Name: Expressão Mammalian Cell eficiente e de uma etapa de purificação extracelular glicoproteínas para a cristalização (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Aprenda a expressão de proteínas glicosiladas secretadas em células 293F para estudos estruturais e cristalografia. Este protocolo rápido e eficiente produz proteínas de alta qualidade em grande escala.

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Este trabalho foi apoiado pelo NIH R01-HL119813 (para TJB), American Lung Association RG-196051 (para TJB), uma bolsa CIMED Pilot and Feasibility (para TJB), American Heart Association Predoctoral Fellowships 14PRE19970008 (para ZY) e 15PRE22110004 (para DLK).

1. Produção de miligramas As quantidades de DNA de plasmídeo para a transfecção transitória em grande escala <ol><li> Clone da proteína de interesse em um número elevado de cópias de mamífero vector de expressão de clonagem utilizando local de restrição, ou outra técnica adequada. <ol><li> Para melhores resultados, use pHLsec 7 vetor, que tem um built-in 6His-tag C-terminal, uma seqüência Kozak promotor forte e um sinal de secreção otimizado. </li></ol></li><li> Transformar o plasmídeo para células competentes. <ol><li> Adicionar 20 ul de células competentes de E. coli em 1 ug de ADN plasmídeo e incubar em gelo durante 30 min. </li><li> Células de choque térmico a 42 ° C durante 35 seg, depois incubar em gelo durante 2 min. </li><li> Adicionar 300 ul de meio de crescimento microbiano (SOC) e incubar a 37 ° C durante 45 min, agitando a 220 rpm. </li><li> Células da placa na placa de agar com selecção antibiótico apropriado. <ol><li> Use 100 ug / ml de carbenicilina se o plasmídeo é no vector pHLsec. </li></ol></li></ol></li><li> Colónias da cultura em 250 ml de Caldo de Luria (LB) suplementado com meios 100 ug / ml de antibiótico (carbenicilina) O / N a 37 ° C, agitação a 220 rpm. </li><li> Purificar o DNA de cultura utilizando Kit Hi-Speed ​​Plasmid Maxi acordo com o protocolo do fabricante. <ol><li> Elui-se o ADN em tampão de EB (Tris 10 mM-Cl, pH 8,5), em vez de tampão TE. </li><li> Alíquota do plasmídeo purificado a quantidade necessária para a transfecção e armazenar a -20 ° C. </li></ol></li></ol> 2. grande escala Cultura e Transient transfecção de células 293F <ol><li> Suplemento de meio 1 L 293F com 10 ml de glutamina e 5 mL de Pen / Strep (ambos 100x). Armazenar a 4 ° C. 5 mL de Pen / Strep é uma força suficiente em condições isentas de soro e a concentração de antibiótico reduzida melhora a viabilidade das células durante a transfecção, o que melhora o rendimento de proteína. </li><li> Cultura células 293F em 300 ml de mídia em 1 L de policarbonato perplexo Erlenmeyers com tampa ventiladas a 37 ° C com 8% de CO2, enquanto agitação num incubador de cultura de tecido padrão. </li><li> Dilui-se as células a 5 x 10 5 / ml de densidade um dia antes da transfecção. </li><li> No dia da transfecção, suplemento de meio de cultura, adicionando 10% de volume de 2% w / v de impulso celular em meios 293F. <ol><li> Medir a concentração de glicose utilizando um monitor de glucose de acordo com as instruções do fabricante e suplementos uso como necessário para alcançar uma concentração de glucose de 500 mg / dL. </li></ol></li><li> Adicionar kifunensine (1 ug / ml de concentração final) nesta etapa de controlar a glicosilação de proteínas. </li><li> Calcular o volume de ADN necessária para 1 ug de plasmídeo por 1 x 10 6 células. Sob condições estéreis, dilui-se ADN em meio isento de soro de 5 ml. </li><li> Calcular o volume de reagente de transfecção necessária para 1 ug de plasmídeo por 2 mL de reagente de transfecção. Sob condições estéreis, dilui-se o reagente de transfecção (PEI-TMC-25) em meio isento de soro de 5 ml. </li><li> Adicionaro reagente de transfecção de ADN em solução em incrementos de 1 ml, misturando suavemente. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente para os complexos ADN-reagente para formar. Em seguida, adicione a solução sobre as células de um modo gota a gota. </li><li> Permitir que as células transfectadas para expressar a proteína de 72-96 horas. Suplemento com ~ 10% de aumento do volume celular de mídia diariamente, ou como necessário para manter a glicose lendo 400-600 mg / dl. </li></ol> 3. Purificação <ol><li> Decantar a cultura para um frasco de centrífuga, centrífuga durante 20 min a 1300 xg para sedimentar as células e em seguida, recolher o sobrenadante. Se necessário, girar uma segunda vez e / ou usar filtro de 0,22 um para clarificar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 10% de tampão de ligação 10 x o volume de Ni-NTA (1,5 M de NaCl, 0,5 MK 2 HPO 4, 0,1 M de Tris pH 8,5, imidazole 50 mM). </li><li> Prepara-se uma coluna de gravidade através da adição de 2 ml de suspensão de Ni-NTA de uma coluna e equilibrando com 10 volumes de coluna (CV) de tampão de ligação 1x. Se possível, fazer