerado o pH ideal nesta etapa de otimização. Em seguida, determine a concentração ideal do anticorpo monoclonal adicionando diversas quantidades do anticorpo monoclonal purificado de detecção a 100 microlitros de solução coloidal de ouro em pH oito.

A concentração ideal, que é de seis microgramas por mililitro neste estudo, manterá a cor da mistura vermelha, sem precipitado preto. Com base nos resultados das etapas de otimização, adicione 60 microgramas do anticorpo monoclonal purificado de detecção gota a gota a 10 mL de solução coloidal de ouro. Emulsifique a mistura suavemente à temperatura ambiente por dez minutos.

Adicione dois mililitros de uma solução de BSA a 5% em PBS à mistura e emulsifique suavemente à temperatura ambiente durante 15 minutos para reduzir a interferência de fundo. Centrifugue a mistura a 10.000 × g durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante contendo o anticorpo não conjugado e suspenda o pellet resultante em 4 mL de PBS-T contendo BSA a 1% e Tween-20 a 0,1%.

Repita a centrifugação e a suspensão uma ou duas vezes. Suspenda os precipitados finais em 1 mL de PBS-T e armazene a quatro graus Celsius até o uso. Um esquema do desenho da tira imunológica é mostrado aqui.

As dimensões da cartolina, das almofadas e da membrana de nitrocelulose estão listadas no texto do protocolo. Para prolongar a vida útil do armazenamento, as tiras imunológicas devem ser preparadas e montadas em condições ambientais de laboratório com baixa umidade. Utilize uma micropipeta para adicionar a solução de anticorpo monoclonal marcado com ouro coloidal à almofada de conjugado até saturá-la e, em seguida, seque a almofada a 37 graus Celsius por uma hora antes da montagem.

Uma vez que a fita conjugada esteja seca, use fita adesiva dupla face para primeiro colar a membrana de nitrocelulose sobre o papelão. Utilizando uma impressora de imunofitas, distribua o anticorpo monoclonal específico para captura do antígeno e o anticorpo anti-IgG de camundongo rápido nas zonas de teste e de controle, respectivamente, na membrana de nitrocelulose. Mantenha uma distância maior que cinco milímetros entre as duas zonas.

Em seguida, cole o suporte do conjugado em um lado da membrana de nitrocelulose e o suporte absorvente no outro lado, sobrepondo os suportes em cada lado em cerca de dois milímetros. Posicione o suporte da amostra sobre o suporte do conjugado em dois milímetros e cole-o no papelão. Use um cortador de papel para criar tiras com seis milímetros de largura.

Embal e as tiras em um saco de folha de alumínio com dessicante e armazene a quatro graus Celsius até o uso. Para preparar uma amostra para o teste de reatividade cruzada, adicione 1 mL de PBS contendo 0,1% de BSA a 0,03 gramas de músculo cru. E utilize um palito de bambu ou uma haste de moagem para homogeneizar a amostra.

Segure a tira imunológica pela extremidade oposta à área de teste e mergulhe a parte da almofada de amostra no espécime por cinco a dez minutos. Observe o resultado diretamente. Teste várias amostras musculares em triplicata.

A linha de teste T é projetada para mostrar um sinal positivo quando ambos os anticorpos monoclonais detectarem mioglobina de cetáceos. Como a mioglobina de animais não cetáceos pode ser detectada apenas por um desses dois anticorpos monoclonais, a linha de teste mostra um resultado negativo quando amostras musculares de outros animais são testadas. A linha de controle C deve sempre mostrar um resultado positivo, porque o anticorpo rápido anti-IGG de camundongo se liga ao anticorpo de detecção marcado com ouro coloidal.

Um resultado negativo na linha de Controle indica que a qualidade dos materiais na tira é baixa. A análise sanguínea ocidental utilizando sobrenadantes de hibridoma mostra que o anticorpo monoclonal CGF5H9 detecta cetáceos e outros mamíferos como uma única banda corada em um peso molecular previsto de aproximadamente 17kDa. A baleia-comum (Minke) apresenta uma banda comparativamente mais fraca do que as bandas dos outros cetáceos.

As bandas estão ausentes para atum, foca e frango. Já uma banda em aproximadamente 50 kDa é observada para porco. Resultados idênticos são obtidos pela análise de mancha de sangue.

Embora a análise sanguínea ocidental utilizando o anticorpo monoclonal CSF1H13 mostre múltiplas bandas inespecíficas para porco e atum, o CSF1H13 é altamente específico porque reage apenas com cetáceos. E a foca apresenta uma banda no peso molecular previsto de aproximadamente 17kDa. Resultados idênticos são obtidos pela análise sanguínea em dot blot.

Os resultados do ELISA indireto de extratos musculares de diferentes espécies utilizando CGF5H9 purificado demonstram sinais positivos para bovino, caprino, cão, coelho e cetáceos, um sinal positivo fraco para suíno e sinais negativos para atum, frango e foca. CSF1H13 mostra alta afinidade pelos cetáceos e focas. Ambos os anticorpos monoclonais podem reagir fortemente com as quatro espécies de cetáceos, que pertencem a famílias diferentes, indicando sua ampla reatividade frente a diversas espécies de cetáceos.

A especificidade da tira imunológica de ouro coloidal é demonstrada por esses resultados representativos. O uso de amostras de músculo não cetáceo resulta em apenas uma única faixa na linha de controle. No entanto, quando são utilizadas amostras de músculo cetáceo, as faixas de sinal estão presentes tanto na linha de teste quanto na linha de controle.

Uma vez dominada, a preparação de anticorpos marcados e a montagem dessas tiras pode ser realizada em quatro horas, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de projetar o peptídeo cuidadosamente. Utilize diversos métodos para triagem de anticorpos monoclonais adequados.

E utilize uma alta qualidade de ouro coloidal para preparar anticorpos marcados. Após esses procedimentos, outros métodos, como análises de DNA baseadas em PCR, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a espécie de cetáceo e sua origem. O anticorpo monoclonal CSF1H13, que é potente e exibe afinidade apenas por mamíferos marinhos, pode ser empregado em diversos formatos de ELISA, oferecendo diversas outras oportunidades para estudar os aspectos biológicos, fisiológicos e químicos da mioglobina em mamíferos marinhos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como desenvolver anticorpos monoclonais específicos e, posteriormente, aplicá-los em uma tira de teste rápida.