Sintonizar um paralelo Coluna Segmentada fluxo e permitindo a detecção multiplexada

O objetivo geral deste procedimento de CLAE é ajustar uma coluna de fluxo segmentado paralelo para permitir a detecção multiplex. Este método responde a questões fundamentais nas áreas de saúde e bem-estar, ciências ambientais, perícia criminal e quaisquer áreas que exijam a análise de amostras complexas, como a descoberta bioquímica. Esta técnica permite a análise abrangente da amostra, além de fornecer informações sobre as naturezas química e bioativa de substâncias em misturas complexas.

Os protocolos de detecção múltipla também permitem uma análise rápida. Este método possibilita o desenvolvimento de estratégias para definir a impressão química de misturas complexas, como café e vinho, permitindo que os fabricantes distingam seus produtos de variedades falsificadas mais baratas. Inicialmente, pode parecer pouco convencional não enviar toda a amostra para apenas um detector para análise precisa.

No entanto, a concentração do analito em cada fluxo é maior do que a do fluxo total de uma coluna convencional. Para começar, configure o instrumento de CLAE com água UE a 100% e metanol puro como fases móveis A e B, respectivamente. Se for utilizado um detector de EM, adicione 0,1% de ácido fórmico a ambas as fases móveis e, em seguida, purgue as bombas de CLAE de acordo com as instruções do fabricante.

Monte os detectores MS UV VS e DPPH, conforme as instruções do fabricante. Certifique-se de que os componentes estejam dispostos adequadamente, de modo que o volume morto nas linhas dos detectores seja mínimo.

Em seguida, ajuste o comprimento de onda do detector UV VISTA ao comprimento de onda específico da amostra aqui. 280 nanômetros para o detector MS. Utilize o modo positivo para a contagem total de íons ou análise de TIC com o método de detecção por varredura completa.

Equilibre a temperatura e o fluxo de gás do detector de espectrometria de massas aos seguintes valores: temperatura do vaporizador de 500 graus Celsius, temperatura da capilaridade de 350 graus Celsius, fluxo de gás auxiliar de 40 unidades, fluxo de gás de varredura de cinco unidades, taxa de gás de envolvimento de 60 unidades e tensão de pulverização de 3,5 quilovolts. Para preparar o reagente radical DPPH, comece dissolvendo 25 miligramas do radical DPPH em 250 mililitros de metanol em um balão volumétrico.

Adicione 250 microlitros de ácido fórmico à solução e sonique a solução por 10 minutos. Em seguida, cubra o frasco com papel alumínio para evitar a exposição à luz. Depois, purgue a bomba com a solução do radical DPPH conforme orientado pelo fabricante para montar o sistema de radical DPPH.

Certifique-se de que a linha da bomba esteja presa à entrada de uma peça em T e, em seguida, conecte a bobina de reação de 100 microlitros à saída da peça em T. Conecte o detector à outra extremidade da bobina de reação, à caixa ENC, à bobina de reação e ao aquecedor de coluna. Por fim, ajuste o detector UV de radicais DPPH para 520 nanômetros.

Para construir a coluna de fluxo segmentado paralelo ou coluna PSF, conecte primeiro a entrada da coluna ao instrumento de CLAE. Em seguida, utilize um trecho de tubo para conectar o orifício central ao detector de EM. Utilize tubos de mesmas dimensões para conectar um orifício periférico da coluna ao detector UV-Vis e outro ao tubo em T do sistema de detecção do radical DPPH.

Bloqueie todas as portas periféricas não utilizadas com tampões de coluna. Ajuste a taxa de fluxo da CLAE para um mililitro por minuto de fase móvel B a 100% para uma coluna de 4,6 milímetros de diâmetro interno e 250 milímetros de comprimento. Equilibre por 20 minutos.

Para iniciar o ajuste do sistema PSF, primeiro descarte os frascos coletores vazios. Utilize esses frascos para coletar separadamente a fase móvel proveniente das portas UV VS e DPPH. Anote o período de coleta e colete pelo menos 500 miligramas de solvente em cada frasco.

Em seguida, pese os frascos de coleta para determinar a massa da fase móvel e divida a massa pela densidade do metanol para calcular o volume da fase móvel coletada de cada porta. Por fim, determine a vazão para o detector de espectrometria de massas (MS) e calcule as proporções de fluxo para todos os detectores como uma porcentagem do fluxo total, conforme descrito no protocolo textual. Se as proporções de fluxo diferirem substancialmente dos valores ideais, adicione tubos adicionais conforme necessário para ajustar a pressão de contrapressão e repita o processo de coleta e cálculo.

Por fim, ajuste a vazão da bomba do reagente radical DPPH para igualar a vazão do porto de saída conectado ao detector. Uma análise HPLC multiplexada foi realizada em uma amostra de café. A capacidade de registrar simultaneamente os cromatogramas UV e MS do radical DPPH permite que os compostos da amostra que responderam positivamente ao radical DPPH sejam facilmente associados ao UV vs.

E as respostas de EM com base no alinhamento do tempo de retenção em que foi observada uma resposta positiva pelo detector TIC do EMS, a massa molecular do pico foi registrada. A facilidade em associar picos entre diferentes processos de detecção permite uma forma rápida e mais eficiente de triagem e caracterização de uma amostra complexa, como o café. Uma vez dominada, esta técnica pode ser montada em cerca de uma hora e ficar pronta para análise da amostra seguindo este procedimento. Outros detectores, como índice de refração, fluorescência, e detecções baseadas em reações químicas, como quimioluminescência, podem ser utilizados para obter informações adicionais sobre a amostra.

Após assistir a este vídeo, você deverá reconhecer a importância dos processos de detecção multiplexada para obter uma compreensão mais ampla de uma amostra complexa. Além disso, a detecção multiplexada utilizando colunas paralelas de fluxo segmentado é uma maneira extremamente eficiente de realizar a exploração biológica.