Name: Isolamento e Caracterização do mouse Antral Oócitos Baseado em Nucleolar organização da cromatina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-07T12:00:01.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Aprenda a caracterizar oócitos antrais de camundongo com base na organização da cromatina nucleolar. Este método distingue oócitos SN e NSN para estudos de biologia do desenvolvimento e reprodução.

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M.M. e C.A.R. agradecem o apoio financeiro do Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 da Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M e C.A.R. desejam agradecer a Marianna Longo por ajudar na preparação das imagens.

Este protocolo é realizado em conformidade com os princípios orientadores da Europeia (UE) e 63/2010 (26/2014) leis italianas que protegem animais usados ​​para pesquisa científica. Cervical eutanásia deslocamento é utilizado para isolamento e ovários é realizada por peritos e indivíduos listados no protocolo aprovado cobrindo este estudo treinado. 1. Os animais <ol><li> Manter adulto de 3 a 6 semanas de idade ratos fêmeas em uma sala com temperatura e umidade controladas (com fases de 12L: 12E e alimentados ad libitum). </li><li> Injetar camundongos por via intraperitoneal com 2,5 UI de gonadotrofina de égua prenhe (PMSG) para estimular o crescimento folicular, imitando os efeitos do hormônio folículo estimulante (FSH). Isolar os ovários para oócitos antrais 48hrs coleção posteriores. Euthanize o mouse fêmea anteriormente injectados com PMSG, de acordo com suas diretrizes institucionais. </li><li> Remover rapidamente os ovários da cavidade do corpo e colocá-los para o cont placa de Petriaining meio M2, para posterior isolamento oócitos (ver secção 3). <ol><li> Realizar uma incisão na pele que cobre a parede abdominal, seguida por uma incisão no peritoneu utilizando tesouras de dissecação estéreis. Abra a incisão para expor o abdómen, mover os intestinos de um lado usando pinças estéreis e localizar os tubos uterinos, formando uma forma em V a partir da bexiga. </li><li> Observar os ovários localizados abaixo dos rins. Mantenha cada tubo com pinça estéril e fazer uma pequena incisão na parte inferior dos ovários a libertá-los. Transferir ambos os ovários, na parte inferior de uma placa de Petri contendo meio de pré-equilibrada. </li></ol></li></ol> 2. Preparação Hormone <ol><li> Diluir PMSG (disponível em diferentes concentrações de estoque) com solução salina isotónica estéril para se obter uma concentração de trabalho de 2,5 UI por hormona de 0,1 ml para um volume de injecção apropriado. NOTA: As soluções da hormona deve ser dividido em alíquotas em tubos de 0,5 ml e armazenados a -20 ° C até ao dia da utilização. Não manter partes aliquotas diluídas com mais de três meses a -20 ° C. Uma vez descongelado, se injecções são realizadas em série, armazenar as alíquotas de soluções de hormonas a +4 ° C e utilizá-los dentro de 4 dias. </li></ol> 3. Antral Oócitos Isolamento Para o isolamento de oócitos adequada: <ol><li> Equilibrar meio M2 13 (M2) com 5% de CO 2 e 37 ° C durante pelo menos 1 h antes de iniciar o procedimento de isolamento de oócitos. Preparar duas placas de Petri (35 mm x 10 mm), um deles com 1 ml de M2 ​​para perfurar ovário e o segundo com pequenas gotas (20 ul) de M2 ​​coberta com óleo mineral (~ 1,5 ml) para transferência de oócitos após isolamento a partir da ovário (ver 3.4-3.6). Manter ambos os pratos de Petri em incubadora a 5% de CO 2 e 37 ° C até estar pronto para ser utilizado. </li><li> Use um microscópio estereoscópico durante procedimentos de isolamento oócitos. </li><li> Prepare finas pipetas de vidro boca para recolher os ovócitos com