As diferenças sexuais no mouse do hipocampo astrócitos após In-Vitro Isquemia

O objetivo geral desta técnica é preparar culturas enriquecidas de astrócitos hipocampais específicos para o sexo de camundongos recém-nascidos como uma ferramenta para estudar os papéis específicos do sexo dos astrócitos após a privação e reoxigenação de oxigênio e glicose, a fim de imitar a isquemia hipóxica in vivo em um ambiente de cultura de células. Este método pode ajudar a responder a questões-chave mecanicistas e translacionais relativas ao papel específico do sexo dos astrócitos do hipocampo após isquemia hipóxica no desenvolvimento de cérebros masculinos e femininos. Disseque o cérebro da cabeça de um filhote de camundongo recém-nascido usando uma pequena tesoura para criar uma incisão posterior à linha média anterior através da pele para expor o crânio.

Corte a linha média do crânio cuidadosamente do pescoço ao nariz. Use uma pinça de ponta plana estéril para descascar o crânio. Remova o tronco cerebral com a ajuda de uma pinça curva e coloque o cérebro restante em uma placa de dissecação.

Usando uma pinça curva, vire o cérebro para que a superfície ventral fique voltada para cima e, em seguida, separe os hemisférios com uma lâmina cirúrgica afiada e estéril. Com uma pinça curva plana, descasque os hemisférios cerebrais e remova cuidadosamente o mesencéfalo protuberante e o tecido talâmico para revelar o hipocampo, uma pequena estrutura em forma de cavalo-marinho no lobo temporal medial. Remova os lobos do hipocampo e limpe cuidadosamente as meninges e fibroblastos da superfície dos lobos, puxando com uma pinça fina.

Transfira os dois lobos do hipocampo de um único camundongo para um segundo prato cheio de aproximadamente 5 mililitros de HBSS e coloque no gelo. Pique os lóbulos aproximadamente 4 vezes usando uma lâmina cirúrgica estéril afiada. Use uma pipeta estéril de 1 mililitro para transferir o HBSS e o tecido para um tubo cônico estéril de 50 mililitros e, em seguida, centrifugue a 300 vezes G por 5 minutos.

Após centrifugação, aspirar o sobrenadante. Adicione 3 mililitros de tripsina a 0,25%, misture e incube o tecido a 37 graus Celsius por 20 minutos com agitação suave. Após a incubação, centrifugue o tubo a 300 vezes G por 5 minutos.

Após a centrifugação, use uma pipeta de vidro estéril para aspirar cuidadosamente o sobrenadante e, em seguida, adicione 10 mililitros de meio de revestimento de astrócitos pré-aquecido. Triturar 20 a 30 vezes usando uma pipeta de vidro polido a fogo. Após mais 5 minutos de centrifugação a 300 vezes G, aspirar o sobrenadante e adicionar 2 mililitros de meios de plaqueamento de astrócitos.

Passe a suspensão celular através do filtro de malha de 70 mícrons para um novo tubo cônico de 50 mililitros. Adicione toda a suspensão celular a um frasco de cultura T-25 estéril revestido contendo 3 mililitros de meio de plaqueamento de astrócitos. Incubar o frasco a 37 graus Celsius em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono.

No dia seguinte, observe a progressão da confluência astrocítica sob um microscópio óptico, aspire o meio e substitua por 2 mililitros de meios de plaqueamento de astrócitos frescos. Por volta de 11 dias in vitro, colher os astrócitos confluentes aspirando o meio e adicionando 2 mililitros de tripsina a 0,25%. Girar suavemente o balão algumas vezes e, em seguida, aspirar a tripsina com uma pipeta de vidro estéril.

Adicione mais 2 mililitros de 0,25% de tripsina e deixe o frasco descansar em temperatura ambiente por 4-5 minutos. Após remover a tripsina, coloque o frasco a 37 graus Celsius em uma incubadora de 5% de CO2 por 10 minutos. Após a incubação, adicione 5 mililitros de meio de revestimento de astrócitos e separe a camada astrocítica batendo no frasco 3 a 4 vezes.

Triturar suavemente a suspensão celular no fundo do frasco para obter o descolamento completo e, em seguida, recolher os astrócitos num tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar o tubo a 300 vezes G durante 5 minutos. Aspirar o sobrenadante e, em seguida, adicionar 1 mililitro de meio de plaqueamento de astrócitos fresco.

Adicione 10 microlitros da suspensão celular a um hemocitômetro e use um microscópio de contraste de fase invertida com uma objetiva de 10x para contar as células na grande área central da grade. Dilua as células para aproximadamente 1 vez 10 a 5 células por 2 mililitros de meio de plaqueamento de astrócitos. Pipete 2 mililitros da suspensão celular em uma lamínula de vidro revestida de poli-d lisina no poço de uma placa de cultura de 24 poços.

Incube a 37 graus Celsius em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono. Para iniciar a privação de oxigênio e glicose, aspire o meio da lamínula contendo astrócitos aderentes e enxágue uma vez com 1 mililitro de solução isotônica de OGD. Adicione 0,2 mililitros de solução OGD ao poço e coloque em uma incubadora hipóxica.

Misture suavemente com um agitador orbital ajustado para 50 rpm durante os primeiros 30 minutos de hipóxia. Para reoxigenação, substitua a solução OGD por 2 mililitros de meio de plaqueamento de astrócitos e incube em 5% de dióxido de carbono e ar atmosférico a 37 graus Celsius por 5 horas. Esta imagem de imunofluorescência mostra a pureza da cultura primária de astrócitos do hipocampo de camundongos.

A cultura de astrócitos foi imunomarcada para mostrar o marcador dendrítico neuronal, MAP2, em vermelho, e o marcador da microglia, IBA1, em verde. Os núcleos são corados com DAPI que aparece em azul. A seta indica contaminação por microglia.

Esta imagem imunofluorescente representativa de astrócitos de hipocampo cultivados sob condições normóxicas, mostra imunorreatividade GFAP em vermelho e marcação HIF1-alfa em verde. Novamente, os núcleos são corados com DAPI, que aparece em azul. A seta indica baixa expressão de HIF1-alfa.

Após 2 horas de privação de oxigênio e glicose e 5 horas de reoxigenação, a expressão de HIF1-alfa foi aumentada em astrócitos de hipocampo cultivados, conforme indicado pela ponta da seta, indicando expressão nuclear elevada de HIF1-alfa. A expressão de GFAP e a expressão de S100b foram reguladas positivamente em culturas de astrócitos do hipocampo de camundongos machos após privação de oxigênio e glicose e rexoygenação. A regulação positiva de S100b e GFAP também foi observada em astrócitos obtidos de camundongos fêmeas.

Após este procedimento, outros métodos como PCR quantitativo, western blotting, siRNA e colorações imuno-histoquímicas podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como alterações específicas do sexo em certas expressões gênicas e proteicas após isquemia in vitro. Após seu desenvolvimento, essa técnica pode abrir caminho para pesquisadores no campo da neurociência explorarem os efeitos e consequências do derrame no hipocampo que estudam os astrócitos em cultura.