Name: Desenvolvimento de uma tira de teste imunocromatográfico baseada em ouro coloidal para a detecção de Cetáceos Myoglobin (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Aprenda a desenvolver uma tira de teste imunocromatográfica com ouro coloidal para detectar mioglobina de cetáceos em campo. Este método rápido oferece resultados em 5 a 10 minutos com alta especificidade e sensibilidade, auxiliando na prevenção do comércio ilegal de carne de baleia.

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Agradecemos aos colegas da Sociedade de Cetáceos de Taiwan, do Centro de Pesquisa de Biologia Marinha e Cetáceos da Universidade Nacional de Cheng Kung, do Parque Oceânico Farglory e do Centro de Diagnóstico de Doenças Animais da Universidade Nacional de Chiayi pela coleta de amostras. Este projeto foi financiado por doação ao WCY do Conselho de Agricultura de Taiwan (100AS-02.1-FB99).

Declaração de Ética: O estudo foi realizado de acordo com as directrizes internacionais e aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade Nacional de Chiayi, aprovação ID: 99022. O uso da amostra de cetáceos foi permitido pelo Conselho da Agricultura de Taiwan (Research Permissão 100M-02.1-C-99). 1. Preparação de amostras do músculo e de SDS-PAGE Nota: As amostras de músculo de 23 espécies, incluindo 16 espécies de mamíferos marinhos, 5 espécies de mamíferos terrestres, atum e frango foram utilizados neste estudo (Tabela 1). As amostras de músculo de cetáceos foram obtidas de indivíduos presos, as capturas acessórias da pesca e confisco. Coelho, rato, cão, e tecidos musculares de frango foram obtidos a partir do Centro de Diagnóstico de Doenças dos Animais da Universidade Nacional de Chiayi. As amostras de carne de vaca, porco, cordeiro e atum foram comprados de um supermercado local. A amostra do músculo do selo de porto (Phoca vitulina </em&gt;) foi fornecido por Farglory Ocean Park. electroforese de sódio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) foi utilizada para separar proteínas solúveis com diferentes pesos moleculares em amostras do músculo. <ol><li> Armazenar todas as amostras a -20 ° C até à sua utilização. </li><li> Pré-cool argamassa a -20 ° C. Em seguida, coloque 3 g de amostra muscular congelado nele. </li><li> Homogeneizar a amostra com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato frio (PBS), utilizando um homogeneizador de tecidos. </li><li> Centrifugar a amostra homogeneizada a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Recolhe-se os sobrenadantes e armazená-lo a -20 ° C até à sua utilização. </li><li> Prepare 5 ml de 5% de gel de empilhamento (3,07 ml de água destilada, 1,25 ml de gel tampão superior 4x de pH 6,8, 625 ul de 40% de acrilamida, 50 ul de 10% de persulfato de amónio (APS), e 5 ul de tetrametiletilenodiamina ( TEMED)) e 10 ml de 15% de gel de separação (3,65 ml de água destilada, 2,5 ml de tampão de gel de 4x mais baixo de pH 8,8, 3,75 ml de 40% de acrilamida, a 100 ul de APS a 10%,e 4 ul de TEMED). <ol><li> Na célula de electroforese, derramar empilhamento gel (5% de acrilamida) no topo do gel de separação (acrilamida a 15%) depois de este ter solidificado. Insira um pente de gel no gel de empilhamento. </li></ol></li><li> Execute página de acordo com as seguintes condições: condição inicial de execução: 100 volts, 20 min e condição final: 120 volts, 40 min. </li><li> Corar o gel com azul brilhante de Coomassie à temperatura ambiente durante 30 min, até que o gel é uniformemente azul em cor. Nota: A coloração é completa quando o gel não é mais visível na solução corante. </li><li> Destain-o com solução de ácido acético (10%) à temperatura ambiente durante 1 h. Bandas vão começar a aparecer. Continuar descoloração a 4 ° C durante a noite até que o fundo é clara. </li></ol> 2. Peptide Synthesis e Produção de Anticorpo Monoclonal <ol><li> Recuperar as sequências de aminoácidos de MB a partir do GenBank incluindo atum, frango, avestruz, mamíferos domésticos, vedação e 18 espéciesde cetáceos (Tabela 2). </li><li> Alinhar as sequências utilizando software adequado 16: <ol><li> Inicie o Alignment Explorer selecionando Alinhar: Editar / Criar Alinhamento na barra de inicialização; selecione Criar Nova Alinhamento e clique em OK. Uma caixa de diálogo aparecerá perguntando &quot;Você está construindo um alinhamento de sequências de DNA ou proteína?