Isolamento e Caracterização do mouse Antral Oócitos Baseado em Nucleolar organização da cromatina

O objetivo geral deste procedimento é detalhar todas as etapas necessárias para caracterizar oócitos antrais de camundongos com base em sua organização cromatina, de acordo com sua capacidade de sustentar totalmente um desenvolvimento embrionário prospectivo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia do desenvolvimento, como distinguir e isolar dois tipos diferentes de oócitos antrais, SN, nucléolo cercado, e NSN, nucléolo não cercado, residindo no compartimento antral do ovário de mamíferos. Para colher os ovários, comece injetando camundongos fêmeas de três a seis semanas de idade IP com 2,5 unidades internacionais de gonadotrofina sérica de égua grávida.

Dois dias depois, cerca de uma hora antes da colheita, encha uma placa de Petri estéril com meio M2 e adicione várias gotas de 20 micrilitros de meio M2 a uma segunda placa de Petri, cobrindo cada gota com 1,5 mililitros de óleo mineral. Em seguida, transfira todas as placas de Petri para uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir que o meio se equilibre. Em seguida, use uma tesoura de dissecção estéril para fazer uma incisão na pele que cobre a parede abdominal, seguida de uma incisão no peritônio do primeiro camundongo injetado com hormônio.

Use uma pinça estéril para mover os intestinos para o lado para localizar as trompas uterinas, que formam uma forma de V a partir da bexiga. Depois de localizar os ovários abaixo dos rins, segure uma tuba uterina e solte o ovário correspondente com uma pequena incisão na parte inferior do tecido. Repita o processo para colher o outro ovário e, em seguida, coloque os dois ovários na placa de Petri preenchida com meio M2 pré-equilibrado.

Antes de isolar o oócito antral, faça pipetas de boca de vidro segurando ambas as extremidades de uma pipeta de vidro Pasteur e segurando a pipeta horizontalmente sobre uma chama de bico de Bunsen. Quando o vidro começar a derreter, remova a pipeta da chama e separe rapidamente o instrumento. Usando uma unha, corte firmemente o excesso de vidro perto da ponta estreita da pipeta para encurtar a ponta e obter um diâmetro capilar interno de cerca de 100 mícrons.

É importante ter o diâmetro correto da pipeta. Se for muito estreito, os ooyctes ficarão presos, fragmentados e morrerão. Em seguida, conecte a extremidade não modificada da pipeta a um tubo aspirador.

Em seguida, transfira os ovários para a placa de Petri contendo um mililitro de meio M2 pré-equilibrado e use uma agulha de seringa de insulina estéril para perfurar suavemente os folículos antrais dos ovários. À medida que os oócitos são liberados, colete-os suavemente por pipeta oral, tomando cuidado para não aspirar células foliculares ou outros detritos teciduais. Em seguida, pipete rapidamente cada oócito através de várias gotas de meio M2 pré-equilibradas para remover todas as células do cumulus ligadas à zona pelúcida dos oócitos.

Uma vez que os oócitos tenham sido desnudados, coloque-os cuidadosamente no fundo de gotas individuais de meio M2 fresco e equilibrado. Para corar os ovócitos, use uma pipeta bucal para transferir as células para gotas de 20 microlitros de Hoechst 33342, diluídas em meio M2. Em seguida, transfira os oócitos para uma nova placa de Petri contendo cinco gotas de microlitro de meio M2 coberto com óleo mineral, tendo o cuidado de depositar os oócitos individualmente no fundo de cada gota.

Quando todos os oócitos tiverem sido transferidos, coloque o prato sob o microscópio fluorescente e excite as células apenas o tempo suficiente para visualizar a presença ou ausência de um anel ao redor do nucléolo. Tome cuidado para não expor demais os oócitos, pois a cromatina pode ser danificada e os oócitos podem morrer se forem expostos por muito tempo. Após a identificação dos ovócitos SN e NSN, classificar as células na placa de Petri correspondente apropriada no reagente relevante para a análise a jusante desejada, de acordo com sua organização da cromatina.

A coloração Hoechst 33342 para organização da cromatina é provavelmente a etapa mais crítica do procedimento. Cinco a 10 segundos de excitação devem ser longos o suficiente para classificar os oócitos com base na presença ou ausência de cromatina ao redor do nucléolo de cada oócito. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em menos de três horas se executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante trabalhar em temperatura ambiente e lembrar de tratar os ovários e os oócitos com cuidado. Após este procedimento, os oócitos podem então ser usados para maturação in vitro e fertilização in vitro. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia do desenvolvimento responderem a uma questão ainda em aberto, como reconhecer e distinguir entre dois tipos de oócitos antrais que residem nos ovários de mamíferos.

Depois de assistir a este vídeo, você terá um bom entendimento sobre como fazer e usar sua própria pipeta bucal, como isolar e classificar oócitos antrais por meio da coloração Hoechst 33342. Não se esqueça de que trabalhar com animais e células requer cuidados especiais, como usar seu equipamento de proteção individual e usar instrumentos esterilizados.