As diferenças sexuais no mouse do hipocampo astrócitos após
25 de outubro de 2016
Os astrócitos são um dos principais intervenientes mais importantes no sistema nervoso central (SNC). Aqui, nós estamos relatando um método prático de protocolo de cultura de astrócitos do hipocampo sexuado, a fim de estudar os mecanismos subjacentes a função de astrócitos em filhotes recém-nascidos do sexo masculino e feminino após isquemia in-vitro.
O objetivo geral desta técnica é preparar culturas enriquecidas de astrócitos do hipocampo específicas para cada sexo a partir de camundongos recém-nascidos, como uma ferramenta para estudar os papéis específicos aos sexos dos astrócitos após privação de oxigênio e glicose e subsequente reoxigenação, com o intuito de simular in vitro a hipóxia-isquemia em um ambiente de cultura celular. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave mecanicistas e translacionais relativas ao papel específico aos sexos dos astrócitos do hipocampo após hipóxia-isquemia em cérebros em desenvolvimento de machos e fêmeas. Disseque o cérebro da cabeça de um filhote de camundongo recém-nascido utilizando pequenas tesouras para fazer uma incisão mediana de posterior para anterior através da pele, expondo assim o crânio.
Corte cuidadosamente a linha média do crânio do pescoço até o nariz. Use pinça estéril de ponta plana para remover o crânio. Remova o tronco encefálico com a ajuda de pinça curva e coloque o cérebro restante em uma bacia de dissecação.
Usando pinças curvas, vire o cérebro de modo que a superfície ventral fique voltada para cima e, em seguida, separe os hemisférios com uma lâmina cirúrgica estéril e afiada. Com pinças curvas planas, afaste os hemisférios cerebrais e remova cuidadosamente o tecido do mesencéfalo e do tálemo, que estão salientes, para expor o hipocampo, uma pequena estrutura com formato semelhante ao de um cavalo-marinho localizada no lobo temporal medial. Remova ambos os lobos hipocampais e limpe cuidadosamente as meninges e os fibroblastos da superfície dos lobos puxando com pinças finas.
Transfira ambos os lobos hipocampais de um único camundongo para um segundo recipiente contendo aproximadamente 5 mililitros de HBSS e coloque sobre gelo. Pique os lobos aproximadamente 4 vezes usando uma lâmina cirúrgica estéril e afiada. Use uma pipeta estéril de 1 mililitro para transferir o HBSS e o tecido para um tubo cônico estéril de 50 mililitros e, em seguida, centrifugue a 300 vezes G durante 5 minutos.
Após a centrifugação, aspire o sobrenadante. Adicione 3 mililitros de tripsina a 0,25 por cento, misture e incube o tecido a 37 graus Celsius por 20 minutos com agitação suave. Após a incubação, centrifugue o tubo a 300 vezes G por 5 minutos.
Após a centrifugação, use uma pipeta de vidro estéril para aspirar cuidadosamente o sobrenatante e, em seguida, adicione 10 mililitros de meio de placa pré-aquecido para astrócitos. Pipete de 20 a 30 vezes usando uma pipeta de vidro flamejada. Após nova centrifugação de 5 minutos a 300 ×g, aspire o sobrenatante e adicione 2 mililitros de meio de placa para astrócitos.
Passe a suspensão celular através de um filtro de malha de 70 micrômetros para um novo tubo cônico de 50 mililitros. Adicione toda a suspensão celular a um frasco de cultura estéril T-25 revestido contendo 3 mililitros de meio de plating para astrócitos. Incube o frasco a 37 graus Celsius em uma estufa com 5% de dióxido de carbono.
No dia seguinte, observe a progressão da confluência astrocitária ao microscópio óptico, aspire o meio e substitua por 2 mililitros de meio fresco para placa de astrócitos. Por volta do 11º dia in vitro, colete os astrócitos confluentes aspirando o meio e, em seguida, adicionando 2 mililitros de tripsina a 0,25%. Gire suavemente o frasco algumas vezes e, então, aspire a tripsina utilizando uma pipeta de vidro estéril.
Adicione mais 2 mililitros de tripsina 0,25% e deixe o frasco em repouso à temperatura ambiente por 4 a 5 minutos. Após a remoção da tripsina, coloque o frasco a 37 graus Celsius em uma estufa com 5% de CO₂ por 10 minutos. Após a incubação, adicione 5 mililitros de meio de placa para astrócitos e desprenda a camada astrocitária batendo no frasco de 3 a 4 vezes.