fitahing pipetas de Pasteur de vidro mantido na horizontal (segurando as extremidades da pipeta com as duas mãos), ao longo de um vertical da chama proveniente do bico de Bunsen (Figura 1). <ol><li> Uma vez que o vidro começa a derreter, pegue a pipeta para fora da chama e realizar um movimento de puxar rápido para obter a pipeta desejado. Firmemente cortar o vidro em excesso perto do ponto estreito da pipeta com unhas para ajustar o comprimento e o diâmetro interno do capilar. Assegure-se que a fina capilar tem um diâmetro interno de ~ 100 pm, ligeiramente maior do que o diâmetro do oócito (~ 80? M). </li><li> Para boca pipeta, ligar-se uma extremidade do tubo de aspiração para a pipeta puxado utilizando uma ponta apropriada e colocar a outra extremidade na boca, prendendo-o com os dentes. </li></ol></li><li> Recolher os ovários usando pinças estéreis e depositá-los na parte inferior de um prato de cultura de células de petri (35 mm x 10 mm). Cobri-los com 1 ml de M2, previamente equilibrada a 37 ° Ce 5% de CO 2 (Figura 2). </li><li> Suavemente perfurar os folículos antrais dos ovários com uma agulha de seringa estéril para libertar insulina oócitos antrais em M2 (Figura 3). </li><li> Suavemente boca pipetar os oócitos através de uma pipeta de Pasteur estreita para remover as células foliculares e qualquer outro restos de tecido possível (Figura 4A) e em seguida resolver-los na parte inferior de pequenas gotas (20 ul) de m2 de área coberta com óleo mineral adequado para a cultura de embriões (anteriormente preparados; A Figura 4B). NOTA: É importante remover todas as células de cumulus ligados à zona pelúcida dos oócitos por pipetagem contínua através de vários e diferentes gotas de M2. Execute esta etapa o mais rápido possível para evitar alterações no pH do meio. </li></ol> 4. Antral Oócitos Coloração com Hoechst33342 NOTA: ovócitos antrais podem ser distinguidos na SN (Cercado nucléolo), NSN (Não Rodeado nucléolo) ouem qualquer outra forma intermédia, com base na sua organização da cromatina após coloração com concentração de Hoechst33342 supravital (ou quaisquer outros marcadores específicos de bases AT 14). Na verdade, os oócitos SN mostrar um anel Hoechst-positiva em torno do nucléolo enquanto a NSN não, daí o seu nome. Para a coloração oócitos adequada: <ol><li> Transferir os oócitos utilizando uma pipeta de boca em gotas de Hoechst33342 (20 ul), diluído em M2 na concentração supravital de 50 ng / mL durante 10 min no escuro. </li><li> Após a incubação com Hoechst33342, transferir cada um único oócito com uma pipeta de boca na parte inferior de pequenas gotas (5 ul) de m2 de área coberta com óleo mineral, para classificação com base na organização da cromatina (SN ou NSN). Use qualquer microscópio de fluorescência equipado com filtro Hoechst33342 (comprimento de onda de emissão 486 nm) para visualizar a configuração da cromatina dos oócitos. NOTA: Dependendo do tipo de microscópio de fluorescência usado, it pode tornar-se imperativa a utilização de vidro de fundo placa de Petri para aquisição de imagem. A microscopia confocal Olympus Fluoview FV10i quando equipado com um pegador de amostra para 35 milímetros prato requer apenas com fundo de vidro-pratos para aquisição de imagem, com uma espessura padrão de 0,17 milímetros e um intervalo de 0,13 a 0,21 milímetros aceitáveis. </li><li> Excitar os oócitos durante não mais do que 5-10 seg, provavelmente tempo suficiente para visualizar a presença ou a ausência de um anel em torno do nucléolo (Figura 5). </li><li> Após a separação, a cultura SN antral e oócitos NSN em M2 em 5% de CO 2 e 37 ° C, para induzir a maturação in vitro ou mantê-los em tampões apropriados para análises moleculares ou celulares. </li></ol>

