Usando Tomoauto: Um Protocolo de métodos de alta capacidade automatizada Cryo-Electron Tomografia

O objetivo geral deste procedimento é ajudar os usuários a estabelecer um pipeline de coleta e processamento de alto rendimento de tomografia crioeletrônica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da tomografia crioeletrônica, como: como lidar com os dados coletados com detectores de nova geração e processar uma grande quantidade de dados produzidos pelo software automatizado de coleta da série tilt? A principal vantagem dessa técnica é que o usuário pode configurar vários pacotes de software de maneira unificadora, para encontrar um pipeline eficiente para o processamento automatizado de séries de inclinação, permitindo que mais tempo seja gasto na análise do tomograma.

Geralmente, os indivíduos novos no crio-ET terão dificuldades porque muitas etapas tediosas são necessárias para lidar com dados massivos gerados pelo microscópio eletrônico. Tivemos a ideia para esse desenvolvimento há cinco anos, quando tivemos que passar manualmente por centenas de etapas para obter uma reconstrução 3D de uma bactéria. Com antecedência, consulte o protocolo de texto sobre a preparação das minicélulas Shigella flexneri.

Em seguida, prepare as grades de microscopia eletrônica conforme explicado por uma publicação JoVE existente e também documentado no protocolo de texto. Depois de carregar o estágio EM com a coleção de minicélulas embutidas em gelo vitrificado, comece a coletar mapas de baixa ampliação para a série de inclinação. Ao visualizar a tela fluorescente em baixa ampliação, de cerca de 2300x, encontre quadrados de grade que sejam aceitáveis para imagem.

Este local deve conter gelo fino e o assunto de interesse sem contaminantes. Em seguida, ajuste a visualização para o centro do quadrado da grade e clique no botão Adicionar posição do palco para salvar o local. Em seguida, repita o processo até que todos os quadrados de grade aceitáveis tenham sua localização salva.

A próxima etapa começa com a abertura de um novo arquivo de montagem. Na caixa de diálogo de configuração, defina X e Y para que todo o quadrado da grade seja capturado. Para uma grade padrão de 200 mesh, crie um espaço de 10 por 10 com um valor de Binning alto, como oito.

Alterne também a opção de mover estágio em vez de mudar a imagem e a opção pular correlações usadas para alinhar as peças. Agora, na janela Navegador, selecione a primeira posição de estágio a ser adquirida usando a alternância Adquirir. Continue fazendo isso para cada posição do palco.

Em seguida, no menu Navegador, clique em Adquirir em pontos. Na caixa de diálogo que se abre, alterne adquirir imagem do mapa e eucentricidade aproximada. Desalterne todas as outras opções.

Em seguida, clique em prosseguir e uma montagem será feita para cada posição do palco. Continue trabalhando com o software SerialEM. No Navegador, selecione os mapas adquiridos e clique em Carregar mapa.

Em seguida, clique em Adicionar pontos e selecione os pontos no mapa onde a série de inclinação deve ser adquirida. Depois de fazer as seleções, clique em Parar de adicionar pontos e repita o processo com cada mapa coletado. Em seguida, abra os parâmetros no menu Câmera e defina os modos Foco, Teste e Gravação.

A opção de registrar dados fracionados de dose pode ser de interesse especial, e isso pode ser especificado nas opções de registro. Para continuar, selecione um dos pontos no mapa visualizado no momento e alterne a opção tilt-series na janela Navegador. Na caixa de diálogo que é aberta, escolha os parâmetros para a série de inclinação.

Em seguida, repita o processo de alternar a opção de série de inclinação para cada um dos pontos selecionados no mapa. Em seguida, no Navegador, inicie a opção Adquirir em pontos. Na caixa de diálogo, alterne as Tarefas preliminares, Realinhar ao item, Foco automático e Eucentrismo aproximado.

