Name: Uma identificação baseado em Rede Neural de ovócitos já crescido mentalmente competente ou incompetente do Mouse (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Aprenda a identificar ovócitos competentes de camundongos usando imagem time-lapse e redes neurais. Este método não invasivo avalia o potencial de desenvolvimento gamético feminino em tempo real.

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Este trabalho tornou-se possível graças ao apoio por: Universidade de Pavia FRG 2016; Universidade de Parma FIL 2014, 2016; e Kinesis para fornecer o plasticware necessária para realizar este estudo. Agradecemos o Dr. Shane Windsor (Faculdade de engenharia, Universidade de Bristol, Reino Unido) para fornecer o software Cell_PIV.

Todos os procedimentos que envolvam animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso e comitês de ética na Universidade de Pavia. Os animais foram mantidos em condições de 22 ° C, umidade do ar de 60% e um ciclo claro/escuro de 12:12 h.
1. ovário isolamento
<ol><li>Injete intraperitonealmente 2-para-quatro as onze semanas CD1 ratos fêmeas com 10 U de hormônio folículo estimulante com uma seringa de insulina de 1ml estéril.</li>
	<li>Espere 46-48 h.</li>
	<li>Pesar o mouse e anestesiar com uma injeção intramuscular de 50 mg/kg de Zoletil (zolazepan Tiletamina e cloridrato). Eutanásia por deslocamento cervical.</li>
	<li>Segure a pele que cobre a parede abdominal, usando um par de pinças de dissecação. Cortar a pele e a parede do corpo com uma tesoura e abra a incisão com fórceps.</li>
	<li>Usando um par de pinças, mova a coragem à parte, identificar os cornos uterinos e localizar os ovários em sua extremidade.</li>
	<li>Delicadamente segurar o ovário usando pinça de relojoeiro e use tesouras para cortar seu ligamento para o útero. Repita com o outro ovário.</li>
	<li>Transferi os ovários coletados em um prato de Petri de cultura 35mm célula contendo 1 mL de meio de isolamento M2 pré aquecido a 37 ° C, 5% de CO2 no ar.</li>
	<li>Remova a gordura e o oviduto usando tesouras bem sob um estereomicroscópio.</li>
</ol>2. isolamento de Cumulus oócito complexos
<ol><li>Perfure a superfície ovariana, usando uma pinça estéril e uma agulha de insulina estéril de 1G até complexos de antral cumulus oócito (COCs) são liberados passivamente.</li>
	<li>Coletar COCs com mais de três camadas de células do cumulus usando uma boca-controlada mão-puxado Pasteur micropipeta (200 µm de diâmetro) e transferi-los para uma gota de 300 µ l de meio fresco M2.</li>
	<li>Remover as células do cumulus envolvendo oócitos usando uma micropipeta de Pasteur puxados à mão (80 µm de diâmetro) pipetando suavemente dentro e para fora por alguns segundos,</li>
	<li>Repetidamente transferi oócitos de uma gota de 20 µ l de meio M2 para a outra, até que as células do cumulus são completamente eliminadas.</li>
</ol>3. classificação de ovócito baseada na organização da cromatina
<ol><li>Prepare a solução de coloração de Hoechst 33342 em uma concentração final de 0,05 µ g/mL em M2 médio a partir de uma solução mãe de 5 mg/mL, diluído em PBS 1x.</li>
	<li>Coloca 3,5 gotículas de micro µ l de Hoechst solução no fundo de uma tampa de caixa de Petri de 35 mm de coloração.</li>
	<li>Transferir cada único oócito para uma coloração gota a Hoechst, coloque o prato em uma placa de aquecimento previamente aquecido (37 ° C) e cubra com uma tampa escura para evitar a exposição de luz.</li>
	<li>Após 10 minutos de incubação à temperatura ambiente, observe os oócitos com um microscópio de fluorescência na ampliação de 10x sob luz UV (330-385 nm), para não mais do que 1-2 s.</li>
	<li>Classifica oócitos como um nucléolo rodeado (SN) (figura 1A), se eles apresentam um anel da cromatina Hoechst-positivo em torno do nucléolo.</li>
	<li>Classifica oócitos como um nucléolo não cercado (NSN), se o nucléolo não é rodeado por cromatina Hoechst-positivo e mostra dispersar heterocromático pontos dentro do núcleo (figura 1B).</li>
</ol>4. neural Network-Based oócito classificação