&quot; </li><li> Clique no botão &quot;Protein&quot;; selecione Dados: Open: recuperar seqüências de arquivo e selecione o arquivo de sequência; selecione Editar: Selecionar tudo comando de menu para selecionar todos os sites para cada sequência no conjunto de dados para a criação de um alinhamento múltiplo de sequências. </li><li> Seleccione Alinhamento: Alinhar por ClustalW a partir do menu principal para alinhar os dados sequências selecionadas usando o algoritmo ClustalW; selecione &quot;BLOSUM&quot; como a proteína da matriz de peso, em seguida, clique no botão OK. </li></ol></li><li> Analisar o alinhamento da sequência: <ol><li> Concentre-se em 5 de si reativa antigênicates 17: Local 1 (AKVEADVA, 15-22), local 2 (KASEDLK, 56-62), local 3 (ATKHKI, 94-99), local 4 (HVLHSRH, 113-119) e sítio 5 (KYKELGY, 145- 151) e encontrar o fragmento conservado entre os cetáceos. Uma * (asterisco; símbolo consenso no alinhamento (protocolo 2.2.3)) indica as posições que têm um único resíduo, totalmente conservada. Os seguintes fragmentos conservados em cetáceos foram encontrados: sequência KASEDLKKHG (que inclui local 2) e sequência HVLHSRHP (que inclui local 4). </li></ol></li><li> Sintetizar fragmentos de sequência candidata de acordo com a análise de sequência, e conjugado com uma proteína de ovalbumina (OVA) como proteína veículo usando serviços comerciais. <ol><li> Adicionar aminoácidos hidrofóbicos (por exemplo, metionina) ao N-terminal do local reactivo antigénico para prevenir o péptido a partir da decomposição (por exemplo, M-KASEDLKKHG). </li><li> Alongar a C-terminal do local reactivo antigénico para expor o local antigénico do núcleo para o imunócito. Além disso, conjuporta o péptido com OVA através da adição de uma cisteína (Cys, C) para o C-terminal (por exemplo, M-KASEDLKKHG-NTVL-C). </li></ol></li><li> Emulsionar o adjuvante completo de Freund para um imunogénio ou adjuvante incompleto de Freund para o imunogénio 2 com um volume igual de cada péptido sintético em PBS (3 mL, concentração final de 30-50 ug / 100 uL). </li><li> Inocular imunogénio 1 (0,1 mg) subcutaneamente em cada um de cinco fêmeas BALB / c. </li><li> Execute injecções de reforço subcutâneos cinco vezes usando imunógeno 2 em intervalos de duas semanas e recolher soros de teste por amostragem cauda clipe dos camundongos antes de cada reforço. </li><li> Determinar título soros pela primeira triagem. <ol><li> Dissolve-se 100 ug de péptido livre em 25 ml de tampão de reacção e alíquota de 50 ul da solução em cada poço de uma placa de 96 poços. Adicionar solução de reagente de acoplamento de 10 ul a cada poço e a placa misturar. Incubar a placa durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Remover os conteúdos do poço,lavar cada poço 3 vezes com água destilada, e bloquear a placa adicionando 200 ul de solução de bloqueio. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Remover o conteúdo e lavar cada cavidade 3 vezes com água destilada. </li><li> Execute ELISA indireto (Protocolo 5,1-5,7) para determinar soros título pela primeira triagem. Escolha o mouse com o título mais elevado (maior densidade óptica) para a coleta de baço. </li></ol></li><li> Três dias antes da colheita do baço, inocular 0,1 mg de imunógeno 1 por via subcutânea no rato apresentando o maior título. </li><li> Recolher as células do baço dos ratinhos imunizados seleccionados e fundir com células de mieloma de murino F0 (SP2 / 0-Ag14) para se obter células de hibridoma para produção de mAb 18. </li><li> 14 dias após a fusão, selecione os clones positivos por rastreio a reactividade dos sobrenadantes de hibridoma em direção péptido sintético livre usando ELISA indireto (Protocolo de 5,1-5,7). </li><li> Dilui-se as células para um número apropriado por poço para maximizing a proporção de poços que contêm apenas um clone único (diluição clonagem). <ol><li> Adicionar 100 ul de meio de cultura celular para todos os poços da placa de 96 poços excepto A1 bem que é deixado vazio. </li><li> Adicionar 200 ul da suspensão de células para o poço A1. Em seguida, transferir rapidamente 100 mL de A1 a B1 e misture com cuidado pipetando. Repita essas 1: 2 diluições para baixo toda a coluna, e depois descartá 100 ul de H1 de modo que termina com o mesmo volume que os poços acima dela. </li><li> Adicionar mais 100 ul de meio para a coluna 1 com uma micropipeta de 8 canais. Em seguida, transferir rapidamente 100 pi de cada um dos poços na coluna 1 para aqueles na coluna 2, utilizando a mesma pipeta, e misturar por pipetagem suave. </li><li> Utilizando as mesmas pontas, repetir estes 1: 2 diluições em toda a placa. Rejeitar 100 ul de cada um dos poços na última coluna. </li><li> Levar o volume final de todas as cavidades a 200 ul pela adição de 100 ul de meio para cada poço. incubar plate não perturbadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de CO 2 incubadora. </li><li> Verifique cada poço e marcar todos os poços que contêm apenas uma única colônia. Efectuam-se duas ou mais clonagens até&gt; 90% dos poços contendo clones individuais são positivas para a produção de anticorpos. </li></ol></li><li> Peneirar os clones por western blot e dot blot (protocolo 3,1-4,6). Então colônias subcultura dos poços em navios de maior porte para expandir as células para a obtenção de mAb. Normalmente, cada clone é transferida para um único poço de uma placa de 12 ou 24 poços. </li><li> Medir a afinidade entre os mAbs e os extratos de músculo de vaca, cabra, porco, cão, coelho, atum, frango, selo, e quatro espécies de cetáceos representativos por western blot e dot blot (protocolo 3,1-4,6). </li><li> Inocular células de hibridoma seleccionadas (até 3 x 10 6) intraperitoneal em ratinhos para induzir ascite. inchaço abdominal