todos os passos de coluna em uma sala de 4 ° C. Alternatively, proteína frio e todos os buffers em gelo antes do passo da coluna e manter a proteína e recolhidos flow-through em gelo. Nota: suspensão de Ni-NTA é resina de 50% em volume e capacidade de ligação do dito fabrico é de 50 mg / ml. Pérolas de Ni-NTA pode ser re-carregada para usos múltiplos </li><li> Fluir o sobrenadante sobre a resina e recolher flow-through. Repita este passo. </li><li> Lava-se com 10 VC de tampão de lavagem (300 mM NaCl, 50 mM de K 2 HPO 4, 20 mM de imidazol, pH 8). </li><li> Eluir a proteína em 5 VC de tampão de eluição (NaCl 300 mM, 50 mM de K 2 HPO 4, imidazole 250 mM, pH 8). </li><li> Se deglycosylation é necessário: <ol><li> Para um volume final de 0,5 ml, concentrado eluato para 0,43 ml, utilizando um concentrador de centrifugao. Se se formam precipitados, sedimentar quaisquer detritos por centrifugação a 16.000 xg e 4 ° C. </li><li> Adicionar 50 ul de 500 mM de Na-citrato, pH 5,5. </li><li> Adicionar 20 ul de EndoHf (1 x 10 6 U / mL). Incubar à temperatura ambiente durante 2 h. NãoE: A enzima funciona optimamente a 37 ° C, o que pode fazer com que a proteína concentrada para se agregar. Estender a incubação à temperatura ambiente, se desglicosilação, avaliada por SDS-PAGE ou imunotransferência, é incompleta. A enzima não tem actividade a 4 ° C. </li><li> Para remover EndoHf: Lavar 3x resina de amilose em tampão fosfato salino (PBS), ou tampão de armazenamento final. Incubar proteína com a resina durante 1 hora a 4 ° C. Gire 5 min a 1000 xg para sedimentar pérolas e recolher o sobrenadante. </li><li> Concentrado de proteína utilizando filtro molecular apropriado centrifugação corte de peso e troca de tampão para tampão de armazenamento (150 mM de NaCl e 20 mM de HEPES pH 7,5). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-host+expression+system+for+recombinant+production+of+challenging+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins.</a> PLoS One. 8, e68674(2013).</li>
<li>Chang, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+structural+genomics%3A+solving+the+glycosylation+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem.</a> Structure. 15, 267-273 (2007).</li>
<li>Rich, J. R., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+methods+for+the+production+of+homogeneous+human+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins.</a> Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).</li>
<li>Wu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-2+promotes+macrophage+survival+and+lung+disease+after+respiratory+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection.</a> J Exp Med. 212, 681-697 (2015).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitigated+cytotoxicity+and+tremendously+enhanced+gene+transfection+efficiency+of+PEI+through+facile+one-step+carbamate+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification.</a> Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).</li>
<li>Elbein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosidase+inhibitors%3A+inhibitors+of+N-linked+oligosaccharide+processing%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing.</a> FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).</li>
<li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).</li>
<li>Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+mouse+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells+1+%28TREM-1%29+at+1.76+A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A.</a> J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).</li>
<li>Kober, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+crystallization%2C+and+preliminary+crystallographic+analysis+of+wild-type+and+mutant+human+TREM-2+ectodomains+linked+to+neurodegenerative+and+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases.</a> Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).</li>
<li>Yurtsever, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-cleavage+of+human+CLCA1+protein+by+a+novel+internal+metalloprotease+domain+controls+calcium-activated+chloride+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation.</a> J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).</li>
<li>Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+CLCA1+modulates+TMEM16A+to+activate+Ca-dependent+chloride+currents+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Células HEK 293F oferecer a produção de proteínas que requerem robusta modificações pós-traducionais. Este sistema permite a expressão rápida e escalável de proteínas nativamente dobradas contendo persulfuretos, glicosilação e fosforilação que seriam ausente usando mais ferramentas de expressão de rotina. Além disso, este sistema pode ser usado para a expressão e purificação de complexos de multi-proteínas simplesmente por co-transfecção de plasmídeos múltiplos. Além trem2, este sistema tem sido extensivamente utilizado...