<ol><li>Prepare quatro 2 gotas µ l de meio de α-MEM suplementado com 5% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino, 2 mM L-glutamina, taurina de 5 mM, 100 U/mL penicilina, 75 µ g/mL Estreptomicina e piruvato 23,5 µ g / µ l de sódio em um vidro de 35 mm inferior a placa de Petri e cubra-os com pré-aquecido (37 ° C) e pre-equilibrado óleo mineral para evitar a evaporação média. Nota: Se utilizar um sistema de célula-seleção ao vivo, manter as gotas a uma distância específica, usando uma grade desenhada de 7 x 7 mm como uma diretriz.</li>
	<li>Oócitos de transferência 3 - 4 para cada gota.</li>
	<li>Colocar o fundo de vidro, placa de Petri em um sistema de célula-seleção ao vivo, equipado com software de gravação de lapso de tempo (veja a Tabela de materiais), que permite a observação de maturação do ovócito em um ambiente com temperatura estável (37 ° C) e CO2 concentração (5%).</li>
	<li>Abra o software de gravação de lapso de tempo. Na tela aparece uma janela com uma imagem ao oócito no lado esquerdo e todos os botões de ajuste no lado direito.</li>
	<li>Selecione o centro do oócito para posicioná-la no centro da tela. Se necessário, ajuste o foco.</li>
	<li>Selecione o botão de Ph e definir o Diâmetro da lâmpada para 192; o tempo de exposição de de 1/125 s; o ganho de 1,99; e a resolução de 1600 x1200.</li>
	<li>Selecione FL2 e defina o Diâmetro da lâmpada para 5; o tempo de exposição para 3 s; o ganho de 2,37; e a resolução de 1600 x1200.</li>
	<li>Selecione o botão New aponte para gravar a posição do oócito dentro da gota de cultura. Repita a mesma rotina para cada oócito dentro da gota de cultura.</li>
	<li>Selecione o tempo e definir o ciclo de aquisição de 8 min e o tempo Total de 15 h.</li>
	<li>Selecione iniciar o lapso de tempo para iniciar o ciclo de gravação.</li>
	<li>Abra o software MATLAB e escrever >>cell_piv; e, em seguida, selecione a Ferramenta PIV.</li>
	<li>Escolha a pasta que contém o filme gravado e selecione qualquer um dos arquivos. jpeg para carregar a sequência de toda a imagem. Para cada oócito, selecione a região de interesse (ROI) clicando o Selecione a ferramenta de área.</li>
	<li>Selecione o Processo PIV no menu arquivo. Selecione o botão de Ferramenta de visualizador . Nota: O programa irá calcular os vetores de velocidade dentro o ROI e produz automaticamente um arquivo de dados, salvo como um arquivo de Mat.</li>
	<li>Selecione o arquivo de Mat para abrir. Selecione o botão selecionar ROI tool e desenhe um círculo ao redor do contorno do oócito. No menu arquivo, clique em salvar. Nota: Os vetores nesta região são exibidos e os dados de amplitude média na janela do gráfico atualizado para este novo ROI.</li>
	<li>Aberto os dados coletados de magnitude média dos quadros todo lapso de tempo registrado em uma planilha, com as linhas, a sequência de quadros e, nas colunas, cada único oócito analisado.</li>
	<li>Organize os dados de ovócitos tanto NSN e SN em 10 subgrupos.</li>
	<li>Use 9 subgrupos para treinar a rede neural artificial de feed-forward iterativamente (FANN) e 1 subgrupo para teste cego.<ol>
<li>Repita outra 9 vezes, mudando a amostra de teste cega (10 vezes a validação cruzada).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Abrir o MATLAB, execute o script feito por principal e, quando solicitado, insira o nome do arquivo com os dados de treinamento (train.txt), o número de oócitos NSN e SN usado para treinamento e o intervalo de lapso de tempo para ser analisado (normalmente, a partir de quadro # 1-2 para enquadrar # 112-113).</li>
	<li>Pressione enter para realizar o treinamento.</li>
	<li>Insira o nome do arquivo com os dados de teste (Test. txt).</li>
	<li>Abra o vetor test_outputs_cyt no espaço de trabalho do MATLAB. Nota: Uma janela aparece na tela mostrando, na primeira linha, a probabilidade de obter verdadeiros positivos (TP ou verdadeiro NSN) e falsos positivos (FP ou False NSN) para oócitos NSN e SN, respectivamente; em vez disso, na segunda linha, a probabilidade de obter falsos negativos (FN ou False SN) e verdadeiro negativos (TN ou SN True) para oócitos NSN e SN, respectivamente.</li>
	<li>Use a fórmula: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), para calcular a precisão FANN, expressada em percentagem.</li>
</ol>