Triture suavemente a suspensão celular no fundo do frasco para obter uma dessacoplamento completo e, em seguida, colete os astrócitos em um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue o tubo a 300 ×g por 5 minutos. Aspire o sobrenadante e, em seguida, adicione 1 mililitro de meio fresco para placa de astrócitos.
Adicione 10 microlitros da suspensão celular a um hemocitômetro e utilize um microscópio invertido com contraste de fase e objetiva de 10x para contar as células na área central gradeada grande. Dilua as células até aproximadamente 1 × 10⁵ células por 2 mililitros de meio de plating de astrócitos. Pipete 2 mililitros da suspensão celular sobre uma lamínula de vidro revestida com poli-d-lisina no poço de uma placa de cultura de 24 poços.
Incubar a 37 graus Celsius em uma estufa com 5% de dióxido de carbono. Para iniciar a privação de oxigênio e glicose, aspire o meio do lamínula contendo astrócitos aderentes e lave uma vez com 1 mililitro de solução isotônica de OGD. Adicione 0,2 mililitros de solução de OGD ao poço e coloque em uma estufa hipóxica.
Misture suavemente com um agitador orbital ajustado a 50 rpm durante os primeiros 30 minutos de hipóxia. Para a reoxigenação, substitua a solução de OGD por 2 mililitros de meio de placa para astrócitos e incube em 5% de dióxido de carbono e ar atmosférico a 37 graus Celsius por 5 horas. Esta imagem de imunofluorescência mostra a pureza do cultivo primário de astrócitos hipocampais de camundongo.
O cultivo de astrócitos foi imunomarcado para mostrar o marcador de dendrito neuronal, MAP2, em vermelho, e o marcador de micróglias, IBA1, em verde. Os núcleos são corados com DAPI, que aparece em azul. A seta indica contaminação por micróglias.
Esta imagem imunofluorescente representativa de astrócitos hipocampais cultivados em condições normóxicas mostra a imunorreatividade de GFAP em vermelho e a marcação de HIF1-alfa em verde. Novamente, os núcleos foram corados com DAPI, que aparece em azul. A seta indica baixa expressão de HIF1-alfa.
Após 2 horas de privação de oxigênio e glicose e 5 horas de reoxigenação, a expressão de HIF1-alpha aumentou em astrócitos hipocampais cultivados, conforme indicado pela seta que aponta para a expressão nuclear elevada de HIF1-alpha. A expressão de GFAP e de S100b foi regulada para cima em culturas de astrócitos hipocampais de camundongos machos após privação de oxigênio e glicose e reoxigenação. A regulação positiva de S100b e GFAP também foi observada em astrócitos obtidos de camundongos fêmeas.
Após este procedimento, outros métodos como PCR quantitativa, western blot, siRNA e colorações imunohistoquímicas podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como alterações específicas ao sexo em determinadas expressões gênicas e proteicas após isquemia in vitro. Após seu desenvolvimento, esta técnica pode abrir caminho para pesquisadores na área de neurociência explorarem os efeitos e consequências do acidente vascular cerebral no hipocampo, estudando os astrócitos em cultura.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para o isolamento e cultivo de astrócitos do hipocampo específicos para o sexo a partir de camundongos neonatos, a fim de estudar suas respostas à privação de oxigênio e glicose (OGD) e à reoxigenação, modelando in vitro a lesão cerebral hipóxico-isquêmica (HI). O método permite investigar as diferenças dependentes do sexo na reatividade dos astrócitos, o que é relevante para compreender a base celular da lesão cerebral hipóxico-isquêmica neonatal e sua maior gravidade nos machos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Lesão Cerebral Neonatal
Antecedentes
- A astrogliose após lesão cerebral relacionada à isquemia-hipóxia contribui para a morbidade e mortalidade em neonatos.
- Estudos clínicos mostram que neonatos do sexo masculino são mais suscetíveis a desfechos neurológicos graves decorrentes de lesão isquêmico-hipóxica do que os do sexo feminino.
- Compreender as diferenças sexuais no nível celular exige métodos confiáveis para o isolamento de populações de astrócitos segregadas por sexo.
- A reatividade dos astrócitos é comumente avaliada por marcadores como GFAP e S100B.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para o preparo de culturas enriquecidas de astrócitos do hipocampo específicas para o sexo a partir de camundongos recém-nascidos.
- Modelar in vitro a isquemia utilizando privação de oxigênio e glicose (OGD) e reoxigenação nessas culturas.
- Examinar as respostas específicas ao sexo dos astrócitos frente a lesões semelhantes à hipóxia-isquemia (HI).
Métodos Utilizados
- Dissecação de hipocampos de cérebros de camundongos neonatos, separados por sexo.
