Desenvolvimento de uma tira de teste imunocromatográfico baseada em ouro coloidal para a detecção de Cetáceos Myoglobin

O objetivo geral desta tira de teste imunocromatográfica de ouro coloidal é diferenciar a mioglobina dos cetáceos da das focas e de outros animais. Este método pode fornecer triagem rápida e no local para a carne de cetáceos, restringindo assim seu comércio e consumo ilegais. A principal vantagem desta técnica é que um resultado bem-sucedido pode ser observado diretamente em cinco a dez minutos após a homogeneização de 03 gramas de músculo, com especificidade e sensibilidade marcantes.

Portanto, este método pode fornecer detecção rápida de carne de cetáceos no campo. Também pode ser aplicado a outras carnes, como carne de cavalo ou porco. Para projetar peptídeos sintéticos para a criação de anticorpos monoclonais com reatividade em relação à mioglobina de cetáceos, as sequências de aminoácidos de regiões reativas antigênicas da mioglobina de vários animais são analisadas.

Comece recuperando do GenBank as sequências de aminoácidos da mioglobina de atum, frango, avestruz, mamíferos domésticos, focas e 18 espécies de cetáceos. Em seguida, alinhe as sequências usando o software adequado. Inicie o Gerenciador de Alinhamento selecionando Alinhar Editar/Construir Alinhamento na barra de inicialização.

Selecione Criar novo alinhamento e clique em OK. Uma caixa de diálogo aparecerá perguntando: você está construindo um alinhamento de DNA ou sequência de proteína? Clique no botão rotulado Proteína, selecione Dados Abrir Recuperar sequências do Arquivo e selecione arquivo de sequência. Selecione o comando de menu Editar Selecionar Tudo para selecionar todos os locais para cada sequência no conjunto de dados para criar um alinhamento de múltiplas sequências.

Selecione Alinhamento Alinhar por ClustalW no menu principal. Selecione BLOSUM como a matriz de peso da proteína e clique no botão OK. O terceiro passo é analisar o alinhamento da sequência.

Concentre-se em cinco locais reativos antigênicos e encontre o fragmento conservado entre os cetáceos. Um asterisco simboliza o consenso no alinhamento e indica uma posição que possui um único resíduo totalmente conservado. Dois fragmentos conservados em cetáceos foram encontrados.

Fragmentos de sequência candidatos são então sintetizados e usados para criar anticorpos monoclonais. Comece este procedimento determinando o pH ideal para a solução de ouro coloidal definido como o pH mínimo que mantém a mistura de anticorpo monoclonal e solução de ouro coloidal de cor vermelha por duas horas. Adicione 0,15 microgramas de anticorpo monoclonal de detecção purificado a 100 microlitros de solução de ouro coloidal com valores de pH variando de cinco a nove.

Para os fins desta demonstração, pH seis e pH oito são testados. O pH oito foi considerado o pH ideal por esta etapa de otimização. Em seguida, determine a concentração ideal do anticorpo monoclonal adicionando várias quantidades de anticorpo monoclonal de detecção purificado a 100 microlitros de solução de ouro coloidal em pH oito.

A concentração ideal, que é de seis microgramas por mililitro neste estudo, manterá a cor da mistura vermelha sem precipitado preto. Com base nos resultados das etapas de otimização, adicione 60 microgramas de anticorpo monoclonal de detecção purificado gota a gota a 10 mL de solução de ouro coloidal. Emulsione a mistura suavemente em temperatura ambiente por dez minutos.

Adicione dois mililitros de uma solução de 5% BSA em PBS à mistura e emulsione suavemente em temperatura ambiente por 15 minutos para reduzir a interferência de fundo. Centrifugar a mistura a 10 000 vezes g durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante com anticorpo não conjugado e suspenda o pellet resultante em 4mL de PBS-T contendo 1% BSA e 0,1% Tween-20.

Repita a centrifugação e a suspensão uma ou duas vezes. Suspenda os precipitados finais em 1mL de PBS-T e armazene a quatro graus Celsius até o uso. Um gráfico do design da faixa imunológica é mostrado aqui.

As dimensões do papelão, almofadas e membrana de nitrocelulose estão listadas no texto do protocolo. Para prolongar a vida útil do armazenamento, as tiras imunológicas devem ser preparadas e montadas em condições ambientais de laboratório de baixa umidade. Use uma micropipeta para adicionar a solução de anticorpo monoclonal marcado com ouro colóide à almofada conjugada para saturá-la e, em seguida, seque a almofada a 37 graus Celsius por uma hora antes de montar.