<ol><li>Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+methods+for+selection+of+the+ideal+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Molecular methods for selection of the ideal oocyte.</a> Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).</li>
<li>Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+value+of+oocyte+morphology+in+human+IVF%3A+a+systematic+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Human.+Reprod.+Update%22%5BJournal%5D)">Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature.</a> Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).</li>
<li>Tan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+configurations+in+the+germinal+vesicle+of+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes.</a> Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).</li>
<li>Vigone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+based+identification+of+mouse+cumulus+cell+markers+that+predict+the+developmental+competence+of+their+enclosed+antral+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes.</a> BMC Genomics. 14, 380(2013).</li>
<li>Bui, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+movement+profiles+of+mouse+surrounding+nucleolus+and+not-surrounding+nucleolus+antral+oocytes+during+meiotic+resumption%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption.</a> Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).</li>
<li>Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+organization+during+mouse+oocyte+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Chromatin organization during mouse oocyte growth.</a> Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).</li>
<li>Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+organisation+and+nuclear+architecture+in+growing+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).</li>
<li>Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+it+take+to+make+a+developmentally+competent+mammalian+egg%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod.+Update%22%5BJournal%5D)">What does it take to make a developmentally competent mammalian egg?</a> Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).</li>
<li>Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+the+oocyte+nucleus+and+cytoplasm+to+the+determination+of+meiotic+and+developmental+competence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice.</a> Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).</li>
<li>Ajduk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+actomyosin-driven+contractions+induced+by+sperm+entry+predict+mammalian+embryo+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability.</a> Nat. Commun. 2, 417(2011).</li>
<li>Swann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C-%CE%B6-induced+Ca2%2B+oscillations+cause+coincident+cytoplasmic+movements+in+human+oocytes+that+failed+to+fertilize+after+intracytoplasmic+sperm+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection.</a> Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).</li>
<li>Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feed+forward+artificial+neural+network%3A+tool+for+early+detection+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer.</a> Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).</li>
<li>Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+Training+Efficiency+and+Computational+Costs+of+a+Feed+Forward+Neural+Network%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Comput.+Intell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review.</a> Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243(2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Existem várias etapas críticas um deve cuidar da durante a execução do presente protocolo com oócitos de rato, bem como com os de outras espécies. Uma vez isolados de seus folículos, oócitos devem ser imediatamente transferidos para as gotas de gravação, como a separação do cumulus companheiro células disparadores o início da transição GV-para-MII. Uma eventual modificação do presente protocolo pode ser a adição de 3-isobutil-1-methylxanthine (IBMX) para o meio de M2 utilizado para isolamento de COCs. IBMX impede o desen...

