Imagens em tempo real de plantas Dynamics da superfície celular com variável de ângulo epifluorescência Microscopia

O objetivo geral deste procedimento é observar o movimento de proteínas marcadas com fluorescência fluorescente em superfícies de células vegetais com microscopia de epifluorescência de ângulo variável. Este vaso pode nos ajudar a progredir no campo da biologia celular vegetal, por exemplo, como as proteínas funcionam nas superfícies das células da placa. A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite visualizar a dinâmica em tempo real das proteínas de ataque fluorescentes antes de iniciar o procedimento.

Calibre a centralização e a focalização do laser do microscópio de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, use um caminho de luz livre de lente objetiva para localizar o centro do teto da sala de microscopia e marque a posição com um selo colorido. Em seguida, ilumine o teto com uma lente objetiva e mova a região iluminada para a posição central.

Em seguida, focalize o laser e ajuste a posição do laser no centro do teto. A centralização e focalização do laser são muito importantes para o sucesso do microscópio episcente de ângulo variável ou da observação VAEM. Os usuários devem ser treinados por um profissional da empresa de microscópio antes de iniciar um experimento.

Quando o microscópio estiver pronto, dispense 30 microlitros de tampão basal no centro de uma lâmina de vidro de 76 por 26 milímetros. Em seguida, use uma tesoura de dissecação para remover uma co-leadina de uma muda de sete dias e flutue a co-leadina com o lado de observação para cima na gota basal do buffer. Em seguida, adicione 30 microlitros de tampão basal no centro de um 18 por 18 milímetros.

Cubra o vidro e vire o vidro de cabeça para baixo. A tensão superficial suave evitará que a gota caia, segurando a lamínula com uma pinça em uma borda. Coloque a borda oposta na lâmina de vidro de modo que o buffer fique sobre a entrada de co.

Em seguida, mantendo a borda da lamínula na lâmina. Ajuste a posição da gota para que fique diretamente acima da amostra de oleína e solte a lamínula. Se não houver bolhas de ar, use lenços de papel sem fiapos para limpar o excesso de tampão e transfira imediatamente a preparação para o microscópio.

Usando a iluminação de campo claro, selecione as células para observação. Em seguida, confirme se a proteína fluorescente pode ser observada e use a iluminação de fluorescência epi para definir a posição do eixo Z na superfície da célula. Para realizar o VAEM, use a caixa do controlador para inclinar o ângulo de entrada do feixe de laser.

Gradualmente, enquanto monitora cuidadosamente a imagem ao vivo. Inicialmente, a imagem aparecerá desfocada. À medida que o ângulo do laser aumenta, a imagem do VAEM fica menos borrada, produzindo uma imagem nítida.

Neste ponto, pare de aumentar o ângulo do laser. Agora tudo bem. Ajuste o ângulo de entrada do laser para obter uma imagem melhor, ajustando os parâmetros ópticos e do sensor de imagem conforme necessário.

Em seguida, usando o software de microscópio comercial, adquira um filme como um arquivo de imagem TIFF de várias páginas. Aqui, o filme mostra pontos marcados com GFP piscando na superfície das células do modelo STA. Para quantificar o tempo de residência DOT rotulado GFP usando Fiji, vá para o menu de abertura de arquivo e abra o arquivo de dica de várias páginas adquirido.

Use a ferramenta de seleção de linha reta para colocar uma linha no lado de interesse. Em seguida, use o plug-in de fatia de resolução dinâmica de pilhas de imagens para gerar uma imagem gráfica. À medida que a linha muda, a imagem do gráfico muda dinamicamente.

Salve a imagem como um arquivo TIFF no arquivo, salve como menu tiff. Em seguida, para realizar uma redução de ruído, vá para o menu de desfoque gaussiano de filtros de processo e aplique um filtro gaussiano às imagens do cronógrafo. O parâmetro sigma radius deve ser ajustado conforme necessário.

Usando a ferramenta de limite de ajuste de imagem, segmente as regiões de sinal por limite e abra o menu de medições do conjunto de análise. Em seguida, verifique o retângulo delimitador na janela de medidas definidas, selecionando o número mínimo de pixels possível. Em seguida, no menu analisar, analisar partículas.

Meça o tempo do ponto de interesse em relação ao eixo Y e verifique os resultados de exibição e adicione às caixas do gerenciador para visualizar os valores dos dados. Por fim, no menu da tabela de resultados, selecione arquivo, salve como e processe o conjunto de dados de durações de imagem de ponto usando o software de análise apropriado. Aqui, os tempos de residência de 185 pontos de patrulha GFP de 12 células subsidiárias independentes na oitava edição, conforme medido pela análise do gráfico chm, são mostrados conforme ilustrado no gráfico.

A função de densidade ajustada revelou que a maioria dos pontos de patrulha GFP residia em uma célula subsidiária por entre dois e 10 segundos, com um pico de cerca de 3,5 segundos. Isso sugere uma rápida exocitose, endocitose das bombas de prótons na superfície celular subsidiária. Depois de trabalhar neste vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar e quantificar a dinâmica de proteínas do tipo ary na superfície da célula vegetal usando microscopia de epifluorescência de ângulo variável.