Uma identificação baseado em Rede Neural de ovócitos já crescido mentalmente competente ou incompetente do Mouse

O objetivo geral deste procedimento é a identificação de occytes com capacidade de desenvolvimento de parte traseira usando uma ferramenta não invasiva. A principal vantagem deste método é que, simplesmente observando os movimentos dos oócitos que ocorrem durante a maturação in vitro, pode-se avaliar o potencial de desenvolvimento dos gametas femininos. Esta técnica é baseada em imagens de lapso de tempo acopladas à velocimetria de imagem de partículas, uma análise baseada em rede neural.

Aqui, descreveremos as etapas tomadas para demonstrar que os oócitos de camundongos durante a transição do estágio vesical germinativo para o estágio metafásico dois, exibem um perfil diferente dos referidos movimentos plasmáticos significativamente correlacionados à sua competência ou incompetência de desenvolvimento. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, a infertilidade é uma patologia que afeta cerca de 20% dos casais e, além disso, um terço das mulheres em tratamento contra o câncer correm o risco de insuficiência ovariana prematura. Isso corresponde a cerca de 300.000 ou 30.000 mulheres em países como EUA ou Itália, respectivamente.

O desenho de procedimentos não invasivos para a identificação da competência de desenvolvimento do oócito ajudaria a melhorar o sucesso geral dos resultados da gravidez. Aqui, damos detalhes das etapas mais críticas do procedimento desenvolvido para o camundongo, a fim de torná-lo prontamente disponível para ser testado e usado para outras espécies de mamíferos, como bovinos ou humanos. Os ovários são transferidos em uma placa de Petrie contendo meio M2 pré-aquecido e equilibrado e 37 graus centígrados e cinco por cento de CO2.

Se o oviduto e alguma gordura ainda estiverem presentes ao redor do ovário, eles devem ser removidos. Em seguida, segurando o ovário com uma pinça, sua superfície é perfurada com uma agulha 1G estéril. Os ovários perfurados são removidos do meio M2 e, usando uma micropipeta puxada à mão, cox nosso primeiro movimento para um novo meio M2 limpo e, em seguida, pipetado para dentro e para fora por alguns segundos até que as células do cumulus ao redor do oócito sejam completamente removidas.

Em seguida, os oócitos são transferidos em gotas de 20 microlitros de meio M2 e, se algumas células do cumulus persistirem, elas são completamente removidas por várias passagens de gota a gota até que as células do cumulus sejam completamente eliminadas. Para preparar o Hoechst 33342 a uma concentração final de 0,05 microgramas por mil, começamos com uma solução suave de Hoechst na concentração de cinco miligramas por mil, preparada em pbs de uma só vez e esta é diluída ainda mais até que a concentração necessária seja obtida. Microgotas de 3,5 microlitros de solução de Hoechst são colocadas no fundo de uma tampa de placa de Petrie e cada oócito diluído é então transferido em uma única gota de Hoechst, tendo o cuidado de reduzir a exposição à luz durante o processo de coloração de Hoechst, cobrindo o prato com uma tampa escura.

Após dez minutos de coloração, os oócitos são observados em microscópio fluorescente com luz ultravioleta. Com base na conformação da cromatina, eles são classificados como Nucléolo Cercado, SN, se apresentarem um anel de cromatina x-positiva ao redor do nucléolo ou como Nucléolo Não-Cercado, NSN, se o nucléolo não tiver um anel de cromatina x-positiva e a cromatina geral aparecer dispersa no nucléolo. Quatro gotas de dois microlitros de meio alfa mem são colocadas em uma placa de Petrie com fundo de vidro, tendo o cuidado de manter as gotas dentro de uma distância específica, as gotas são revestidas com óleo mineral pré-aquecido e equlibrado e um total de três a quatro oócitos são transferidos para cada gota.

A placa de Petrie é transferida para a câmara de incubação de um microscópio de lapso de tempo, o que permite a manutenção prolongada da temperatura da cilatura a 37 graus centígrados e cinco por cento de CO2 e iluminação com luz LED vermelha. Antes da análise de lapso de tempo, usando o software BioStation, as coordenadas de cada gota são definidas para automatizar a passagem de uma gota para a próxima durante a rotina de lapso de tempo. Os quadros de lapso de tempo são tirados em intervalos de oito minutos para um total de 15 horas.

Os filmes gravados são então analisados usando o software CellPave, que permite a detecção de movimentos citoplasmáticos expressos em termos de vetores de velocidade. Primeiro, com a ferramenta CellPave, o perímetro de cada oócito é delimitado manualmente. Em seguida, o software calcula a velocidade do movimento citoplasmático que ocorre na comparação entre dois quadros consecutivos de lapso de tempo e a expressa colocando uma seta colorida cuja intensidade e comprimento da cor definem a velocidade e a direção dos movimentos.

O histograma abaixo do oócito visto aqui descreve a velocidade geral do movimento citoplasmático durante o período de registro de 15 horas de um oócito SN. O mesmo tipo de análise é feito em um oócito NSN. Observe o pico de extrusão do corpo polar atrasado mostrado pelo oócito NSN em comparação com o oócito SN.

A parte inferior da tela mostra o padrão temporal da velocidade do movimento citoplasmático do oócito. A velocidade é calculada comparando dois quadros consecutivos. Os dados brutos da velocidade de movimento citoplasmático são então exportados para uma planilha do Excel relatando, nas linhas, a sequência de Frens e, nas colunas, o único oócito analisado.

No lado esquerdo, os dados de um oócito SN, enquanto no lado direito, os de oócitos NSN. Os dados dos oócitos SN ou NSN são então divididos em 10 subgrupos. Nove são usados para treinamento, cor verde.

E um para o teste cego, cor vermelha. Este procedimento é repetido por um total de 10 vezes. Cada vez que muda a amostra de teste cego.

Os dados são então examinados por meio de uma rede neural artificial feed-forward, ou FANN. O FANN é construído para analisar todos os quadros de lapso de tempo, aqui chamados de Neurônios de Entrada"Estes últimos estão conectados a três neurônios ocultos, eles próprios ligados a dois neurônios de saída. Uma saída dá a probabilidade de que a entrada seja um oócito competente.

O outro, ao contrário, que a entrada é um oócito incompetente. A comparação entre os dois resultados prevê a competência mental do óvulo com uma precisão de 91,03 por cento. A técnica foi configurada para oócitos de camundongos, conforme mostrado aqui.

No entanto, o recall futuro é testá-lo em oócitos humanos. De fato, que os procedimentos não invasivos da análise da qualidade do oócito são particularmente necessários no campo das tecnologias de reprodução artificial.