Compreender a estrutura da proteína em nível atômico é a chave para desvendar a base molecular das vias biológicas e as doenças. Cristalografia de raios X da proteína é o método mais amplamente utilizado / aplicável para a determinação de estruturas macromoleculares. O principal desafio deste método é a obtenção de quantidades suficientes de devidamente dobradas, proteína pura. Isto torna-se um problema particular quando se trabalha com as proteínas secretadas de mamíferos, que sofrem modificações pós-tradução específicos. Proteínas expressas em bactérias, são a fonte primária das proteínas cristalizadas depositadas no Protein Data Bank 1. Os sistemas de expressão bacterianos são largamente preferidos porque são rápidos, baratos e geralmente produzem rendimentos elevados de proteína. No entanto, os domínios extracelulares de proteínas de mamífero expressas em bactérias muitas vezes não são correctamente dobrado, em que são necessárias caso de redobragem e purificação extensa passos para a obtenção de forma homogénea folded proteína. Além disso, muitas proteínas de mamíferos necessitam de glicosilação pós-tradução para atingir a dobragem correcta 2. Embora a expressão e a glicosilação em células de levedura ou de insecto pode ultrapassar o problema de dobragem, modificações pós-traducionais, incluindo a glicosilação, são significativamente diferentes das células de mamífero de 3, obtendo-se as proteínas com alterações incorrectos ou não-homogéneas. As células de mamífero expressam toda a maquinaria molecular necessário para assegurar modificações pós-traducionais apropriadas e dobragem; No entanto, esses sistemas de expressão não são tipicamente preferido pela maioria dos laboratórios, devido a rendimentos limitados e os elevados custos de reagentes e materiais de consumo. A polietilenoimina (PEI), um reagente de transfecção padrão é relativamente barato, mas impõe citotoxicidade considerável e baixa eficiência de transfecção, o que resulta em aumento de custos em meio celular, ADN, e equipamentos de cultura. Muitas alternativas para PEI são proibitivamente caras. Abordamosestes problemas, descrevendo uma combinação de melhoria das ferramentas de cultura de células e quimicamente modificados de PEI para o método rápido e relativamente barato para a expressão de proteínas de mamífero secretada, seguido por purificação de um só passo. Este método dá rendimentos robusta suficientes para estudos funcionais e bioquímicos 4, e, em alguns casos, resulta em proteína passível de cristalização sem purificação adicional. Este protocolo descreve várias técnicas para maximizar a expressão e para produzir as proteínas segregadas em mamíferos humano de rim embrionário (HEK 293F) células crescidas em suspensão. Eficiência de transfecção (e custo), a produção e purificação de proteínas são todos bastante reforçada, seguindo este protocolo. PEI modificada pela adição de carbamatos por meio de uma reacção de abertura do anel de um único passo (PEI-TMC-25, síntese e propriedades descritas em detalhe na ref 5) melhora a eficiência da transfecção, reduz a citotoxicidade de catiónicoda ruptura da membrana e, consequentemente, reduz os custos da experiência. Além disso, a viabilidade das células e expressão de proteínas são grandemente melhorada com a adição de suplementos de cultura para fornecimento de glucose e vitaminas. É importante para a produção de proteínas glicosiladas, o tratamento com kifunensine, um inibidor químico não-tóxico de manosidase I, produz proteínas com definidas, glicanos imaturos, que podem ser removidos pelo EndoHf endoglicosidase para produzir proteínas com um único N-acetilglucosamina em lugar de um de comprimento completo 6 glicano N-ligado. Finalmente, a secreção de proteínas em, num meio quimicamente definido isento de soro permite a purificação rápida e fácil para estudos estruturais e bioquímicos. Um único passo de níquel-ácido nitriloacético (Ni-NTA) purificação resina remove a maioria das espécies contaminantes no sobrenadante e, em alguns casos, pode originar proteínas com uma pureza suficiente para a cristalização.