é tipicamente evidente dentro de 7-10 dias após a injecção de hibridoma. Recolha de fluido utilizando uma agulha hipodérmica(Menos do que um calibre 20). </li><li> fluido de ascites de centrifugação (10.000 xg durante 10 min) para remover as células e detritos. Filtrar através de um filtro de 0,45 um. Adicionar 1 a 20 ml da amostra, 15 ml de tampão de ligação, e de 3 a 5 ml de tampão de eluição à coluna de proteína G-Sepharose. Recolher a fracção de eluição contendo o anticorpo purificado a partir do fluido de ascites ratos. </li><li> Determinar o isotipo de anticorpos pelo kit de isotipagem de anticorpos utilizando as instruções do fabricante. </li></ol> 3. Western Blot <ol><li> Preparar tampão de carga 2x contendo β-mercaptoetanol (BME) por mistura de 950 ul de tampão de amostra Laemmli 2x com 50 ul de BME. Diluir o sobrenadante musculares (protocolo 1,1-1,4) em tampão de carregamento com proporção adequada para a obtenção de bons sinais: 1:50 (cetáceos e focas) e 1: 5 (animais domésticos e atum) quando se utiliza anticorpo Mb policlonal de coelho anti-humano e 1: 1 (porco, coelho, frango e atum), 1: 5 (vaca, cabra e cão) e 1:25 (cetáceos e selo) quando umntibody é a partir do sobrenadante de hibridoma. </li><li> amostra de calor a 95 ° C durante 5 min. Carregar as amostras nas cavidades do gel de SDS-PAGE (acrilamida a 4% de empilhamento e 12% de separação de acrilamida), juntamente com marcadores de peso molecular. Submeter o gel durante 5 min a 50 V, então, aumentar a tensão para 150 V para terminar o prazo em cerca de 1 h. </li><li> Colocar o gel em tampão de transferência 1x durante 15 min. Transferir a proteína separadas para nitrocelulose (NC) membranas depois de serem separados por PAGE. A transferência pode ser realizada a 100 V durante 60-90 min. </li><li> Preparar solução de bloqueio: 1x PBS contendo 0,1% de Tween 20 com 5% de leite em pó magro. Bloquear a membrana de NC em 25 ml de solução de bloqueio à temperatura ambiente durante 1 h. Lavar três vezes durante 5 min cada com 15 ml de solução salina tamponada com fosfato com Tween 20 (PBST). </li><li> Incubar a membrana e o anticorpo primário (fluido de ascites ou sobrenadante de hibridoma) em 10 ml de tampão de diluição do anticorpo diluído com solução de bloqueio 5% a 4 ° C durante a noite. </li><li> Lava-se a Membrane três vezes novamente com PBST para limpar anticorpo excessiva. </li><li> Incubar a membrana com IgG conjugado com fosfatase alcalina de cabra anti-rato a 1: 1250 em solução de bloqueador com agitação suave durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Lava-se a membrana de novo e incubar-lo no cloreto de fosfato de / p-nitroazul de tetrazólio 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP / NBT) mistura de substrato de fosfatase de 10 a 20 min, até o desenvolvimento da cor. </li><li> Parar a reacção por lavagem da membrana em várias mudas de água destilada. </li></ol> 4. Dot Blot <ol><li> Diluir o sobrenadante musculares (protocolo 1,1-1,4) em albumina de soro bovino a 5% (BSA) em PBST com proporção adequada para a obtenção de bons sinais: 1: 5 para animais domésticos e atum, e 01:25 para os cetáceos e focas. Ponto 5 ul de amostras para uma membrana. Minimizar a área que a solução penetra (normalmente 3-4 mm de diâmetro), aplicando-o lentamente. </li><li> Seca-se a membrana à temperatura ambiente (por exemplo, &lt;/ Em&gt; em fluxo laminar durante 30-60 min), bloqueá-lo com a solução em uma placa de Petri de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente, e lavá-lo com PBST. </li><li> Incubar a membrana com anticorpo primário (mAb a partir do sobrenadante de hibridoma em 1: 10.000 ou fluido de ascites a 1: 100000 diluído em solução de bloqueio 5%) durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> Uso PBST para se lavar a membrana três vezes durante 5 minutos cada para remover o excesso de anticorpo, e depois incubar com o anticorpo secundário (anti-IgG de rato alcalina de cabra conjugado com fosfatase a 1: 1250 em 5% de solução de bloqueio) durante 1 hora à temperatura ambiente . </li><li> Lava-se a membrana de novo e incubar-lo na mistura de substrato da fosfatase BCIP / NBT dentro de 10 a 20 min, até o desenvolvimento da cor. </li><li> Parar a reacção por lavagem da membrana em várias mudas de água destilada. </li></ol> 5. ELISA indireta <ol><li> Preparar o tampão de lavagem (0,002 M imidazol solução salina tamponada com 0,02% de Tween 20). Lavar a placa 3 vezes com lavagenstampão entre cada passo seguinte (protocolo 5,2-5,5). </li><li> Prepare diluição 1:25 de sobrenadantes musculares (protocolo de 1,1-1,4) em tampão de revestimento. Bata de uma placa de 96 poços de ELISA com 100 ul sobrenadantes diluídos a 4 ° C durante a noite e bloqueá-lo com tampão (1% de BSA em PBS) de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> Prepare uma diluição do Acm purificada com tampão diluído 2000 e adicionar 100 uL de mAb diluído a cada poço. Incubar a placa durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar IgG de cabra anti-ratinho conjugado com peroxidase