Quando a almofada conjugada estiver seca, use fita dupla-face para colar primeiro a membrana de nitrocelulose no papelão. Usando uma impressora de fita imunológica, distribua o anticorpo monoclonal de captura de antígeno específico e o IGG anti-camundongo rápido na zona de teste e na zona de controle, respectivamente, na membrana de nitrocelulose. Mantenha uma distância superior a cinco milímetros entre as duas zonas.

Em seguida, cole a almofada conjugada de um lado da membrana de nitrocelulose e a almofada absorvente do outro lado, sobrepondo as almofadas de cada lado em cerca de dois milímetros. Coloque o bloco de amostra sobre o bloco conjugado por dois milímetros e cole-o no papelão. Use um cortador de papel para criar tiras de seis milímetros de largura.

Embale as tiras em um saco de papel alumínio com dessecante e guarde a quatro graus Celsius até o uso. Para preparar uma amostra para o teste de reatividade cruzada, adicione 1mL de PBS contendo 0,1% BSA a 0,03 gramas de músculo cru. E use uma vara de bambu ou uma haste de moagem para homogeneizar a amostra.

Segure a tira imunológica pela extremidade oposta à área de teste e mergulhe a parte da almofada de amostra na amostra por cinco a dez minutos. Observe o resultado diretamente. Teste várias amostras de músculo em triplicado.

A linha de teste T é projetada para mostrar um sinal positivo quando ambos os anticorpos monoclonais detectam mioglobina de cetáceos. Como a mioglobina de animais não cetáceos só pode ser detectada por um desses dois anticorpos monoclonais, a linha de teste mostra um resultado negativo quando amostras de músculo de outros animais são testadas. A linha de controle C deve sempre mostrar um resultado positivo porque o IGG anti-camundongo rápido se liga ao anticorpo de detecção marcado com ouro coloidal.

Um resultado com falha na linha de controle indica que a qualidade dos materiais na tira é ruim. A análise de sangue ocidental usando sobrenadantes de hibridoma mostra que o anticorpo monoclonal CGF5H9 detecta cetáceos e outros mamíferos como uma única banda corada com um peso molecular previsto de aproximadamente 17kDa. A baleia Minke comum mostra uma faixa comparativamente mais fraca do que as bandas de outros cetáceos.

As bandas estão ausentes para atum, foca e frango. Considerando que uma banda de cerca de 50kDa é observada para porcos. Resultados idênticos são obtidos por análise de sangue por pontos.

Embora a análise de sangue ocidental usando o anticorpo monoclonal CSF1H13 mostre várias bandas inespecíficas para porcos e atum, CSF1H13 é altamente específica porque reage apenas com cetáceos. E a foca tem uma banda com um peso molecular previsto de aproximadamente 17kDa. Resultados idênticos são obtidos por análise de sangue por pontos.

Os resultados do ELISA indireto de extratos musculares de diferentes espécies usando CGF5H9 purificado demonstram sinais positivos para vacas, cabras, cães, coelhos e cetáceos, um sinal positivo fraco para suínos e sinais negativos para atum, frango e foca. CSF1H13 mostra alta afinidade por cetáceos e focas. Ambos os anticorpos monoclonais podem reagir fortemente com todas as quatro espécies de cetáceos que são de famílias diferentes, indicando sua ampla reatividade a diversas espécies de cetáceos.

A especificidade da tira de ouro coloidal imune é demonstrada por esses resultados representativos. O uso de amostras de músculo não cetáceo resulta em apenas uma única banda na linha de controle. No entanto, quando amostras de músculo de cetáceos são usadas, as bandas de sinal estão presentes tanto na linha de teste quanto na linha de controle.

Uma vez dominado, a preparação de anticorpos marcados e essa construção de tiras podem ser feitas em quatro horas se forem realizadas corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de projetar o peptídeo com cuidado. Use vários métodos para rastrear anticorpos monoclonais adequados.

E use um ouro coloidal de alta qualidade para preparar anticorpos marcados. Seguindo esses procedimentos, outros métodos, como análise de DNA baseada em PCR, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a espécie de cetáceo e de onde ela veio. O CSF1H13 anticorpo monoclonal que é forte e exibe afinidade apenas com mamíferos marinhos pode ser empregado em vários formatos de ELISA que oferecem muitas outras oportunidades para estudar os aspectos biológicos, fisiológicos e químicos da mioglobina em mamíferos marinhos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como desenvolver anticorpos monoclonais específicos e, posteriormente, aplicá-los em tiras de teste rápidas.