<table><tbody><tr><td>Frascos de Cultura</td><td>GeneMate</td><td>F-5909B</td><td></td></tr><tr><td>293 Freestyle Media</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>Use no lugar do</td></tr><tr><td>reagente de transfecção</td> de glutamina Hype 5 <td>Oz Biosciences</td><td>HY01500</td><td></td></tr><tr><td>293fectin reagente de transfecção</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>12347019</tr><tr><td>Reagente de transfecção PEI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Endo Hf</td><td>NEB</td><td>P0703L</td><td></td></tr><tr><td>Resina de Amilose</td><td>NEB</td><td>E8021S</td><td></td></tr><tr><td>Cell Boost R05.2</td><td>HyClone</td><td>SH30584.02</td><td>Suplemento de Cultura de Células</td></tr><tr><td>GlucCell</td><td>CESCO Bioengineering</td><td>DG2032</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>519850.91</td><td>Serum Free Medium para transfecção de DNA</td></tr><tr><td>Luria Broth (LB Media)</td><td>Life Technologies</td><td>10855-001</td><td></td></tr><tr><td>GC10 Células Competentes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2919</td><td></td></tr></tbody></table>

expressão mammalian cell eficiente e de uma etapa de purificação extracelular glicoproteínas para a cristalização

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

A produção de proteínas secretadas de mamíferos para estudos estruturais e biofísicos pode ser desafiadora, demorada e cara. Aqui descrito é um protocolo eficiente em termos de tempo e custo para expressão de proteínas secretadas em células de mamíferos e purificação em uma etapa usando cromatografia de afinidade de níquel. O sistema é baseado na transfecção transitória em larga escala de células de mamíferos em suspensão, o que diminui muito o tempo de produção de proteína, pois elimina etapas, como o desenvolvimento de vírus de expressão ou a geração de linhagens celulares estáveis. Este protocolo utiliza agentes de transfecção baratos, que podem ser facilmente feitos por simples modificação química, ou agentes de transfecção de preço moderado, que aumentam o rendimento por meio do aumento da eficiência da transfecção e diminuição da citotoxicidade. O monitoramento cuidadoso e a manutenção dos níveis de glicose do meio aumentam o rendimento de proteínas. O controle da maturação de glicanos nativos na etapa de expressão aumenta o rendimento final de proteínas de mamíferos adequadamente dobradas e funcionais, que são propriedades ideais para a realização da cristalografia de raios-X. Em alguns casos, a purificação de etapa única produz proteína de pureza suficiente para cristalização, o que é demonstrado aqui como um caso de exemplo.

Aqui a seguir os resultados deste sistema de expressão aplicada a um domínio segregado 13 kDa imunoglobulina (Ig) a partir da proteína do receptor humano provocando expresso em células mielóides (2 hTREM2, resíduos 19-132). Trem2 é uma proteína transmembranar do tipo I contendo um único domínio Ig extracelular que tem duas ligações de dissulfureto e dois locais de glicosilação N-ligados. Ao contrário de muitas outras proteínas de domínio Ig 8, trem2 não era passível de redobramento de corpos de inclusão bacte...

Este é um protocolo rápido e econômico para a produção de proteínas de mamíferos glicosiladas secretadas e subsequente purificação em uma única etapa com rendimentos suficientes de proteína homogênea para cristalografia de raios-X e outros estudos biofísicos.