<ol><li>Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antral+follicles%3A+oocyte+nucleus+and+the+karyosphere+formation+%28electron+microscopic+and+autoradiographic+data%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Res%22%5BJournal%5D)">Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data).</a> Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).</li>
<li>Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+recombinant+human+gonadotropins+on+human%2C+bovine+and+murine+oocyte+meiosis%2C+fertilization+and+embryonic+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro.</a> Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).</li>
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<li>Ami, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FT-IR+spectra+signatures+of+mouse+antral+oocytes%3A+molecular+markers+of+oocyte+maturation+and+developmental+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).</li>
<li>Fulton, B. P., Whittingam, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+mammalian+oocytes+by+intercellular+injection+of+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium.</a> Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).</li>
<li>Luttmer, S. J., Longo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+living+and+fixed+gametes+and+early+embryos+stained+with+supravital+fluorochromes+%28Hoechst+33342+and+3%2C3%E2%80%B2-dihexyloxacarbocyanine+iodide%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Res%22%5BJournal%5D)">Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide).</a> Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).</li>
<li>Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biopolitics+of+frozen+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The biopolitics of frozen embryos.</a> Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar

Este protocolo descreve o método usado para isolar e classificar rato antrais oócitos GV. Não há passos críticos particular, sublinhar, com poucas exceções. Primeiro: este procedimento deve ser realizado o mais rapidamente possível: a) manter a vitalidade dos oócitos e b) evitar mudanças de pH no meio utilizado. Segunda: oócitos deve ser animado brevemente (5-10 s) a Hoechst33342 para evitar danos da cromatina e a posterior morte dos oócitos, especialmente se IVM e FIV são os seguintes passos. Até à data, esta é a manei...

Antrais oócitos GV (totalmente crescidas, vesícula germinal) isolados a partir do compartimento do antro do ovário são rotineiramente usadas para diferentes fins, tais como, por exemplo, no estudo dos mecanismos moleculares e celulares subjacentes a maturação in vitro até estádio de metáfase II. Apesar de suas aparência bonita oócitos mais antrais, mas não todos, são capazes de completar a meiose e atingir o estágio de blastocisto; De facto, em muitas espécies de mamíferos, incluindo seres humanos 1,2, cerca de 30% deles deter o seu desenvolvimento na fase de 2 células, se ocorre a fertilização 3-5. Até à data, alguns parâmetros são usados ​​para distinguir entre oócitos capazes de sustentar o desenvolvimento embrionário de pessoas incapazes de fazê-lo. Por exemplo, coloração com azul de Cresyl (BCB) é um método válido para classificar os oócitos com base na actividade da glucose-6-fosfato-desidrogenase, embora a utilidade deste método de classificação relacionada com BC + ou coloração é BCB-Ainda laboratório dependentes 6-8. Outro método bem estabelecido reside na sua organização da cromatina: se coradas com quaisquer corantes intercalantes de ADN (como Hoechst33342), 70% dos oócitos antrais mostrar um anel de corante-positiva em torno do núcleo e são chamados rodeado nucléolo (SN), enquanto que os restantes 30% mostrar um mais manchado sinais positivos e são chamados Não Rodeado nucléolo (NSN) 3-5. Recentemente, mostrou que a ausência de reticulados citoplasmáticos 9 (CPLs, locais de armazenagem importantes para ARNm de origem materna e ribossomas em ambos os oócitos de mamíferos e embriões) 10 e a sub-regulação de MATER (essencial para a formação CPLs 11), juntamente com a presença de gotículas lipídicas em seus citoplasmas 9,12, pode haver outras causas relacionadas com a incapacidade NSN oócitos de proceder para além do estádio de 2 células. Infelizmente, algumas técnicas podem ser aplicadas para classificar SN antral e oócitos e NSN,Por esta razão, o desenvolvimento de um método menos invasivo (sem coloração nuclear, os processos de fixação ou manipulação com pipetas de boca) pode tornar-se muito importante para aumentar as taxas de desenvolvimento embrionário, tanto humana e animal. Neste artigo, detalhamos o protocolo simples e rápida usada para isolar anúncio SN tipo e NSN oócitos antrais de camundongos fêmeas e é dirigida a todos os cientistas interessados ​​no estudo da gametogênese do sexo feminino, a maturação eo desenvolvimento do embrião.