de rábano (1: 200 em tampão de diluição diluída) para posterior incubação. </li><li> Adicionar substrato de peroxidase a cada poço (100 ul / cavidade) e incuba-se durante 10-15 min. </li><li> Parar a reacção enzimática pela solução de peroxidase de paragem (100 ul / poço), quando o desenvolvimento da cor é observada. </li><li> Leia a densidade óptica a 450 nm utilizando um espectrofotómetro de microplacas. </li></ol> 6. Preparação de mAb marcado com ouro coloidal </p&gt; Nota: A solução cor de ouro coloidal e a mistura deve ser sempre vermelho. Ajustar o pH, a concentração de mAb, a velocidade de centrifugação quando precipitado preto é notado. Passos 6.1 e 6.2 são passos de otimização. <ol><li> Adicionar purificada detectar mAb (50 ug / ml, 3 ul) a 100 ul de solução de ouro coloidal, com valores de pH variando entre 5-9. O pH mínima que mantém a cor vermelha durante duas horas é considerado como o valor óptimo do pH. Nota: Neste estudo, carbonato de potássio 0,1 M foi utilizada para ajustar o ouro coloidal (40 nm) de solução a pH 8,0 (pH óptimo). </li><li> Adicionar várias quantidades de detectar purificados mAb (a 500 ng / ml, 1-20 ul) com 100 ul de uma solução de ouro coloidal a um pH de 8,0. Nota: A concentração óptima neste estudo é de 6 ug / ml (nenhum precipitado negro). </li><li> De acordo com os resultados acima, adicionar 60? G de mAb purificado detectar gota a gota a 10 ml de uma solução de ouro coloidal. Emulsionar-se a mistura suavemente à temperatura ambiente durante 10 min. de Anúnciosd 2 ml de solução a 5% de BSA em PBS (pH 7,4) à mistura e emulsionar suavemente à temperatura ambiente durante 15 min para reduzir a interferência de fundo. </li><li> Centrifugar a mistura a 10.000 xg durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante com o anticorpo não conjugado e cuidadosamente suspender as pelotas resultantes em 4 ml de PBST contendo 1% de BSA e 0,1% de Tween 20, e repetir centrifugação e suspensão várias vezes. </li><li> Suspender os precipitados finais em 1 ml de PBST e armazená-lo a 4 ° C até ser utilizado. </li></ol> 7. Construção de Immune Faixa Nota: A Figura 1 mostra o desenho tira imune. Preparar e montar as tiras em uma condição ambiental laboratório de baixa umidade (&lt;20% de umidade relativa) para a vida de armazenamento prolongado (&gt; 1 ano). As dimensões de almofadas de membrana e são: conjugado de almofada 300 mm x 10 mm, almofada absorvente 300 mm x 24 mm, amostra almofada 300 mm x 24 mm, NC membrana 300 mm x 25 mm, 300 pasteboardmm x 80 mm. <ol><li> Adicionar solução de mAb marcado com ouro coloidal a partir do passo 6.6 com uma micropipeta para saturar a almofada de conjugado e, em seguida, secar a 37 ° C durante 1 h antes da montagem. </li><li> Distribuir o mAb (500 ug / ml) sobre a zona de teste de captura de antigénio, e de coelho anti-IgG de ratinho específico (500 ug / ml) na zona de controlo para detectar o mAb sobre a membrana de NC utilizando uma impressora pipeta ou imunotira. Manter uma distância (&gt; 5 mm) entre as duas zonas a fim de evitar a interferência. </li><li> Cole o pad conjugado, almofada absorvente e da membrana NC na área de trabalho com fita dupla face. Nota: Sobreposição as almofadas de cada lado da membrana de NC por cerca de 2 mm. construção tira inapropriado resultará em um teste incompleto. </li><li> Coloque a almofada da amostra sobre a almofada de conjugado (2 mm) e colá-lo na área de trabalho. </li><li> Criar 6 mm de tiras largas com um cortador de papel. Embalar as tiras no saco de folha de alumínio com exsicante, e armazená-las a 4 ° C até ser utilizado. </li></ol> Teste 8. A reactividade cruzada <ol><li> Homogeneizar 0,03 g de amostra de músculo em bruto com 1 mL de PBS (contendo 0,1% de BSA) num tubo de centrífuga de 1,5 ml, utilizando uma vara de bambu ou de moagem haste. </li><li> Segure a tira pela extremidade oposta às áreas de teste e mergulhe a parte da amostra pad para a amostra de 5-10 min e observar o resultado diretamente. <ol><li> Opcional: Colete 500 mL sobrenadante e transferi-lo para um novo tubo de centrífuga. Nota: Este passo é sugerido se o sinal não é evidente quando a tira está directamente embebido para o sobrenadante. </li></ol></li><li> Testar várias amostras de músculo em triplicado. Nota: Aqui nós testamos atum, frango, selo, 15 espécies de cetáceos e 5 espécies de mamíferos terrestres. </li><li> Tem cinco inspetores independentes repetir 8,3 por cinco vezes, ou seja, usar 575 faixas no total. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Usando um péptido sintético conjugado com a proteína transportadora é notavelmente mais eficaz em comparação com a sua proteína cognata. Para uma técnica baseada em sanduíche, porque o mAb é desenvolvida usando epitopos com posições relativas conhecidas, os dois mAb neste estudo não são susceptíveis de interferir com a interacção do outro com o epítopo de antigénio alvo. Além disso, a reactividade entre a proteína nativa e o anticorpo de murganhos imunizados com o péptido sintético conjugado pode ser mais forte do que a...

