Um método de quantificação sensível e específico para Determinação do Serum miosina cardíaca Binding Protein-C por Imunoensaio electroquimioluminescência

O objetivo geral deste procedimento é quantificar simultaneamente a proteína C de ligação à miosina cardíaca e a troponina I cardíaca em amostras de soro. Isso é feito primeiro revestindo uma placa de 96 poços com anticorpo da proteína C de ligação à miosina cardíaca para um ensaio plex ou usando um ensaio threeplex pré-codificado. Na segunda etapa, as placas revestidas são incubadas com calibradores e amostras de soro.

Em seguida, os anticorpos de detecção marcados são adicionados na etapa final, um sinal de quimioluminescência é produzido e detectado pelo leitor de placas. Em última análise, os níveis das proteínas cardíacas de interesse presentes nas amostras de soro podem ser determinados por imunoensaios únicos ou múltiplos. No dia anterior ao experimento, pipete 30 microlitros de anticorpo anti-proteína de ligação à miosina cardíaca monoclonal de camundongo sem gelatina no canto inferior de cada poço de uma placa padrão nua de descoberta de escala de missô de 96 poços.

Em seguida, bata nas laterais da placa para espalhar a solução de anticorpos sobre o fundo de cada poço. Após a selagem, incube a placa durante a noite a quatro graus Celsius sem agitar. Na manhã seguinte, bata a solução sobre uma pia e depois sobre uma pilha de toalhas de papel.

Em seguida, adicione 150 microlitros de 1% de bloqueador A em PBS a cada poço para bloquear a ligação não específica. Incubar a placa selada por uma hora à temperatura ambiente agitando a 700 RPM durante a etapa de bloqueio, diluir o fragmento de proteína C de ligação à miosina cardíaca recombinante até uma concentração inicial de 2000 nanogramas por mililitro em 1% de bloqueador A em PBS. Em seguida, diluir esta solução em série por um fator de cinco para um total de sete padrões.

Agora remova a solução de bloqueio como acabamos de demonstrar e, em seguida, lave a placa três vezes com 150 microlitros de 0,05% entre 20 em PBS. Após a terceira lavagem, passe vigorosamente o prato sobre uma pia e, em seguida, bata firmemente no prato uma camada de papel toalha até que esteja completamente seco. Em seguida, pipete 25 microlitros de cada padrão e faça uma amostra nos poços apropriados.

Então, enquanto a placa selada está incubando no agitador por uma hora à temperatura ambiente, dilua o anticorpo de detecção de proteína C de ligação à miosina cardíaca feito sob medida marcado com sul oag a um micrograma por mililitro em 1% bloqueador A em PBS. Depois de lavar cuidadosamente a placa conforme demonstrado, adicione 25 microlitros de solução de anticorpos de detecção a cada poço e, em seguida, incube a placa selada por uma hora em temperatura ambiente enquanto agita durante o período de incubação, execute a placa de demonstração com luzes LED para garantir o funcionamento adequado do gerador de imagens do setor e o software dilua o Reid Buffer neste momento também. Depois de lavar cuidadosamente a placa conforme demonstrado anteriormente, use uma pipeta multicanal para adicionar 150 microlitros de Reid Buffer a cada poço, tomando cuidado para evitar bolhas de ar e, em seguida, escaneie imediatamente a placa no gerador de imagens do setor antes de iniciar o ensaio de três plexos.

Deixe a placa triplex de 96 poços e as soluções diluentes se equilibrarem à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 25 microlitros de 1% de bloqueador A em PBS à placa, certificando-se de que todo o poço esteja coberto por solução e incube a placa selada em temperatura ambiente por 30 minutos enquanto agita. Enquanto isso, dilua a proteína recombinante de ligação à miosina cardíaca C-C-K-M-B e a troponina cardíaca I juntas em 1% do bloqueador A em PBS para criar um padrão contendo 2000 nanogramas por mililitro de proteína C de ligação à miosina cardíaca, 100 nanogramas por mililitro de CKMB e 25 nanogramas por mililitro de troponina cardíaca.

Em seguida, diluo em série essa mistura por um fator de cinco até um volume final de pelo menos 100 microlitros para cada amostra diluída padrão duas vezes com 1% de bloqueador A em PBS. Em seguida, adicione 2 réplicas técnicas de 25 microlitros dos padrões, bem como as amostras aos 25 microlitros de tampão de bloqueio já presentes nos poços da placa de três plex, inclua um branco de diluente somente após incubar a placa selada durante a agitação, dilua os três anticorpos de detecção de oag SUL juntos até uma concentração final de um micrograma por mililitro cada em 1% de bloqueador de solução A e PBS após duas horas. Lave a placa como acabamos de demonstrar e, em seguida, use uma pipeta multicanal para adicionar 25 microlitros de solução de anticorpos de detecção a cada uma.

Bem incubar a placa selada por uma hora agitando a 700 RPM durante o período de incubação. Execute a placa de demonstração e dilua o buffer Reid conforme demonstrado. Em seguida, depois de lavar a placa com 0,05% entre 20 em PBS, use a pipeta multicanal para adicionar 150 microlitros de Reid Buffer a cada poço, evitando bolhas de ar e digitalize imediatamente a placa no gerador de imagens do setor.

Nesta figura, a curva padrão da proteína C de ligação à miosina cardíaca no ensaio plex é comparada à da proteína C de ligação à miosina cardíaca no ensaio de três plex. Ambos os ensaios mostram uma sensibilidade muito alta e uma alta faixa dinâmica. A área de detecção do ensaio é exibida em cinza, plex e três plex.

As curvas padrão da proteína C de ligação à miosina cardíaca são semelhantes. O limite inferior de detecção, o limite inferior de quantificação e o limite superior dos níveis de quantificação são comparáveis nos ensaios plex e triplex. Esses gráficos mostram as curvas padrão da troponina cardíaca I e CKMB da placa triplex.

Ambos os calibradores apresentaram alta sensibilidade e uma grande faixa dinâmica. A área de detecção do ensaio é exibida em cinza. A reatividade cruzada dos anticorpos de detecção com os outros dois calibradores foi estudada incubando as curvas padrão individuais de todos os três calibradores com anticorpos de detecção única, apenas uma baixa quantidade de reatividade cruzada foi observada entre o calibrador CKMB e os anticorpos de detecção de troponina I cardíaca e proteína C de ligação à miosina cardíaca.

Embora nenhuma reatividade cruzada tenha sido observada entre os outros calibradores e anticorpos de detecção como prova da aplicabilidade do ensaio para a detecção de lesão cardíaca, os níveis séricos de 16 indivíduos com infarto do miocárdio foram comparados com um grupo controle usando os níveis séricos de três placas plex da proteína de ligação à miosina cardíaca C-C-K-M-B e troponina cardíaca. Determinei que todos os três biomarcadores estavam aumentados nos pacientes com infarto do miocárdio em comparação com o grupo controle.