Expressão Mammalian Cell eficiente e de uma etapa de purificação extracelular glicoproteínas para a cristalização

O objetivo geral desta técnica de expressão de proteínas de mamíferos é produzir quantidades na escala de miligrama de proteínas dobradas de maneira nativa, adequadas para estudos estruturais, biofísicos e funcionais. A principal vantagem desta técnica é que se trata de um protocolo rápido e direto para obtenção de proteínas de mamíferos secretadas e em concentração e pureza necessárias para estudos estruturais. Em geral, observamos que a maioria dos problemas com o rendimento proteico está relacionada à saúde e viabilidade celular.

Ao monitorar atentamente a viabilidade celular e também os níveis de açúcar no meio, você melhora significativamente o rendimento de proteína e prolonga a utilidade das células. Também é muito importante monitorar a densidade celular. Observamos que, se em qualquer momento antes da transfeção as células excederem 2 milhões de células por mililitro, o rendimento de proteína será grandemente reduzido. Para realizar o cultivo em larga escala de células 293F, complemente um litro de meio 293F com 10 mililitros de glutamina 100x e cinco mililitros de penestrepto 100x.

O antibiótico está em uma concentração suficiente em condições livres de soro, e a concentração reduzida de antibiótico melhora a viabilidade celular durante a transfeção, o que aumenta os rendimentos proteicos do cultivo. Incube as células 293F em 300 mililitros de meio em frascos erlenmeyer de um litro, de policarbonato com placas defletoras e tampas ventiladas, a 37 graus Celsius com 8% de dióxido de carbono, sob agitação em um incubador padrão de cultura de tecidos um dia antes da transfeção; dilua as células para uma densidade de 0,5 milhão de células por mililitro no dia da transfeção. Suplemente o meio de cultura adicionando 10% em volume de reforço celular a 2% em peso por volume ao meio 293F.

Adicione kafu visto neste passo para controlar a glicosilação proteica. Prepare o DNA e as soluções de reagente de transfeção em meio livre de soro e incube por cinco minutos. Em seguida, adicione o reagente de transfeção à solução de DNA em incrementos de um mililitro, misturando.

Incube suavemente por 30 minutos à temperatura ambiente para formação dos complexos de DNA do reagente. Em seguida, adicione a solução às células em gotas, permitindo que as células transfectadas expressem a proteína por 72 a 96 horas para purificar a glicoproteína. Primeiro, decante o cultivo para um frasco de centrífuga e centrifugue por 20 minutos a 1300 Gs. Para sedimentar as células, colete o sobrenadante e, se necessário, centrifugue uma segunda vez e/ou use um filtro de 0,22 mícron para clarificar o sobrenadante.

Em seguida, adicione 10% do volume de níquel nitrato, ácido tris acético ou tampão de ligação NTA com níquel 10 x. Então, prepare uma coluna por gravidade a quatro graus Celsius, adicionando dois mililitros da suspensão de NTA com níquel a uma coluna e equilibrando com 10 volumes de coluna de tampão de ligação 1 x, mantido a quatro graus Celsius. Passe o sobrenadante sobre a resina e colete o eluato.

Após verter o sobrenadante sobre a coluna, realize uma lavagem com 10 volumes de coluna do tampão de lavagem. Em seguida, elua a proteína em cinco volumes de coluna do tampão de eluição. Se for necessária desglicosilação para um volume final de 0,5 mililitros, concentre o EIT até 0,43 mililitros utilizando um concentrador por centrifugação e remova qualquer resíduo por centrifugação a 16.000 ×g e 4 °C.

Em seguida, adicione 50 microlitros de citrato de sódio 500 milimolar, pH 5,5 e 20 microlitros de endo HF. Incube a mistura à temperatura ambiente por duas horas para remover o endo HF; primeiro, lave a resina de amilose três vezes com solução salina tamponada com fosfato. Incube a proteína com a resina lavada por uma hora a quatro graus Celsius.

Após a incubação, centrifugue por cinco minutos a 1000 Gs para sedimentar a resina e coletar o sobrenadante. Concentre a proteína utilizando um filtro de centrifugação com corte de peso molecular apropriado e faça a troca de tampão para o tampão de armazenamento indicado. Abaixo estão resultados representativos de eletroforese em gel de SDS-PAGE para uma proteína secretada expressa em células tratadas com cine, após cromatografia de afinidade por níquel.

A primeira fileira é a proteína antes da desglicosilação, e a segunda fileira é a proteína após a desglicosilação por endo hf. A proteína glicosilada migra cerca de 10 kilodaltons acima e, em seguida, se condensa em uma única faixa compatível com o peso molecular previsto após a desglicosilação, após a etapa única de purificação. Os cristais foram montados utilizando o método da gota suspensa.

A imagem superior mostra o primeiro cristal obtido, e a imagem inferior mostra as condições de cristalização otimizadas. Isso demonstra que a homogeneidade bioquímica da proteína de interesse pode ser um fator determinante para o sucesso da cristalização, e um sistema de expressão em mamíferos otimizado produz proteínas adequadas para essa cristalização. A purificação adicional da proteína purificada por níquel é facilmente realizada por cromatografia de exclusão por tamanho.

Este também é um passo útil para avaliar a produção proteica e otimizar as condições para obter proteínas corretamente dobradas. A proteína de interesse deve ser a espécie majoritária na eluição cromatográfica, e o volume de eluição deve corresponder ao peso molecular da proteína. Tempos de EEU anteriores podem sugerir agregação ou mau dobramento da proteína uma vez dominado.

Essa técnica pode ser realizada em quatro dias se executada corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante manter condições estéreis para o cultivo celular. Após seguir este procedimento, outros métodos como exclusão por tamanho, cromatografia, espalhamento de luz em múltiplos ângulos e fluorometria por varredura diferencial podem ser realizados para avaliar o estado de oligomerização e a estabilidade térmica da proteína.