Historicamente, a carne de cetáceos tem sido consumida em muitas partes do mundo e esse consumo continua até hoje1. Devido ao nível trófico dos cetáceos, sabe-se que altos níveis de mercúrio e outras toxinas estão presentes em sua carne2. Portanto, o consumo de carne de cetáceos pode levar a um problema de saúde não apenas para grupos de alto risco, como mulheres grávidas, mas também para a população em geral3. Além disso, a contaminação da carne de cetáceos com patógenos zoonóticos ou potencialmente zoonóticos também pode ocorrer durante seu processamento e armazenamento4. É difícil, mesmo para agentes experientes, identificar carnes de cetáceos apenas por sua aparência. Portanto, é necessário um método científico confiável de identificação para diferenciar a carne de cetáceos de outras carnes. Isso ajudaria a limitar o consumo de carne de cetáceos.
Os métodos atuais de identificação de espécies incluem técnicas moleculares e métodos imunológicos. Técnicas moleculares, como reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento de DNA, podem ser usadas para identificar amostras não apenas de carne crua5 e amostras decompostas6, mas também de alimentos processados, como salsichas cozidas e rações7,8. Métodos imunológicos, como o ensaio imunoenzimático (ELISA), são comumente aplicados na produção de alimentos para detectar o teor de carne de, por exemplo, carne de porco9, carne bovina10 e bagre11. A análise de DNA baseada em PCR para a identificação de carne de cetáceos está disponível12 e ajudou a prevenir o comércio internacional ilegal de carne de cetáceos no Japão, Coréia do Sul, Filipinas, Taiwan, Hong Kong, Rússia, Noruega e Estados Unidos1. Esses métodos são eficazes e confiáveis, mas podem levar horas ou dias para serem concluídos e envolvem etapas trabalhosas. A identificação de carnes de cetáceos é geralmente baseada em técnicas moleculares e atualmente não há método imunológico disponível. Para as agências reguladoras, é altamente desejável desenvolver uma técnica confiável e rápida que possa ser usada no campo para identificar carnes de cetáceos. 
As tiras imunocromatográficas são usadas como ferramentas de detecção com a vantagem de produzir resultados rápidos por meio de um protocolo simples que é adequado para uso em campo. Os princípios da fita imunocromatográfica e do ELISA são muito semelhantes e incluem anticorpos, antígenos e marcadores. Muitos rótulos diferentes, como ouro coloidal, carbono e látex, têm sido usados no desenvolvimento de tiras imunocromatográficas. Atualmente, esse método é comumente usado para detectar antibióticos, toxinas, bactérias e vírus13, mas raramente é usado para identificar proteínas na carne14,15. Aqui propomos um imunoensaio enzimático cromatográfico de fluxo lateral para detecção rápida de mioglobina (Mb) de cetáceos.