Infertilidade feminina é uma patologia que afecta um número crescente de mulheres. De acordo com a Organização Mundial de saúde, cerca de 20% dos casais são inférteis, com um 40% devido à infertilidade feminina. Além disso, um terço das mulheres passando por tratamentos contra o cancro (300.000 por ano e 30.000/ano nos EUA e Itália, respectivamente) desenvolver falência ovariana prematura.
Uma estratégia para impedir a infertilidade em pacientes com câncer é o isolamento e criopreservação de folículos nos ovários antes do tratamento oncológico, seguido em vitro maturação (IVM) de ovócitos GV à fase MII (transição de GV-para-MII). A disponibilidade de marcadores não-invasivo de competência no desenvolvimento de oócito melhoraria a fertilização e processos de desenvolvimento e o global gravidez sucesso1,2.
Com base na sua configuração de cromatina observada após coloração com o fluorocromo supravital Hoechst 33342, oócitos já crescidos mamíferos classificam-se como um nucléolo rodeado (SN) ou um não cercado nucléolo (NSN)3. Além de sua organização da cromatina diferentes, estes dois tipos de oócitos exibir muitas diferenças morfológicas e funcionais3,4,5,6,7,8 ,9, incluindo sua competência meiótica e do desenvolvimento. Quando isolado do ovário e amadurecido em vitro, ambos tipo de oócitos alcance o estágio MII e após a inseminação de espermatozoides, desenvolvem-se para a fase 2-célula, mas apenas aqueles com uma organização da cromatina SN podem desenvolver a termo9. Embora bom como um método de classificação para selecionar competente vs incompetente oócitos, a principal desvantagem é o efeito mutagénico que o fluorocromo em si e, acima de tudo, a luz UV usado para sua detecção podem ter sobre as células.
Por todas estas razões, nós procuramos por outros marcadores não invasivos associados a conformação da cromatina SN ou NSN que poderia substituir o uso de Hoechst, mantendo a mesma precisão de alta classificação. A observação do tempo-lapso de velocidades de movimento citoplasmático (CMVs) está emergindo como uma característica distintiva do status do celular. Por exemplo, estudos recentes demonstraram que a associação entre CMVs gravado no momento da fertilização e da capacidade de zigotos humanos e rato pré-implantacional completa e desenvolvimento termo10,11.
Baseado nestes estudos anteriores, descrevemos aqui uma plataforma para o reconhecimento de rato mentalmente competente ou incompetente oócitos já crescido5,6,7,8. A plataforma é baseada em três etapas principais: 1) oócitos isolados de folículos antrais primeiro são classificados com base na sua configuração de cromatina ou como um nucléolo rodeado (SN) ou um nucléolo não-cercado (NSN); 2) Time-Lapse imagens de CMVs ocorrendo durante a transição de GV-para-MII de cada único oócito são tomadas e analisadas com Velocimetria por imagem (PIV); e 3) os dados obtidos com PIV são analisados com um Feed-forward Artificial Neural Network (FANN) para classificação cego12,13. Nós dar detalhes das etapas mais críticas do processo projetado para o mouse para torná-lo pronto para ser testado e usado para outras espécies de mamíferos (por exemplo, bovinos, macacos e humanos).

<table><tbody><tr><td>Folligon</td><td>Intervet</td><td>A201A02</td><td>Tratamento hormonal</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>Para coloração de heterocromatina de oócitos</td></tr><tr><td>Cultura de células Placa de Petri 35 mm x 10 mm&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430165</td><td>Para isolamento de COCs</td></tr><tr><td>EmbryoMax M2 Medium (1X), Líquido, com vermelho de fenol</td><td>Merck-Millipore</td><td>MR-015-D</td><td>Para isolamento de COCs</td></tr><tr><td>MEM Alpha medium (1X) + Glutamax&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526</td><td>Para maturação in vitro de oócitos</td></tr><tr><td>Cultura de células Placa de Petri 35 mm com fundo de vidro&nbsp;</td><td>WillCo&nbsp;</td><td>GWSt-3522</td><td>Para experimentos de imagem</td></tr><tr><td>BioStation IM-LM&nbsp;</td><td>Sistema</td><td>de triagem de células ao vivo</td> <td>Nikon MFA91001</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur</td><td>Delchimica Scientific Glassware</td><td>6709230</td><td>Para manipulação de folículos</td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>Para prevenir contaminação e evaporação do meio</td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td>Para prevenir contaminação do meio&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>ML16141079</td><td>para compor &alfa; Meio MEM&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamina&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td>Para maquiagem &alpha; Meio MEM&nbsp;</td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td>Para compor &alpha; Meio MEM&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A3310</td><td>para compor &alpha; Meio MEM</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; P4562</td><td>Para maquiagem &alfa; Mídia MEM</td></tr><tr><td>Zoletil (cloridrato de Tiletamina e Zolazepan)</td><td>Virbac Srl QN01AX9</td><td></td><td>Para anestesia Cell_PIV software de camundongos</td></tr><tr><td></td><td>Gentilmente cedido pelo Dr. Shane Windsor, Universidade de Bristol, Reino Unido</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;-</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;-</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>O MathWorks, Natick, MA&nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; -</td><td>Para computação numérica multiparadigma</td></tr></tbody></table>

