Caracterização do tecido depois de um novo método de desagregação para a pele Micro-enxertos Generation
4 de março de 2016
O protocolo descreve um novo método para desagregar os tecidos humanos e para criar micro-enxertos autólogos que, combinado com esponjas de colagénio, dá origem à bio-complexos humanos, prontos para utilização no tratamento de lesões da pele. Além disso, este sistema preserva a viabilidade das células de micro-enxertos em diferentes momentos após a desagregação mecânica.
O objetivo geral dessa invenção cirúrgica é produzir microenxertos cutâneos autólogos prontos para serem utilizados imediatamente na mesma cirurgia com finalidades de cicatrização de feridas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de medicina regenerativa e engenharia de tecidos cutâneos sobre questões como cicatrização de feridas crônicas, queimaduras e úlceras pós-traumáticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela é muito fácil de usar por médicos sem técnica especializada, além de ser rápida e acessível.
Para começar, utilize um punch de biópsia para coletar amostras de pele de um paciente. Em seguida, remova e descarte a camada epitelial. Combine cada amostra de tecido com 1 mililitro de solução salina para gerar microenxertos autólogos.
Para preparar biocomplexos para aplicação clínica, transfira 1 mililitro da solução de microenxerto para esponjas de colágeno. Aplique imediatamente o biocomplexo na área lesionada do paciente. Para testar in vitro a viabilidade do biocomplexo.
Após três dias de cultivo, despeje formalina 0,3% diretamente sobre os biocomplexos e fixe por 10 minutos em temperatura ambiente. Use um micrótomo para cortar seções com 5 micrômetros de espessura e monte-as diretamente em uma lâmina de vidro. Em seguida, coloque as seções em 15 a 20 mililitros de xilol por três minutos.
Em seguida, mergulhe as fatias em etanol com concentrações decrescentes por uma hora cada antes de colocá-las em água desionizada para desparafinizar e reidratar os cortes. Em seguida, utilize de 1 a 2 mililitros de hematoxilina a 1 grama por litro por um a dois minutos para corar os cortes. E transfira para água para remover o corante.
Agora, com 1 a 2 mililitros de Eosina Y a 1% e etanol a 70%, dilua em água e cora as seções por quatro a cinco minutos. Em seguida, use água corrente da torneira para lavar as lâminas. Mergulhe as seções em concentrações crescentes de etanol por uma hora cada, antes de um período de incubação de uma hora em xilol.
Por fim, aplique um meio de montagem à base aquosa às amostras antes de adicionar uma lamínula. Em seguida, observe ao microscópio óptico com aumento de 100x. Usando um dermatomo, obtenha amostras de 0,6 milímetro, 1 milímetro ou 0,2 milímetro de espessura da derme papilar, tecido morto ou derme, respectivamente, das regiões do tronco de quatro doadores de múltiplos tecidos com idades entre 40 e 55 anos, conforme as normas nacionais sobre coleta.
Coloque as amostras em NaCl 0,9% e posicione em um agitador orbital durante cinco minutos para lavar suavemente o tecido. Com um punch de biópsia de 5 milímetros, obtenha amostras com diâmetro uniforme do tecido da pele, epiderme e derme, e pese todos os espécimes teciduais. Em seguida, insira oito, três ou quatro amostras uniformes de tecido da pele, epiderme ou derme, respectivamente, no disruptor de tecidos e adicione 1,5 mililitros de solução salina para a desagregação.
Realize a desagregação para todas as amostras de tecido conforme indicado nesta tabela. Utilize um número correspondente de biópsias por punção obtidas de amostras de tecido intactas como controles. Após a desagregação mecânica, aspire a solução salina contendo microenxertos e coloque cada amostra separadamente em um único poço de uma placa de 12 poços.
Adicione 1 mililitro de meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS e antibióticos a cada amostra. Para avaliar a viabilidade celular, adicione a cada poço 1 mililitro de meio contendo 0,5 miligramas por mililitro de solução de MTT e incube a 37 °C e 5% de dióxido de carbono por três horas. Após a incubação, remova o meio de MTT e substitua por 1 mililitro de DMSO.