- Dissociação enzimática e trituração mecânica para obter suspensões de células isoladas.
- Cultivo de astrócitos em lamínulas revestidas com poli-D-lisina e manutenção em meio de plating para astrócitos.
- Indução de OGD seguida por reoxigenação para simular lesão por HI.
- Imunomarcação para marcadores de astrócitos (GFAP, S100B), neuronais (MAP2) e microgliais (IBA1), e expressão de HIF1-alfa.
Resultados Principais
- Culturas altamente enriquecidas de astrócitos do hipocampo específicas para o sexo foram estabelecidas com sucesso.
- A imunomarcação confirmou a pureza dos astrócitos e identificou leve contaminação por micróglias.
- A desoxigenação e glicose e a reoxigenação aumentaram a expressão nuclear de HIF1-alpha em astrócitos.
- As culturas de astrócitos de ambos os sexos mostraram regulação positiva de GFAP e S100B após desoxigenação/reoxigenação, com diferenças específicas ao sexo observadas.
Conclusões
- Este protocolo permite o estudo das respostas astrocitárias específicas ao sexo frente a lesões semelhantes à hipóxia-isquemia in vitro.
- Oferece uma ferramenta valiosa para investigar os mecanismos celulares subjacentes às diferenças sexuais na lesão cerebral neonatal.
- O método possibilita análises moleculares adicionais, como qPCR e western blotting, para explorar alterações na expressão gênica e proteica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento e a caracterização confiáveis de astrócitos do hipocampo específicos ao sexo após isquemia in vitro preenchem uma lacuna crítica na compreensão dos mecanismos dependentes do sexo subjacentes à lesão cerebral hipóxico-isquêmica neonatal. Essa capacidade permite a redução de riscos mecanicistas e confiança preditiva em programas de descoberta precoce direcionados à neuroproteção mediada por astrócitos. O método sustenta a continuidade translacional ao fornecer uma plataforma para avaliação quantitativa das diferenças sexuais nas respostas celulares ao insulto isquêmico.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da reatividade astrocitária dependente do sexo frente a lesão isquêmica no nível celular.
- Apoia a desmistificação mecanicista ao esclarecer as contribuições dos astrócitos para neuropatologias específicas ao sexo.
- Facilita a validação funcional de alvos para intervenções moduladoras de astrócitos na lesão cerebral neonatal.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece culturas validadas de astrócitos específicas por sexo para ensaios moleculares e farmacológicos posteriores.
- Permite a quantificação reprodutível de marcadores de astrócitos (GFAP, S100B) após lesão, para padronização de ensaios.
- Permite a triagem de compostos candidatos para avaliar efeitos diferenciais sobre as respostas de astrócitos masculinos versus femininos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha achados in vitro com observações clínicas da gravidade da lesão cerebral neonatal dependente do sexo.
- Permite o avanço ajustado ao risco de estratégias neuroprotetoras com perfis de eficácia específicos ao sexo.
- Apoia a descoberta de biomarcadores para estudos translacionais em modelos pré-clínicos de lesão hipóxico-isquêmica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir testes de hipóteses, validação de alvos e avaliação quantitativa das respostas astrocitárias específicas ao sexo frente a lesão isquêmica.
- Biologia da Descoberta: Apoia estudos mecanicistas de vias de lesão mediadas por astrócitos e diferenças sexuais.
- Triagem: Fornece uma plataforma para leituras reproduzíveis e quantitativas de marcadores de ativação de astrócitos.
- Análises: Permite a medição da expressão de GFAP, S100B e HIF1-alfa para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Facilita a correlação de achados in vitro com resultados clínicos dependentes do sexo.
- Reutilização Empresarial: Oferece um fluxo de trabalho reutilizável para diversas investigações moleculares e farmacológicas em neurobiologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa de neuroproteção sexo-específica.
- Valor Operacional: Padroniza o isolamento de astrócitos e a modelagem de lesões para garantir reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir ou não com estratégias neuroprotetoras direcionadas por sexo e a priorização de portfólios.
- Impacto no Portfólio: Permite o avanço ajustado ao risco de ativos que abordam desfechos neurológicos dependentes do sexo.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação de cérebro neonatal e técnicas de cultivo celular primário.
- Exige acesso a instrumentação especializada para modelagem de hipóxia e imunomarcação.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de isolamento celular, indução de lesão e quantificação de marcadores.
- Pode ser necessária adaptação para outras regiões cerebrais ou estágios de desenvolvimento.
- As limitações potenciais incluem contaminação leve por micróglias e variabilidade no rendimento de astrócitos.