uma identificação baseado em rede neural de ovócitos já crescido mentalmente competente ou incompetente do mouse

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Clínicas de infertilidade beneficiaria a habilidade de selecionar mentalmente competente vs incompetente oócitos usando procedimentos invasivos, melhorando assim o resultado global da gravidez. Recentemente desenvolvemos um método de classificação baseado em observações ao vivo microscópicas de ovócitos de rato durante sua em vitro maturação da vesícula germinal (GV) à fase metáfase II, seguido da análise dos movimentos citoplasmáticos ocorrem durante este período de lapso de tempo. Aqui, apresentamos protocolos detalhados deste procedimento. Oócitos são isolados de folículos antrais já crescidos e cultivados para 15 h no interior de um microscópio equipado para a análise de lapso de tempo a 37 ° C e 5% de CO2. Fotos são tiradas em intervalos de 8 min. As imagens são analisadas usando o método Particle Image Velocimetry (PIV) que calcula, para cada oócito, o perfil de velocidades de movimento citoplasmático (CMVs) ocorrendo durante todo o período de cultura. Finalmente, os CMVs de cada único oócito são alimentados através de uma ferramenta de classificação matemática (Feed-forward de Rede Neural Artificial, FANN), que prevê a probabilidade de um gameta ser mentalmente competente ou incompetente com uma precisão de 91.03%. Este protocolo, configurar para o mouse, agora poderia ser testado em oócitos de outras espécies, incluindo seres humanos.

A Figura 2 mostra um representante oócito mentalmente competente e incompetente, respectivamente no início (GV) e no final do procedimento de IVM (MII). IVM de ovócitos de rato já crescido ocorre durante a cultura de 15 h. A observação de lapso de tempo grava a progressão da meiose e detecta grandes eventos meióticos, incluindo a GVBD e a extrusão do primeiro corpo polar.
Análise e comparação de mai...

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliação não invasiva de competência no desenvolvimento de oócito realizada durante sua em vitro maturação da vesícula germinal à fase de metáfase II. Este método combina imagens de lapso de tempo com análises de rede neural e Velocimetria por imagem (PIV).

Uma identificação baseado em Rede Neural de ovócitos já crescido mentalmente competente ou incompetente do Mouse

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

O objetivo geral deste procedimento é a identificação de occytes com capacidade de desenvolvimento de parte traseira usando uma ferramenta não invasiva. A principal vantagem deste método é que, simplesmente observando os movimentos dos oócitos que ocorrem durante a maturação in vitro, pode-se avaliar o potencial de desenvolvimento dos gametas femininos. Esta técnica é baseada em imagens de lapso de tempo acopladas à velocimetria de imagem de partículas, uma análise baseada em rede neural.Aqui, descreveremos as etapas tomadas para demonstrar que os oócitos de camundongos durante a transição do estágio vesical germinativo para o estágio metafásico dois, exibem um perfil diferente dos referidos movimentos plasmáticos significativamente correlacionados à sua competência ou incompetência de desenvolvimento. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, a infertilidade é uma patologia que afeta cerca de 20% dos casais e, além disso, um terço das mulheres em tratamento contra o câncer correm o risco de insuficiência ovariana prematura. Isso corresponde a cerca de 300.000 ou 30.000 mulheres em países como EUA ou Itália, respectivamente.O desenho de procedimentos não invasivos para a identi