<table><tbody><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>AMRESCO</td><td>J373</td><td></td></tr><tr><td>Protein G HP SpinTrap&nbsp;</td><td>GE&nbsp; Coluna giratória Healthcare</td><td>28-9031-34</td><td>contendo Proteína G Sepharose</td></tr><tr><td>IsoStrip Kit de Isotipagem de Anticorpo Monoclonal de Camundongo</td><td>Tiras</td> de Isotipagem <td>Roche 11493027001</td>, <td>pré-revestidas com anticorpos anti-Ig de camundongo específicos de subclasse e cadeia leve</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3935</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulose</td><td>Whatman</td><td>Z613630</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo solução bloqueadora&nbsp;</td><td>LTK BioLaboratories</td><td></td><td>Para minimizar as interações de ligação inespecíficas de IgG inespecífica nas amostras</td></tr><tr><td>de substrato de fosfatase BCIP/NBT&nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-81-00</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Micropoços HRP Detector de Proteínas, Anti-Mouse</td><td>KPL</td><td>54-62-18</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA</td><td>plate Thermo&nbsp; Fisher Scientific</td><td>EW-01928-08</td><td></td></tr><tr><td>Multiskan&nbsp; Leitor EX ELISA&nbsp;</td><td>Termo&nbsp; Elétron Corporação</td><td>51118170</td><td></td></tr><tr><td>Solução de ouro coloidal (40 nm)</td><td>REGA biotecnologia Inc.</td><td></td><td>40-50 nm é apropriado para</td></tr><tr><td>a albumina de soro bovino</td><td>Gibco</td><td>15561-020</td><td></td></tr><tr><td>do immunostrip do teste rápido</td><td>da impressora REGA biotechnology Inc.</td><td>AGISMART RP-1000;</td><td>Adequado apenas para produção em pequena escala de imunotiras para fins de pesquisa e desenvolvimento</td></tr><tr><td>Componentes de tiras (membranas NC, almofadas de amostra (vidro # 33, S & S), almofadas conjugadas (#16S, S& S) e absorventes (CF6, Whatman))</td><td>REGA biotechnology Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freund' s adjuvante e incompleto de Freund' s adjuvante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5881, F5506</td><td>Usado para produzir emulsões de água em óleo de imunógenos</td></tr><tr><td>Acrilamida, tampão de gel, persulfato de amônio (APS), tetrametiletilenodiamina (TEMED)&nbsp;</td><td>Preparação de Protech</td><td></td><td>Gel para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Coomassie azul brilhante R-250</td><td>Bio-Rad</td><td>1610436</td><td>Coloração de proteínas em géis SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Tampão de amostra Laemmli e &beta;-mercaptoetanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610737, 1610710</td><td>Dilua amostras de proteínas antes de carregar em géis SDS-PAGE</td></tr></tbody></table>