<table><tbody><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>G4527</td><td></td></tr><tr><td>EmbrioMax M2</td><td>Millipore</td><td>MR-015-PD</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Óleo Mineral</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Prato de Cultura de Células 35mmx10mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Prato 35mm, fundo de vidro alto</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur Borosilicato</td><td>Corning</td><td>7095D-9</td><td></td></tr><tr><td>Conjuntos de tubos aspiradores para pipetas micropilares calibradas</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e caracterização do mouse antral oócitos baseado em nucleolar organização da cromatina

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Este protocolo descreve um método simples e rápido para isolar e caracterizar oócitos GV (vesícula germinativa) antral de camundongo como capazes (SN, nucléolo cercado) ou incapazes (NSN, nucléolo não cercado) de se desenvolverem até o estágio de blastocisto após maturação in vitro (IVM) e fertilização in vitro (FIV). Faz uso de Hoeschst33342 (ou qualquer outro corante intercalante de DNA) capaz de se ligar à heterocromatina do nucléolo mostrando um anel nos oócitos SN ou não, como nos oócitos NSN. Isso representa a maneira mais fácil e rápida de classificar os oócitos antrais que podem ser eventualmente usados para procedimentos de IVM ou FIV. 
Resumidamente, o protocolo consiste nas seguintes etapas: injeção hormonal para estimular o crescimento folicular; isolamento dos oócitos no estágio GV do compartimento antral por punção do ovário com agulha estéril; preparo de pipetas finas de vidro para pipetagem bucal dos oócitos; triagem dos oócitos com Hoechst33342 preparado em concentração supravital; IVM, FIV ou qualquer outra análise molecular/celular.
Infelizmente ainda existem poucas evidências para classificar oócitos SN e NSN usando técnicas menos invasivas. Se e uma vez identificados, eles podem ser potencialmente aplicados às tecnologias de reprodução humana assistida, embora com vários aspectos que devem ser modificados. Até o momento, essa técnica tem implicações potenciais para aumentar drasticamente os procedimentos bem-sucedidos de IVM e fertilização in vitro em espécies ameaçadas e com interesse econômico.

As imagens seguintes mostram o método usado para isolar oócitos antrais a partir de ovários de rato, a partir de pipetas preparação para triagem dos ovócitos por meio de Hoechst33342. Este método é muito simples e pode ser realizado em qualquer laboratório equipado com uma incubadora de CO 2, um estereomicroscópio e um microscópio de fluorescência equipado com o filtro correcta para a observação do Hoechst33342 Figura 1 mostra a primeira etapa de preparação pi...

Aqui apresentamos um protocolo para a caracterização de oócitos antrais de rato com base na organização nucleolar.

Isolamento e Caracterização do mouse Antral Oócitos Baseado em Nucleolar organização da cromatina