Expressão Mammalian Cell eficiente e de uma etapa de purificação extracelular glicoproteínas para a cristalização

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

O objetivo geral desta técnica de expressão de proteínas de mamíferos é produzir quantidades na escala de miligrama de proteínas dobradas de maneira nativa, adequadas para estudos estruturais, biofísicos e funcionais. A principal vantagem desta técnica é que se trata de um protocolo rápido e direto para obtenção de proteínas de mamíferos secretadas e em concentração e pureza necessárias para estudos estruturais. Em geral, observamos que a maioria dos problemas com o rendimento proteico está relacionada à saúde e viabilidade celular.Ao monitorar atentamente a viabilidade celular e também os níveis de açúcar no meio, você melhora significativamente o rendimento de proteína e prolonga a utilidade das células. Também é muito importante monitorar a densidade celular. Observamos que, se em qualquer momento antes da transfeção as células excederem 2 milhões de células por mililitro, o rendimento de proteína será grandemente reduzido. Para realizar o cultivo em larga escala de células 293F, complemente um litro de meio 293F com 10 mililitros de glutamina 100x e cinco mililitros de penestrepto 100x.O antibiótico está em uma concentração suficiente em condições livres de soro, e a concentração reduzida de antibiótico melhora a viabilidade celular durante a transfeção, o que aumenta os rendimentos proteicos do cultivo. Incube as células 293F em 300 mililitros de meio em frascos erlenmeyer de um litro, de policarbonato com placas defletoras e tampas ventiladas, a 37 graus Celsius com 8% de dióxido de carbono, sob agitação em um incubador padrão de cultura de tecidos um dia antes da transfeção; dilua as células para uma densidade de 0,5 milhão de células por mililitro no dia da transfeção. Suplemente o meio de cultura adicionando 10% em volume de reforço celular a 2% em peso por volume ao meio 293F.Adicione kafu visto neste passo para controlar a glicosilação proteica. Prepare o DNA e as soluções de reagente de transfeção em meio livre de soro e incube por cinco minutos. Em seguida, adicione o reagente de transfeção à solução de DNA em incrementos de um mililitro, misturando.Incube suavemente por 30 minutos à temperatura ambiente para formação dos complexos de DNA do reagente. Em seguida, adicione a solução às células em gotas, permitindo que as células transfectadas expressem a proteína por 72 a 96 horas para purificar a glicoproteína. Primeiro, decante o cultivo para um frasco de centrífuga e centrifugue por 20 minutos a 1300 Gs. Para sedimentar as células, colete o sobrenadante e, se necessário, centrifugue uma segunda vez e/ou use um filtro de 0,22 mícron para clarificar o sobrenadante.Em seguida, adicione 10% do volume de níquel nitrato, ácido tris acético ou tampão de ligação NTA com níquel 10 x. Então, prepare uma coluna por gravidade a quatro graus Celsius, adicionando dois mililitros da suspensão de NTA com níquel a uma coluna e equilibrando com 10 volumes de coluna de tampão de ligação 1 x, mantido a quatro graus Celsius. Passe o sobrenadante sobre a resina e colete o eluato.Após verter o sobrenadante sobre a coluna, realize uma lavagem com 10 volumes de coluna do tampão de lavagem. Em seguida, elua a proteína em cinco volumes de coluna do tampão de eluição. Se for necessária desglicosilação para um volume final de 0,5 mililitros, concentre o EIT até 0,43 mililitros utilizando um concentrador por centrifugação e remova qualquer resíduo por centrifugação a 16.000 ×g e 4 °C.Em seguida, adicione 50 microlitros de citrato de sódio 500 milimolar, pH 5,5 e 20 microlitros de endo HF. Incube a mistura à temperatura ambiente por duas horas para remover o endo HF; primeiro, lave a resina de amilose três vezes com solução salina tamponada com fosfato. Incube a proteína com a resina lavada por uma hora a quatro graus Celsius.Após a incubação, centrifugue por cinco minutos a 1000 Gs para sedimentar a resina e coletar o sobrenadante. Concentre a proteína utilizando um filtro de centrifugação com corte de peso molecular apropriado e faça a troca de tampão para o tampão de armazenamento indicado. Abaixo estão resultados representativos de eletroforese em gel de SDS-PAGE para uma proteína secretada expressa em células tratadas com cine, após cromatografia de afinidade por níquel.A primeira fileira é a proteína antes da desglicosilação, e a segunda fileira é a proteína após a desglicosilação por endo hf. A proteína glicosilada migra cerca de 10 kilodaltons acima e, em seguida, se condensa em uma única faixa compatível com o peso molecular previsto após a desglicosilação, após a etapa única de purificação. Os cristais foram montados utilizando o método da gota suspensa.A imagem superior mostra o primeiro cristal obtido, e a imagem inferior mostra as condições de cristalização otimizadas. Isso demonstra que a homogeneidade bioquímica da proteína de interesse pode ser um fator determinante para o sucesso da cristalização, e um sistema de expressão em mamíferos otimizado produz proteínas adequadas para essa cristalização. A purificação adicional da proteína purificada por níquel é facilmente realizada por cromatografia de exclusão por tamanho.Este também é um passo útil para avaliar a produção proteica e otimizar as condições para obter proteínas corretamente dobradas. A proteína de interesse deve ser a espécie majoritária na eluição cromatográfica, e o volume de eluição deve corresponder ao peso molecular da proteína. Tempos de EEU anteriores podem sugerir agregação ou mau dobramento da proteína uma vez dominado.Essa técnica pode ser realizada em quatro dias se executada corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante manter condições estéreis para o cultivo celular. Após seguir este procedimento, outros métodos como exclusão por tamanho, cromatografia, espalhamento de luz em múltiplos ângulos e fluorometria por varredura diferencial podem ser realizados para avaliar o estado de oligomerização e a estabilidade térmica da proteína.

