Expressão Mammalian Cell eficiente e de uma etapa de purificação extracelular glicoproteínas para a cristalização

O objetivo geral desta técnica de expressão de proteínas em mamíferos é produzir quantidades de miligramas de proteínas dobradas nativamente adequadas para estudos estruturais, biofísicos e funcionais. A principal vantagem desta técnica é que é um protocolo rápido e direto para a obtenção de proteínas secretadas de mamíferos e uma concentração de pureza necessária para estudos estruturais. Geralmente, descobrimos que a maioria dos problemas com o rendimento de proteínas se deve à saúde e viabilidade celular.

Ao monitorar de perto a viabilidade celular e também monitorar os níveis de açúcar do meio, você melhora muito o rendimento da proteína e prolonga a utilidade das células. Também é muito importante monitorar a densidade celular. Descobrimos que se a qualquer momento antes da transfecção as células excederem 2 milhões de células por mililitro, o rendimento da proteína será bastante reduzido Para realizar a cultura em larga escala de 2 células 93 F, suplemente um litro de meio 2 93 F com 10 mililitros de 100 x glutamina e cinco mililitros de 100 x estreptococos de caneta.

O antibiótico tem força suficiente em condições livres de soro e a concentração reduzida de antibiótico melhora a viabilidade celular durante a transfecção, o que melhora a produção de proteínas na cultura. As 2 células 93 F em 300 mililitros de meio em um litro, frascos erlenmeyer defletores de policarbonato com tampas ventiladas a 37 graus Celsius com 8% de dióxido de carbono enquanto agitam em uma incubadora de cultura de tecidos padrão um dia antes da transfecção diluem as células para 0,5 milhão de células por mililitro de densidade no dia da transfecção. Complemente o meio de cultura adicionando 10% de volume de 2% de peso por volume de aumento de células em 2 93 F meios.

Adicione kafu visto nesta etapa para controlar a glicosilação de proteínas. Preparar soluções de DNA e reagentes de transfecção em meio livre de soro e incubar por cinco minutos. Em seguida, adicione o reagente de transfecção à solução de DNA em incrementos de um mililitro, misturando.

Incube suavemente por 30 minutos em temperatura ambiente para que os complexos de DNA do reagente se formem. Em seguida, adicione a solução às células De forma gota, permita que as células transfectadas expressem proteína por 72 a 96 horas para purificar a glicoproteína. Primeiro decantar a cultura para um balão de centrifugação durante 20 minutos a 1300 Gs.To peletizar as células, recolher o supernat e, se necessário, centrifugar uma segunda vez e/ou utilizar um filtro de 0,22 mícrons para clarificar o sobrenadante.

Em seguida, adicione 10% do volume de 10 x carga nitro de níquel, ácido triacético ou tampão de ligação NTA de níquel. Em seguida, prepare uma coluna de gravidade a quatro graus Celsius adicionando dois mililitros da pasta de níquel NTA a uma coluna e equilibrando com 10 volumes de coluna de um tampão de ligação x trabalhando a quatro graus Celsius. Flua o sobrenadante sobre a resina e colete o fluxo.

Depois de despejar o sobrenadante, flua sobre a coluna, lave com 10 volumes de coluna de tampão de lavagem. Em seguida, eluir a proteína em cinco volumes de coluna de tampão de eluição. Se a desglicosilação for necessária para um volume final de 0,5 mililitros, concentre EIT a 0,43 mililitros usando um concentrador de centrifugação para pulverizar quaisquer detritos por centrifugação a 16.000 GS e quatro graus Celsius.

Em seguida, adicione 50 microlitros de citrato de sódio 500 milimolar, pH 5,5 e 20 microlitros de endo hf. Incube a mistura em temperatura ambiente por duas horas para remover o endo HF primeiro lave a resina de amilose três vezes em solução salina tamponada com fosfato. Incube a proteína com a resina lavada por uma hora a quatro graus Celsius.

Após a incubação, gire por cinco minutos a 1000 Gs para pellet a resina e coletar o sobrenadante. Concentre a proteína usando um corte de peso molecular apropriado, filtro de centrifugação e troca de tampão no tampão de armazenamento mostrado. Aqui estão os resultados representativos da página SDS para uma proteína secretada expressa em células tratadas com cine após cromatografia de afinidade de níquel.

A primeira pista é a proteína antes da desglicosilação, e a segunda pista é a proteína após a desglicosilação por endo hf. A proteína glicosilada corre cerca de 10 quilodaltons mais alta e, em seguida, colapsa para uma única banda consistente com o peso molecular previsto após a desglicosilação, após a única etapa de purificação. As telas de cristal foram montadas usando o método de gota suspensa.

A imagem superior mostra o acerto inicial do cristal e a imagem inferior mostra as condições de cristalização otimizadas. Isso demonstra que a homogeneidade bioquímica da proteína de interesse pode ser um fator determinante para o sucesso da cristalização, e um sistema de expressão otimizado de mamíferos produz proteínas passíveis dessa cristalização. A purificação adicional da proteína purificada com níquel é prontamente feita por cromatografia de exclusão de tamanho.

Este também é um passo útil para avaliar a produção de proteínas e otimizar as condições para produzir proteínas devidamente dobradas. A proteína de interesse deve ser a espécie principal na eluição cromatográfica, e o volume de eluição deve corresponder ao peso molecular da proteína. Antes. Os tempos de EEU podem sugerir agregação ou dobramento incorreto da proteína Uma vez dominada.

Esta técnica pode ser feita em quatro dias se realizada corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante manter condições estéreis para a cultura de células após este procedimento. Outros métodos como tamanho, cromatografia de exclusão, espalhamento de luz multiangular e varredura diferencial, fluorometria podem ser realizados para avaliar o estado de oli ização e a estabilidade térmica da proteína.