a-neural-network-based-identification-developmentally-competent-or

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Ovócitos são propensas a aneuploidia devido a erros na segregação cromossômica durante a maturação meiótica. Aneuplóides ovos pode causar infertilidade, abortos espontâneos ou transtornos de desenvolvimento como a síndrome de Down. Aqui, descrevemos métodos para introduzir materiais de escolha em oócitos e métodos para estudar e avaliar a maturação meiótica ploidia.

Avaliação do mouse microinjeção de oócitos, maturação e ploidia

Aqui apresentamos um protocolo para a caracterização de oócitos antrais de rato com base na organização nucleolar.

Isolamento e Caracterização do mouse Antral Oócitos Baseado em Nucleolar organização da cromatina

Como as variantes genéticas associadas a doenças humanas começam a tornar-se descoberto, está se tornando cada vez mais importante desenvolver sistemas com os quais rapidamente avaliar o significado biológico dessas variantes identificadas. Este protocolo descreve métodos para avaliar a função do gene humano durante a meiose feminina eu usando oócitos de rato.

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Culturas de tecido ovarianos podem ser usadas como modelos de atresia de folículo, ovulação e desenvolvimento do folículo e indicar mecanismos reguladores de processos dinâmicos de ovário.

Cultura do tecido ovariano Visualizar fenômenos no ovário de Mouse

Aqui, descrevemos, comparamos e contrastamos duas técnicas diferentes para a contagem precisa de folículos de tecidos ovarianos fixos do rato.

Enumeração de folículo preciso em ovários de rato adulto

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para imagens de ovários inteiros para análises quantitativas e qualitativas utilizando imunosscopia de montagem integral, microscopia multifotínica e visualização e análise 3D. Este protocolo acomoda um processamento de alto rendimento, confiável e repetível que é aplicável para toxicologia, diagnóstico clínico e ensaios genômicos da função ovariana.

Imunofluorescência total do ovário, compensação e microscopia multifotínica para análise quantitativa 3D da reserva ovariana em desenvolvimento em mouse

O erro na segregação cromossômica é uma característica comum nos ovócitos. Portanto, estudar o ponto de verificação de montagem do fuso dá pistas importantes sobre os mecanismos necessários para produzir ovos saudáveis. O presente protocolo descreve três ensaios complementares para avaliar a integridade do ponto de verificação da montagem do fuso em ovócitos de rato.

Avaliação da Integridade do Ponto de Verificação da Montagem do Fuso em Oócitos de Rato

Erros meióticos nas sinapses e recombinação são comuns aos oócitos de mamíferos. A análise rigorosa das proteínas envolvidas nesses processos é essencial para entender como e por que a oogênese geralmente dá errado. As técnicas apresentadas aqui permitem o monitoramento abrangente da recombinação e sinapses para avaliar a qualidade do oócito em camundongos.

Preparação de Spreads Cromossômicos Meióticos de Oócitos de Camundongos para Avaliação de Sinapse e Recombinação

Este protocolo descreve procedimentos para maturação in vitro de oócitos de camundongo, fertilização in vitro e subsequente cultura embrionária até o estágio de blastocisto.

Maturação in vitro, fertilização e cultura de embriões pré-implantacionais em ovocitos de camundongos

Este protocolo descreve em detalhes o método para gerar progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias usando um método de monocamada sem soro. Esses progenitores podem ser usados para derivar tipos de células neurais maduras ou para estudar o processo de especificação neural e são passíveis de escalonamento de formato multipoço para triagem de compostos.

Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada

Aprenda a identificar ovócitos competentes de camundongos usando imagem time-lapse e redes neurais. Este método não invasivo avalia o potencial de desenvolvimento gamético feminino em tempo real.

Uma identificação baseado em Rede Neural de ovócitos já crescido mentalmente competente ou incompetente do Mouse

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