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

O objetivo geral deste procedimento é detalhar todas as etapas necessárias para caracterizar óvulos antrais de camundongo com base na organização de sua cromatina, de acordo com sua capacidade de sustentar plenamente um desenvolvimento embrionário prospectivo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia do desenvolvimento, como distinguir e isolar dois tipos diferentes de óvulos antrais, SN (núcleo envolto pelo nucléolo) e NSN (núcleo não envolto pelo nucléolo), localizados no compartimento antral do ovário de mamíferos. Para coletar os ovários, comece por injetar, via intraperitoneal, 2,5 unidades internacionais de gonadotrofina sérica de égua prenhe em camundongas fêmeas com idade entre três e seis semanas.Dois dias depois, cerca de uma hora antes da colheita, preencha uma placa de Petri estéril com meio M2 e adicione várias gotas de 20 microlitros de meio M2 a uma segunda placa de Petri, cobrindo cada gota com 1,5 mililitro de óleo mineral. Em seguida, transfira todas as placas de Petri para uma incubadora a 37 graus Celsius, com 5% de dióxido de carbono, para permitir a equilibração do meio. A seguir, use uma tesoura de dissecação estéril para fazer uma incisão na pele que recobre a parede abdominal, seguida por uma incisão no peritônio do primeiro camundongo injetado com hormônio.Use pin&ccedil;as est&eacute;reis para afastar os intestinos e localizar as tubas uterinas, que formam um formato em V a partir da bexiga. Ap&oacute;s localizar os ov&aacute;rios abaixo dos rins, segure uma tuba uterina e libere o ov&aacute;rio correspondente com uma pequena incis&atilde;o na parte inferior do tecido. Repita o processo para colher o outro ov&aacute;rio e, em seguida, coloque ambos os ov&aacute;rios na placa de Petri contendo meio M2 previamente equilibrado.Antes de isolar o oócito antral, prepare pipetas de vidro para boca segurando ambas as extremidades de uma pipeta de Pasteur de vidro e mantendo a pipeta horizontalmente sobre a chama de um bico de Bunsen. Quando o vidro começar a derreter, remova a pipeta da chama e rapidamente puxe o instrumento para separá-lo. Usando uma unha, corte firmemente o excesso de vidro próximo ao ponto estreito da pipeta para encurtar a ponta e obter um diâmetro interno de capilar de cerca de 100 micrômetros.É importante utilizar um pipeta com o diâmetro adequado. Se for muito estreita, os ovócitos ficarão presos, sofrerão fragmentação e morrerão. Em seguida, conecte a extremidade não modificada da pipeta a um tubo de aspiração.Em seguida, transfira os ovários para a placa de Petri contendo um mililitro de meio M2 previamente equilibrado e use uma agulha de seringa de insulina estéril para perfurar suavemente os folículos antrais dos ovários. Conforme os ovócitos forem liberados, colete-os suavemente com uma pipeta de boca, tomando cuidado para não aspirar células foliculares ou outros detritos teciduais. Em seguida, pipete rapidamente cada ovócito através de múltiplas gotas de meio M2 previamente equilibrado para remover todas as células do cúmulos que estão aderidas à zona pelúcida dos ovócitos.Uma vez que os ovócitos tenham sido desprovidos de suas células foliculares, acomode cuidadosamente os ovócitos no fundo de gotas individuais de meio M2 fresco e equilibrado. Para corar os ovócitos, utilize uma pipeta bucal para transferir as células para gotas de 20 microlitros de Hoechst 33342 diluído em meio M2. Em seguida, transfira os ovócitos para uma nova placa de Petri contendo gotas de 5 microlitros de meio M2 cobertas com óleo mineral, tomando o cuidado de acomodar individualmente os ovócitos no fundo de cada gota.Após a transferência de todos os ovócitos, coloque a placa sob o microscópio de fluorescência e excite as células apenas pelo tempo necessário para visualizar a presença ou ausência de um anel ao redor do nucléolo. Tenha cuidado para não superexpor os ovócitos, pois a cromatina pode ser danificada e os ovócitos podem morrer se forem expostos por tempo excessivo. Após a identificação dos ovócitos SN e NSN, separe as células nas placas de Petri apropriadas contendo o reagente relevante para a análise subsequente desejada, de acordo com sua organização da cromatina.A coloração com Hoechst 33342 para organização da cromatina é provavelmente a etapa mais crítica do procedimento. Cinco a 10 segundos de excitação devem ser suficientes para classificar os ovócitos com base na presença ou ausência de cromatina ao redor do nucléolo de cada ovócito. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em menos de três horas se realizada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante trabalhar à temperatura ambiente e lembrar-se de manipular com cuidado tanto os ovários quanto os ovócitos. Após este procedimento, os ovócitos podem ser utilizados para maturação in vitro e fertilização in vitro. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de biologia do desenvolvimento pudessem responder a uma questão ainda em aberto: como reconhecer e distinguir entre dois tipos de ovócitos antrais presentes nos ovários de mamíferos.Após assistir a este vídeo, você terá uma boa compreensão de como fabricar e utilizar seu próprio pipetador bucal, bem como de como isolar e classificar ovócitos antrais por meio da coloração com Hoechst 33342. Não se esqueça de que trabalhar com animais e células exige precauções especiais, como o uso de equipamentos de proteção individual e a utilização de instrumentos esterilizados.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Ovócitos são propensas a aneuploidia devido a erros na segregação cromossômica durante a maturação meiótica. Aneuplóides ovos pode causar infertilidade, abortos espontâneos ou transtornos de desenvolvimento como a síndrome de Down. Aqui, descrevemos métodos para introduzir materiais de escolha em oócitos e métodos para estudar e avaliar a maturação meiótica ploidia.