desenvolvimento de uma tira de teste imunocromatográfico baseada em ouro coloidal para a detecção de cetáceos myoglobin

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

Este protocolo descreve o desenvolvimento de uma tira de teste imunocromatográfica de ouro coloidal baseada no formato sanduíche que pode ser usada para diferenciar a mioglobina (Mb) de cetáceos daquela de focas e outros animais. A tira fornece triagem rápida e no local para carne de cetáceos, restringindo assim seu comércio e consumo ilegais. Dois anticorpos monoclonais (mAbs) com reatividade em relação ao Mb de cetáceos foram desenvolvidos. As sequências de aminoácidos das regiões reativas antigênicas Mb de vários animais foram analisadas a fim de projetar dois peptídeos sintéticos (um peptídeo geral e um peptídeo específico) e, posteriormente, aumentar os mAbs (subclasse IgG1). Os mAbs foram selecionados a partir de hibridomas triados por ELISA indireto, western blot e dot blot. CGF5H9 foi específico para os Mbs de coelhos, cães, porcos, vacas, cabras e cetáceos, enquanto mostrou fraca ou nenhuma afinidade com os Mbs de galinhas, atuns e focas. CSF1H13 pode ligar focas e cetáceos com forte afinidade, mas não mostrou afinidade com outros animais. Amostras de cetáceos de quatro famílias (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae e Kogiidae) foram utilizadas neste estudo, e os resultados indicaram que esses dois mAbs têm ampla capacidade de ligação a Mbs de diferentes cetáceos. Esses mAbs foram aplicados em uma tira de teste imunocromatográfica de ouro coloidal tipo sanduíche. CGF5H9, que reconhece muitas espécies, foi rotulado com ouro colóide e usado como anticorpo de detecção. CSF1H13, que foi revestida na zona de teste, detectou a presença de cetáceos e focas Mbs. Amostras de músculos de atum, frango, foca, cinco espécies de mamíferos terrestres e 15 espécies de cetáceos foram testadas em triplicata. Todas as amostras de cetáceos apresentaram resultados positivos e todas as outras amostras apresentaram resultados negativos.