Em seguida, defina a Tarefa Primária para adquirir séries de inclinação e escolha fechar vals de coluna no final para fechar a coluna quando todos os pontos tiverem sido coletados. Quando o processo é executado, uma série de tilt será coletada em cada ponto alternado para a coleta de séries de tilt em cada mapa. Com a série de inclinação original, o log de saída do SerialEM e as imagens fracionadas de dose individuais, todas no diretório de trabalho atual, em um terminal, execute o seguinte comando para remover o artefato de movimento induzido pelo feixe.

Prossiga com o alinhamento e a reconstrução da série de inclinação. Digite o comando tomoauto no terminal da seguinte maneira. Ao comando, anexe o nome do arquivo da série tilt ao processo, seguido pelo diâmetro fiducial em nanômetros.

Se o processamento CTF não for desejado, basta omitir a opção do comando. Este comando é o principal uso do tomoauto, permitindo que os usuários executem todos os processos envolvidos no alinhamento de uma série tilt, que originalmente exigia intervenção manual do usuário, em um único comando, permitindo que os usuários criem scripts de processamento em lote rapidamente. Agora, usando o comando 3dmod, examine a série de inclinação alinhada em busca de erros gritantes.

Aqui filename é o nome da série tilt sem sufixo. Em seguida, inspecione o CTF estimado com o comando mostrado aqui. Novamente, filename é o nome da série tilt sem sufixo.

Além disso, no log de saída produzido pelo comando tomoauto, verifique o erro residual do alinhamento. Esta é uma medida quantitativa da qualidade geral do alinhamento. Se o alinhamento for aceitável, prossiga com o cálculo da reconstrução.

Este comando é definido para corrigir o CTF e apagar os marcadores fiduciais usados no alinhamento da série de inclinação. Para ignorar a inspeção visual e ir diretamente para a reconstrução, use este comando. Tomoauto tem muitas opções acessíveis.

Um em particular é a capacidade de incluir configurações locais descritas por um arquivo auxiliar, de acordo com a documentação do tomoauto. Inclua o nome deste arquivo na caixa de diálogo da linha de comando usando a opção de configuração local antes de anexar o nome do arquivo tilt-series. A capacidade de criar arquivos de configuração local é o recurso mais poderoso do tomoauto, permitindo que os usuários configurem totalmente todos os comandos usados, ajustando a execução para conjuntos de dados específicos ou difíceis, mantendo o processamento automatizado.

Dentro do protocolo de teste estão instruções adicionais sobre como executar a média do subtomograma. Seguindo os protocolos descritos, foram feitas duas séries de tilt alinhadas com tomoauto. O alinhamento fino é calculado a partir de um modelo que define idealmente as coordenadas do marcador fiducial.

A 50 graus, uma série de inclinação rastreou as partículas de ouro corretamente, indicando um alinhamento aceitável. Enquanto, no caso da segunda série de inclinação, vários pontos do modelo, mostrados em vermelho, se desviaram de seu marcador dourado correspondente, ilustrando que o modelo não produziu um alinhamento adequado. Quando as séries de inclinação são coletadas, o tomoauto alinha com sucesso 80 a 90% das séries de inclinação coletadas.

Após a reconstrução, o tomograma final é um volume 3D da amostra de imagem. Isso pode então ser usado para anotação celular por segmentação ou média de subtomograma para obter informações de maior resolução da maquinaria molecular dentro da amostra. A média do subtomograma de 2,7 nanômetros da Shigella flexneri anexada depositada no EMDB mostra a grande melhoria dessa técnica em relação à visualização do injetossoma em um único tomograma.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como coletar e processar dados de tomografia crioeletrônica usando SerialEM e tomoauto de maneira automatizada e de alto rendimento. Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para coletar quase 100 séries de tilt em um dia, se for executada corretamente, e alinhar uma série de tilt em 20 minutos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de sempre verificar a qualidade do alinhamento da série de inclinação.

Se um conjunto de tilt-series não se alinhar bem, tente alinhar manualmente e transfira os parâmetros para uma configuração local. Após este procedimento, outros métodos, como a média do subtomograma, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como determinar a estrutura de alta resolução de complexos macromoleculares. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da crio-EM explorarem estruturas in situ de alta resolução em bactérias, vírus e outros organismos.