Avaliação do mouse microinjeção de oócitos, maturação e ploidia

Este vídeo descreve o isolamento de oócitos antrais de ovários de camundongos recém-colhidos. Esses oócitos antrais podem ser usados para caracterização adicional e estudos de desenvolvimento.

Isolamento de oócitos antrais de camundongos: um método para isolar oócitos antrais de ovários de camundongos recém-colhidos

Aqui, apresentamos um protocolo para esgotamento específico mRNA mediado por siRNA seguido por análise de imunofluorescência para avaliar a formação do fuso meiótico e organização em oócitos de camundongos. Este protocolo é adequado para in vitro esgotamento das transcrições e avaliação funcional dos diferentes fuso e / ou fatores associados à MTOC em oócitos.

Meiotic Avaliação de fuso em oócitos mouse por silenciamento mediado por siRNA

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliação não invasiva de competência no desenvolvimento de oócito realizada durante sua em vitro maturação da vesícula germinal à fase de metáfase II. Este método combina imagens de lapso de tempo com análises de rede neural e Velocimetria por imagem (PIV).

Uma identificação baseado em Rede Neural de ovócitos já crescido mentalmente competente ou incompetente do Mouse

Oogénese nos mamíferos é conhecido por ser propenso a erro, especialmente devido à missegregation do cromossomo. Este manuscrito descreve métodos de preparação de cromatina espalhado para prófase rato, metáfase I e II-encenado oócitos. Estas técnicas fundamentais permitem o estudo de proteínas da cromatina-limite e a morfologia do cromossomo durante a ovogênese mamífera.

Preparações de espalhamento de cromatina para a análise da progressão de oócitos de camundongo da prófase para a metáfase II

Como as variantes genéticas associadas a doenças humanas começam a tornar-se descoberto, está se tornando cada vez mais importante desenvolver sistemas com os quais rapidamente avaliar o significado biológico dessas variantes identificadas. Este protocolo descreve métodos para avaliar a função do gene humano durante a meiose feminina eu usando oócitos de rato.

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Culturas de tecido ovarianos podem ser usadas como modelos de atresia de folículo, ovulação e desenvolvimento do folículo e indicar mecanismos reguladores de processos dinâmicos de ovário.

Cultura do tecido ovariano Visualizar fenômenos no ovário de Mouse

Apresenta-se um protocolo otimizado que permite a depleção de centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos em ovócitos de camundongos durante a metáfase I utilizando um laser de femtossegundos no infravermelho próximo.

Ablação a Laser Multifóton de Centros Organizadores de Microtúbulos Citoplasmáticos em Oócitos de Camundongos

Este protocolo fornece uma estrutura experimental para documentar o impacto físico do citoesqueleto na forma nuclear e nas organelas sem membrana interna no sistema oócito de camundongos. A estrutura pode ser adaptada para uso em outros tipos de células e contextos.

Capturando a agitação baseada no citoesqueleto do núcleo do ovócito de camundongo em escalas espaciais

Erros meióticos nas sinapses e recombinação são comuns aos oócitos de mamíferos. A análise rigorosa das proteínas envolvidas nesses processos é essencial para entender como e por que a oogênese geralmente dá errado. As técnicas apresentadas aqui permitem o monitoramento abrangente da recombinação e sinapses para avaliar a qualidade do oócito em camundongos.

Preparação de Spreads Cromossômicos Meióticos de Oócitos de Camundongos para Avaliação de Sinapse e Recombinação

Aprenda a caracterizar oócitos antrais de camundongo com base na organização da cromatina nucleolar. Este método distingue oócitos SN e NSN para estudos de biologia do desenvolvimento e reprodução.

Isolamento e Caracterização do mouse Antral Oócitos Baseado em Nucleolar organização da cromatina

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