Após a incubação por 10 minutos, transfira cada amostra em DMSO para uma cubeta e utilize um espectrofotômetro para ler a densidade óptica a 570 nanômetros. Calcule a viabilidade celular como a razão entre a absorbância a 570 nanômetros e o peso em gramas do tecido utilizado antes da desagregação. Em seguida, após a solução salina ter sido aspirada do tecido cutâneo, coloque separadamente as amostras de epiderme e derme provenientes de um único doador em um poço de uma placa de 12 poços para teste de viabilidade celular ou em um frasco de cultura para análise morfológica.
Adicione 1 mililitro de RPMI-1640 com 10% de FBS e antibióticos à placa de 12 poços ou 5 mililitros ao frasco de cultura e cultive a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas ou sete dias, respectivamente. Após 24 horas, utilize microscopia de luz para realizar análise morfológica, avaliando a presença de suspensão celular. Repita no sétimo dia.
Com a análise por FACS, analise as amostras de derme quanto a marcadores de células mesenquimais e hematopoiéticas, como CD146, CD34 e CD45. Adicione meio aos células desagregadas e, em seguida, incube a 37 graus Celsius por três dias. E avalie a esterilidade do tecido realizando análise microbiológica conforme descrito anteriormente.
Como mostrado aqui, microenxertos autólogos humanos imediatamente carregados em suporte de colágeno foram implantados em uma lesão na perna. E uma reepitelização completa associada à reparação do tecido foi observada após 30 dias. Além disso, o acompanhamento clínico mostrou boa textura e maciez da área lesada após cinco meses.
Conforme listado nesta tabela, foram estabelecidos os limites de oito, quatro e três biópsias que podem ser processadas em uma única etapa, e os tecidos foram dissociados em quatro momentos diferentes para identificar as condições ideais de dissociação que mantenham boa viabilidade celular. A dissociação mecânica demonstrada neste vídeo mantém um valor médio de 30% de viabilidade celular em todas as amostras de pele, epiderme e derme, quando avaliada em diferentes momentos em relação ao tecido intacto. Este enxerto mostra que após 24 horas ou sete dias em cultura, nenhuma variação substancial da viabilidade celular em amostras de tecido cutâneo foi observada no momento da homogeneização em cultura em comparação com o tempo inicial.
No entanto, observou-se uma viabilidade reduzida de amostras mortas após 24 horas em cultura em comparação com o tempo inicial. Porém, a viabilidade celular foi restaurada após sete dias em cultura. Resultados semelhantes foram observados para o tecido dérmico.
Quando dominada, esta técnica pode ser realizada em cinco minutos, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de remover a camada epitelial da pele. Após este procedimento, outros métodos, como a desagregação do tecido ósseo, podem ser realizados para responder outras questões, como o mecanismo de cicatrização óssea.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de medicina regenerativa e engenharia de tecidos explorarem a cicatrização tecidual em pacientes. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar este procedimento de microenxerto. Não se esqueça de que trabalhar com tecidos pode ser extremamente perigoso.
