Caracterização do tecido depois de um novo método de desagregação para a pele Micro-enxertos Generation

O objetivo geral desta invenção cirúrgica é produzir microenxertos de pele autólogos prontos para serem usados imediatamente na mesma cirurgia para fins de cicatrização de feridas. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da medicina regenerativa e engenharia de tecidos da pele sobre coisas como cicatrização de feridas crônicas, queimaduras e úlceras pós-traumáticas. A principal vantagem desta técnica é que é muito fácil de usar pelo médico sem técnica expectisile, e é tão rápida e acessível.

Para começar, use um punção de biópsia para coletar amostras de pele de um paciente. Em seguida, remova e descarte a camada epitelial. Combine cada amostra de tecido com 1 mililitro de solução salina para gerar microenxertos autólogos.

Para preparar biocomplexos para aplicação clínica, transfira 1 mililitro da solução de microenxerto para esponjas de colágeno. Aplique imediatamente o biocomplexo na área lesionada do paciente. Para in vitro, testar a viabilidade do biocomplexo.

Após três dias de cultivo, despeje 0,3% de formalina diretamente nos biocomplexos e fixe por 10 minutos em temperatura ambiente. Use um micrótomo para cortar seções de 5 micrômetros de espessura e monte diretamente em uma lâmina de vidro. Em seguida, coloque seções em 15 a 20 mililitros de xileno por três minutos.

Em seguida, mergulhe as fatias em graus decrescentes de etanol por uma hora cada antes de colocá-las em água deionizada para desparafinizar e reidratar as seções. Em seguida, use 1 a 2 mililitros de 1 grama por litro de hematoxilina por um a dois minutos para manchar as seções. E transfira para a água para enxaguar a mancha.

Agora com 1 a 2 mililitros de 1%Eosina Y e 70%etanol e dilua em água, manche as seções por quatro a cinco minutos. Em seguida, use água corrente da torneira para enxaguar as lâminas. Mergulhe as seções em concentrações crescentes de etanol por uma hora cada antes de uma incubação de uma hora em xileno.

Por fim, aplique um meio de montagem à base de samples antes de adicionar uma lamínula. Em seguida, observe sob um microscópio óptico com ampliação de 100x. Usando um dermátomo, colete amostras papilares, mortas ou dérmicas de 0,6 milímetro, 1 milímetro ou 0,2 milímetro de espessura, respectivamente, das áreas do tronco de quatro doadores de tecidos múltiplos de 40 a 55 anos, seguindo as regras nacionais de colheita.

Coloque as amostras em 0,9% NaCl e coloque em um agitador orbital por cinco minutos para enxaguar suavemente o tecido. Com um punção de biópsia de 5 milímetros, crie amostras com diâmetro uniforme do tecido da pele, morto e derme, e pese todas as amostras de tecido. Em seguida, insira oito, três ou quatro amostras uniformes de tecido cutâneo, morto ou derme, respectivamente, no disruptor tecidual e adicione 1,5 mililitros de solução salina para a desagregação.

Efectuar a desagregação de todas as amostras de tecido, tal como indicado no presente quadro. Use um número correspondente de biópsias por punção derivadas de amostras de tecido intacto como controles. Após a desagregação mecânica, aspirar a solução salina contendo microenxertos e colocar cada amostra separadamente em um único poço de uma placa de 12 poços.

Adicione 1 mililitro de meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS e antibióticos a cada amostra. Para avaliar a viabilidade celular, a cada poço adicione 1 mililitro de meio contendo 0,5 miligramas por mililitro de solução de MTT e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três horas. Após a incubação, remova o meio MTT e substitua por 1 mililitro de DMSO.

Após incubação por 10 minutos, transfira cada amostra em DMSO para uma cubeta e use um espectrofotômetro para ler a densidade óptica em 570 nanômetros. Calcule a viabilidade celular como a proporção de absorbância a 570 nanômetros e o peso e gramas de tecido usado antes da desagregação. Em seguida, uma vez aspirada a solução salina do tecido cutâneo, amostras mortas e dérmicas de um único doador, coloque cada amostra separadamente em um poço de uma placa de 12 poços para um teste de viabilidade celular ou um frasco de cultura para análise morfológica.

Adicione 1 mililitro de RPMI-1640 com 10% de FBS e antibióticos à placa de 12 poços ou 5 mililitros ao frasco de cultura e cultura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas ou sete dias, respectivamente. Em 24 horas, use microscopia de luz para realizar a análise morfológica avaliando a presença de suspensão celular. Repita no sétimo dia.

Com a análise FACS, analise as amostras de derme de marcadores de células mesenquimais e hematopoiéticas, como CD146, CD34 e CD45. Adicione meio às células desagregadas e incube a 37 graus Celsius por três dias. E avaliar a esterilidade do tecido realizando análises microbiológicas conforme descrito anteriormente.

Como mostrado aqui, microenxertos autólogos humanos imediatamente carregados no suporte de colágeno foram implantados em uma lesão na perna. E uma reepitelização completa associada ao reparo tecidual foi observada após 30 dias. Além disso, o acompanhamento clínico mostrou boa textura e maciez da área lesada após cinco meses.

Conforme listado nesta tabela, foram estabelecidos os limiares de oito, quatro e três biópsias que podem ser processadas em uma única etapa, e os tecidos foram desagregados em quatro momentos diferentes para identificar condições ótimas de desagregação para manter a boa viabilidade celular. A desagregação mecânica demonstrada neste vídeo mantém um valor médio de 30% de viabilidade celular em todas as amostras de pele, morta e derme, quando avaliada em diferentes momentos em relação ao tecido íntegro. Este enxerto mostra que após 24 horas, ou sete dias em cultura, nenhuma variação substancial da viabilidade celular em amostras de tecido cutâneo foi observada no momento da homogeneização em cultura em comparação com o tempo de início.

No entanto, foi observada uma viabilidade reduzida de amostras mortas após 24 horas em cultura em comparação com o tempo de início. Mas a viabilidade celular foi restaurada após sete dias em cultura. Resultados semelhantes foram observados para a derme.

Quando dominada, essa técnica pode ser feita em cinco minutos se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de remover a camada epitelial da pele. Após este procedimento, outros métodos, como a desagregação do tecido ósseo, podem ser realizados para responder a outras questões, como o mecanismo de cicatrização óssea.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da medicina regenerativa e engenharia de tecidos explorarem a cicatrização de tecidos em pacientes. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar esse procedimento de microenxerto. Não se esqueça de que trabalhar com o tecido pode ser extremamente perigoso.

E os cuidados como óculos de segurança devem sempre ser tomados durante a realização deste procedimento.