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Biology

Biologia

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High Yield Expressão de proteínas recombinantes humanas com o Transient transfecção de células HEK293 em suspensão

Apresentamos abordagens para a caracterização estrutural e biofísica das glicoproteínas com a dobra de imunoglobulina por cristalografia de raios x, Calorimetria de Titulação Isotérmica e interferometria de biolayer.

Caracterização de Glicoproteínas com Dobra da Imunoglobulina por Cristalografia de Raios-X e Técnicas Biofísicas

A purificação dos canais iônicos é muitas vezes um desafio, mas uma vez alcançado, pode potencialmente permitir investigações em vitro das funções e estruturas dos canais. Aqui, descrevemos os procedimentos passo a passo para a expressão e purificação de proteínas de mamíferos bestrophin, uma família de Ca2 +-ativado canais Cl– .

Expressão e purificação dos canais de íon Bestrophin mamíferos

Este protocolo descreve técnicas utilizadas para determinar as estruturas do canal de íon pela microscopia cryo-elétron, incluindo um sistema de baculovirus usado eficientemente expressar genes em células de mamíferos, com esforço mínimo e toxicidade, extração de proteínas, purificação, e verificação de qualidade, preparação da amostra grade e triagem, bem como coleta de dados e processamento.

Expressão e purificação de TRPC3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de Single-particle Cryo-elétron

Este protocolo descreve um setup para a cristalização do transportador de esterol ABCG5/G8. ABCG5/G8 é reconstituído em bicelas para cristalização em gota suspensa. O protocolo não requer materiais ou substratos especializados, tornando-o acessível e de fácil adaptação em qualquer laboratório para determinação da estrutura da proteína através da cristalografia de raios X.

Cristalização ABCG5/G8 em Ambiente Bitela Lipídica para Cristalografia de Raios-X

Estudos estruturais e bioquímicos de transportadores de membrana humana requerem quantidades de miligramas de proteína estável, intacta e homogênea. Aqui descrevemos métodos escaláveis para selecionar, expressar e purificar transportadores de solutos humanos usando genes otimizados para códons.

Expressão de alto rendimento e purificação de carreadores de solutos humanos para estudos estruturais e bioquímicos

Aprenda a expressão de proteínas glicosiladas secretadas em células 293F para estudos estruturais e cristalografia. Este protocolo rápido e eficiente produz proteínas de alta qualidade em grande escala.

Expressão Mammalian Cell eficiente e de uma etapa de purificação extracelular glicoproteínas para a cristalização

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