Imagens em tempo real de plantas Dynamics da superfície celular com variável de ângulo epifluorescência Microscopia

O objetivo geral deste procedimento é observar o movimento de proteínas marcadas com fluorescência nas superfícies de células vegetais por meio de microscopia de fluorescência epiluminiscente com ângulo variável. Este método pode nos ajudar a avançar na área da biologia celular vegetal, por exemplo, compreendendo como as proteínas atuam nas superfícies das células vegetais. A principal vantagem desta técnica é que ela nos permite visualizar a dinâmica em tempo real de proteínas marcadas com fluorescência antes de iniciar o procedimento.

Calibre o centralização e foco do laser do microscópio de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, utilize um caminho óptico livre da lente objetiva para localizar o centro do teto da sala de microscopia e marque a posição com um selo colorido. Depois, ilumine o teto com a lente objetiva e mova a região iluminada para a posição central.

Em seguida, foque o laser e ajuste com precisão a posição do laser ao centro do teto. O centralização e o foco do laser são muito importantes para uma observação bem-sucedida com microscopia epi scent de ângulo variável ou VAEM. Os usuários devem ser treinados por um profissional da empresa do microscópio antes de iniciar um experimento.

Quando o microscópio estiver pronto, dispense 30 microlitros de tampão basal no centro de uma lâmina de vidro de 76 por 26 milímetros. Em seguida, use tesoura de dissecação para remover um coledino de uma plântula com sete dias de idade e coloque o coledino com a face de observação voltada para cima sobre a gota de tampão basal. A seguir, adicione 30 microlitros de tampão basal no centro de uma lâmina de 18 por 18 milímetros.

Cubra o vidro e vire a lamínula com a face voltada para baixo. Suavemente, a tensão superficial impedirá que a gota caia, segurando a lamínula com pinça por uma das bordas. Coloque a borda oposta sobre a lâmina de vidro de modo que o tampão fique sobre a entrada do co-condutor.

Em seguida, mantendo a borda da lamínula apoiada na lâmina, ajuste a posição da gota para que fique diretamente acima da amostra de oleína e solte a lamínula. Se não houver bolhas de ar, utilize tecidos livres de fiapos para remover o excesso de tampão e transfira imediatamente o preparo para o microscópio.

Utilizando iluminação em campo claro, selecione as células para observação. Em seguida, confirme que a proteína fluorescente pode ser observada e use a iluminação de fluorescência epipolarizada para definir a posição do eixo Z na superfície da célula. Para realizar o VAEM, use a caixa de controle para inclinar o ângulo de entrada do feixe a laser.

Gradualmente, enquanto monitora cuidadosamente a imagem em tempo real. Inicialmente, a imagem parecerá desfocada. À medida que o ângulo do laser aumenta, a imagem de VAEM ficará menos desfocada, produzindo eventualmente uma imagem nítida.

Neste ponto, pare de aumentar o ângulo do laser. Agora está bom. Ajuste o ângulo de entrada do laser para obter uma imagem melhor, ajustando os parâmetros ópticos e do sensor de imagem conforme necessário.

Em seguida, utilizando o software comercial do microscópio, adquira um vídeo como um arquivo de imagem TIFF de múltiplas páginas. Aqui, o vídeo mostra pontos marcados com GFP piscando na superfície de células modelo STA. Para quantificar o tempo de residência dos pontos marcados com GFP utilizando o Fiji, vá ao menu abrir arquivo e abra o arquivo TIFF de múltiplas páginas adquirido.

Use a ferramenta de seleção de linha reta para posicionar uma linha no lado de interesse. Em seguida, utilize o plugin de corte dinâmico de pilhas de imagens para gerar uma imagem do gráfico. Conforme a linha for alterada, a imagem do gráfico será atualizada dinamicamente.

Salve a imagem como um arquivo TIFF no menu arquivo, salvar como TIFF. Em seguida, para realizar uma redução de ruído, acesse o menu processar filtros desfoque gaussiano e aplique um filtro gaussiano às imagens cronográficas. O parâmetro do raio sigma deve ser ajustado conforme necessário.

Utilizando a ferramenta de ajuste de limiar de imagem, segmente as regiões de sinal por limiarização e abra o menu analisar definir medições. Em seguida, marque o retângulo delimitador na janela de definição de medições, selecionando o número mínimo possível de pixels. Depois, acesse analisar, menu analisar partículas.

Meça o tempo do ponto de interesse em relação ao eixo Y, verifique os resultados exibidos e adicione às caixas do gerenciador para visualizar os valores dos dados. Por fim, no menu da tabela de resultados, selecione arquivo, salvar como e processe o conjunto de dados das durações das imagens dos pontos usando o software de análise apropriado. Aqui, os tempos de residência de 185 pontos GFP patrol um de 12 células subsidiárias independentes em oito edin, conforme medidos pela análise de gráfico chm, são apresentados conforme ilustrado no gráfico.

A função de densidade ajustada revelou que a maioria dos pontos GFP patrol um permaneceu em uma célula subsidiária entre dois e 10 segundos, com um pico de aproximadamente 3,5 segundos. Isso sugere uma exocitose e endocitose rápidas das bombas de prótons na superfície da célula subsidiária. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como visualizar e quantificar a dinâmica de proteínas do tipo ary na superfície da célula vegetal utilizando microscopia de fluorescência epi com ângulo variável.