E as precauções, como o uso de óculos de segurança, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um novo método cirúrgico para a criação de microenxertos cutâneos autólogos que podem ser utilizados imediatamente para cicatrização de feridas. A técnica enfatiza facilidade de uso e acessibilidade financeira, tornando-a viável para profissionais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Medicina regenerativa
- Engenharia de tecidos cutâneos
Antecedentes
- Cura de feridas crônicas
- Tratamento de queimaduras
- Úlceras pós-traumáticas
- Importância da viabilidade celular em enxertos
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para o uso imediato de microenxertos de pele
- Aprimorar a compreensão da regeneração da pele
- Fornecer uma solução prática para a cicatrização de feridas
Métodos Utilizados
- Punção biópsia para coletar amostras de pele
- Remoção da camada epitelial
- Combinação das amostras de tecido com solução salina
- Criação de microenxertos autólogos
Resultados Principais
- Desagregação bem-sucedida de tecidos humanos
- Preservação da viabilidade celular em microenxertos
- Preparação rápida de enxertos para uso imediato
- Aplicações potenciais em diversos cenários de cicatrização de feridas
Conclusões
- O método é eficiente e de fácil uso para clínicos
- Oferece uma abordagem promissora para o tratamento de lesões cutâneas
- Pesquisas futuras podem expandir suas aplicações na medicina regenerativa
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a produção rápida de microenxertos autólogos para uso clínico imediato na cicatrização de feridas, atendendo necessidades não satisfeitas no manejo de lesões crônicas. Ao preservar a viabilidade celular e a esterilidade, ele oferece confiança preditiva em aplicações regenerativas. A abordagem fornece uma solução escalável e economicamente eficaz para fluxos de trabalho em engenharia de tecidos cutâneos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da composição celular em tecido cutâneo dissociado, incluindo a identificação de células-tronco mesenquimais para testes de hipóteses terapêuticas.
- Valor Operacional: Fornece um protocolo padronizado e rápido de dissociação que reduz a variabilidade no isolamento de células primárias para estudos de validação de alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera suspensões celulares viáveis e heterogêneas adequadas para triagem fenotípica e ensaios funcionais em modelos de regeneração dérmica.
- Valor Operacional: Produz microenxertos padronizados compatíveis com scaffolds de colágeno, permitindo o preparo reprodutível de ensaios para triagem de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a viabilidade celular e a esterilidade por sete dias em cultura, permitindo a avaliação longitudinal da integração do enxerto e dos mecanismos de reparo tecidual.
- Valor Operacional: Fornece bio-complexos autólogos prontos para uso, que conectam a descoberta científica e a validação pré-clínica em modelos de cicatrização de feridas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na continuidade entre descoberta e pré-clínico ao permitir a geração rápida de sistemas celulares derivados da pele, caracterizados, para estudos mecanicistas e translacionais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre viabilidade celular e multipotência em tecido cutâneo dissociado por meio de citometria de fluxo e ensaios de viabilidade.
- Triagem: Permite a preparação padronizada de microenxertos para avaliação consistente de compostos em ensaios de regeneração dérmica.
- Análises: Fornece resultados quantitativos, incluindo métricas de viabilidade celular (normalização de OD570) e confirmação de assepsia, para tomada de decisões baseada em dados.
- Pesquisa Translacional: Mantém a fidelidade biológica de células derivadas de pele humana ao longo do tempo de cultivo, apoiando a continuidade pré-clínica em modelos de cicatrização de feridas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho de dissociação reutilizável, aplicável a múltiplos tipos de tecidos (pele, derme, derme desepidermizada), para pesquisa e desenvolvimento baseados em plataforma.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva por meio da manutenção da viabilidade celular e esterilidade, reduzindo ambiguidades mecanicistas nos resultados regenerativos.
- Valor Operacional: Processo padronizado e rápido (5 minutos) de desagregação com exigência mínima de expertise técnica, aumentando a produtividade do laboratório.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais rápidas de prosseguir ou interromper programas de cicatrização ao fornecer enxertos prontos para uso imediato com propriedades biológicas caracterizadas.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos regenerativos por meio da produção confiável e escalável de microenxertos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer treinamento no manuseio asséptico de tecidos e na remoção da camada epitelial para garantir a integridade da amostra.
- Depende do acesso a um disruptor de tecidos, centrífuga, espectrofotômetro e citometria de fluxo para avaliação de viabilidade e esterilidade.
- Necessita padronização do tempo de dissociação e do volume da biópsia entre diferentes locais de uso para manter rendimentos celulares consistentes.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o protocolo a diferentes densidades de tecido ou fontes de doadores.
- Limitado pela necessidade de processamento imediato após a dissociação para preservar a viabilidade, pois atrasos podem afetar a consistência dos ensaios subsequentes.