Características de anticorpos monoclonais Nós desenvolvemos dois IgG 1 mAbs (CGF5H9 e CSF1H13) reconhecendo dois peptídeos sintéticos (MKASEDLKKHGNTVLC e AIIHVLHSRHPAEFGC), respectivamente, do Mb de cetáceos, e estes foram utilizados para construir uma tira de teste imunocromatográfico do tipo sanduíche ouro coloidal para a rápida detecção de Mb de cetáceos. a Figura 2 mostra que detecta CGF5H9 cetáceos e outros mamíferos como uma única banda manc...

Este protocolo descreve o desenvolvimento de dois anticorpos monoclonais (mAbs) da classe IgG fortemente reativos à mioglobina de cetáceos. Esses mAbs são aplicados em uma tira de teste imunocromatográfica de ouro coloidal baseada no formato sanduíche para diferenciar o Mb de cetáceos de focas e outros animais.

Desenvolvimento de uma tira de teste imunocromatográfico baseada em ouro coloidal para a detecção de Cetáceos Myoglobin

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to ...

O objetivo geral desta tira de teste imunocromatográfica com ouro coloidal é diferenciar a mioglobina de cetáceos daquela de focas e outros animais. Este método pode fornecer triagem rápida e in loco para carne de cetáceos, restringindo assim seu comércio e consumo ilegais. A principal vantagem desta técnica é que um resultado bem-sucedido pode ser observado diretamente em cinco a dez minutos após a homogeneização de 0,3 grama de músculo, com especificidade e sensibilidade notáveis.Portanto, este método pode proporcionar detecção rápida de carne de cetáceos no campo. Também pode ser aplicado a outras carnes, como carne de cavalo ou de porco. Para projetar peptídeos sintéticos para a produção de anticorpos monoclonais com reatividade frente à mioglobina de cetáceos, são analisadas as sequências de aminoácidos das regiões antígenas reativas da mioglobina de diversos animais.Comece recuperando do GenBank as sequências de aminoácidos da mioglobina de atum, frango, avestruz, mamíferos domésticos, foca e 18 espécies de cetáceos. Em seguida, alinhe as sequências usando o software apropriado. Inicie o Alignment Explorer selecionando Alinhar Editar/Construir Alinhamento na barra de inicialização.Selecione Criar Novo Alinhamento e clique em OK. Uma caixa de diálogo aparecerá perguntando se você está criando um alinhamento de sequência de DNA ou proteína. Clique no botão denominado Proteína, selecione Dados Abrir Recuperar sequências do Arquivo e selecione o arquivo de sequência. Selecione o comando de menu Editar Selecionar Tudo para selecionar todos os sítios de cada sequência no conjunto de dados para a criação de um alinhamento múltiplo de sequências.Selecione Alinhamento Alinhar por ClustalW no menu principal. Selecione BLOSUM como matriz de pesos para proteínas e, em seguida, clique no botão OK. O terceiro passo é analisar o alinhamento de sequência.Foque-se em cinco sítios reativos antigênicos e identifique o fragmento conservado entre os cetáceos. Um asterisco simboliza o consenso no alinhamento e indica uma posição com um único resíduo totalmente conservado. Foram encontrados dois fragmentos conservados nos cetáceos.Os fragmentos de sequência candidatos são então sintetizados e utilizados para produzir anticorpos monoclonais. Inicie este procedimento determinando o pH ótimo para a solução de ouro coloidal, definido como o pH mínimo que mantém a mistura de anticorpo monoclonal e solução de ouro coloidal na cor vermelha durante duas horas. Adicione 0,15 microgramas de anticorpo monoclonal purificado de detecção a 100 microlitros de solução de ouro coloidal com valores de pH variando de cinco a nove.Para fins desta demonstração, testam-se os valores de pH seis e pH oito. O pH oito foi considerado o pH ideal nesta etapa de otimização. Em seguida, determine a concentração ideal do anticorpo monoclonal adicionando diversas quantidades do anticorpo monoclonal purificado de detecção a 100 microlitros de solução coloidal de ouro em pH oito.A concentração ideal, que é de seis microgramas por mililitro neste estudo, manterá a cor da mistura vermelha, sem precipitado preto. Com base nos resultados das etapas de otimização, adicione 60 microgramas do anticorpo monoclonal purificado de detecção gota a gota a 10 mL de solução coloidal de ouro. Emulsifique a mistura suavemente à temperatura ambiente por dez minutos.Adicione dois mililitros de uma solução de BSA a 5% em PBS à mistura e emulsifique suavemente à temperatura ambiente durante 15 minutos para reduzir a interferência de fundo. Centrifugue a mistura a 10.000 × g durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante contendo o anticorpo não conjugado e suspenda o pellet resultante em 4 mL de PBS-T contendo BSA a 1% e Tween-20 a 0,1%.Repita a centrifugação e a suspensão uma ou duas vezes. Suspenda os precipitados finais em 1 mL de PBS-T e armazene a quatro graus Celsius até o uso. Um esquema do desenho da tira imunológica é mostrado aqui.As dimensões da cartolina, das almofadas e da membrana de nitrocelulose estão listadas no texto do protocolo. Para prolongar a vida útil do armazenamento, as tiras imunológicas devem ser preparadas e montadas em condições ambientais de laboratório com baixa umidade. Utilize uma micropipeta para adicionar a solução de anticorpo monoclonal marcado com ouro coloidal à almofada de conjugado até saturá-la e, em seguida, seque a almofada a 37 graus Celsius por uma hora antes da montagem.Uma vez que a fita conjugada esteja seca, use fita adesiva dupla face para primeiro colar a membrana de nitrocelulose sobre o papelão. Utilizando uma impressora de imunofitas, distribua o anticorpo monoclonal específico para captura do antígeno e o anticorpo anti-IgG de camundongo rápido nas zonas de teste e de controle, respectivamente, na membrana de nitrocelulose. Mantenha uma distância maior que cinco milímetros entre as duas zonas.Em seguida, cole o suporte do conjugado em um lado da membrana de nitrocelulose e o suporte absorvente no outro lado, sobrepondo os suportes em cada lado em cerca de dois milímetros. Posicione o suporte da amostra sobre o suporte do conjugado em dois milímetros e cole-o no papelão. Use um cortador de papel para criar tiras com seis milímetros de largura.Embal e as tiras em um saco de folha de alumínio com dessicante e armazene a quatro graus Celsius até o uso. Para preparar uma amostra para o teste de reatividade cruzada, adicione 1 mL de PBS contendo 0,1% de BSA a 0,03 gramas de músculo cru. E utilize um palito de bambu ou uma haste de moagem para homogeneizar a amostra.Segure a tira imunológica pela extremidade oposta à área de teste e mergulhe a parte da almofada de amostra no espécime por cinco a dez minutos. Observe o resultado diretamente. Teste várias amostras musculares em triplicata.A linha de teste T é projetada para mostrar um sinal positivo quando ambos os anticorpos monoclonais detectarem mioglobina de cetáceos. Como a mioglobina de animais não cetáceos pode ser detectada apenas por um desses dois anticorpos monoclonais, a linha de teste mostra um resultado negativo quando amostras musculares de outros animais são testadas. A linha de controle C deve sempre mostrar um resultado positivo, porque o anticorpo rápido anti-IGG de camundongo se liga ao anticorpo de detecção marcado com ouro coloidal.Um resultado negativo na linha de Controle indica que a qualidade dos materiais na tira é baixa. A análise sanguínea ocidental utilizando sobrenadantes de hibridoma mostra que o anticorpo monoclonal CGF5H9 detecta cetáceos e outros mamíferos como uma única banda corada em um peso molecular previsto de aproximadamente 17kDa. A baleia-comum (Minke) apresenta uma banda comparativamente mais fraca do que as bandas dos outros cetáceos.As bandas estão ausentes para atum, foca e frango. Já uma banda em aproximadamente 50 kDa é observada para porco. Resultados idênticos são obtidos pela análise de mancha de sangue.Embora a análise sanguínea ocidental utilizando o anticorpo monoclonal CSF1H13 mostre múltiplas bandas inespecíficas para porco e atum, o CSF1H13 é altamente específico porque reage apenas com cetáceos. E a foca apresenta uma banda no peso molecular previsto de aproximadamente 17kDa. Resultados idênticos são obtidos pela análise sanguínea em dot blot.Os resultados do ELISA indireto de extratos musculares de diferentes espécies utilizando CGF5H9 purificado demonstram sinais positivos para bovino, caprino, cão, coelho e cetáceos, um sinal positivo fraco para suíno e sinais negativos para atum, frango e foca. CSF1H13 mostra alta afinidade pelos cetáceos e focas. Ambos os anticorpos monoclonais podem reagir fortemente com as quatro espécies de cetáceos, que pertencem a famílias diferentes, indicando sua ampla reatividade frente a diversas espécies de cetáceos.A especificidade da tira imunológica de ouro coloidal é demonstrada por esses resultados representativos. O uso de amostras de músculo não cetáceo resulta em apenas uma única faixa na linha de controle. No entanto, quando são utilizadas amostras de músculo cetáceo, as faixas de sinal estão presentes tanto na linha de teste quanto na linha de controle.Uma vez dominada, a preparação de anticorpos marcados e a montagem dessas tiras pode ser realizada em quatro horas, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de projetar o peptídeo cuidadosamente. Utilize diversos métodos para triagem de anticorpos monoclonais adequados.E utilize uma alta qualidade de ouro coloidal para preparar anticorpos marcados. Após esses procedimentos, outros métodos, como análises de DNA baseadas em PCR, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a espécie de cetáceo e sua origem. O anticorpo monoclonal CSF1H13, que é potente e exibe afinidade apenas por mamíferos marinhos, pode ser empregado em diversos formatos de ELISA, oferecendo diversas outras oportunidades para estudar os aspectos biológicos, fisiológicos e químicos da mioglobina em mamíferos marinhos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como desenvolver anticorpos monoclonais específicos e, posteriormente, aplicá-los em uma tira de teste rápida.

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Research

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Biology

Biologia

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