Name: As diferenças sexuais no mouse do hipocampo astrócitos após In-Vitro Isquemia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar astrócitos hipocampais sexo-específicos de camundongos neonatos para estudar respostas à privação de oxigênio e glicose. Este método permite investigar diferenças sexuais na lesão cerebral hipóxico-isquêmica neonatal.

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Programa de Prêmio de Ciências Clínicas e Translacionais do NCATS UL1 TR0000427 e KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 para o UW ICTR do NIH / NCATS e fundos do Waisman Center (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 do NINDS (Cengiz P) e NIH P30 HD03352 (Waisman Center), NIH / NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). Gostaríamos de agradecer a Albee Messing, PhD, por nos fornecer os camundongos nocaute GFAP.

NOTA: Este estudo foi realizado de acordo com a recomendação do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde. O protocolo animal foi aprovado pela Universidade de Wisconsin-Madison, Institutional Animal Care e do Comitê Use. Protocolo de Cultura Astrocyte primário que é apresentado aqui é adotada a partir dos protocolos apresentados por Zhang Y 19 et al. E Cengiz P 20 et al., Com algumas modificações. 1. hipocampo Dissecção e Cultura Astrocyte <ol><li> Prepare todos os reagentes e materiais necessários, incluindo tesouras cirúrgicas, fórceps finos lisos, uma pinça ponta plana, toalhas de papel, saco de lixo, 70% de etanol e 2 pratos de dissecação (3,5 cm de diâmetro) no gelo cheias de 2 Solução Salina Equilibrada de mL Hank (HBSS) cada . Certifique-se do equipamento cirúrgico são estéreis (autoclave) antes do procedimento e utilizar todos os outros materiais (Astrocyte chapeamento meio: soro DMEM + 5% + cavalo1% de penicilina-estreptomicina, soro de cavalo, de HBSS, 0,25% de tripsina, lamelas de vidro, placas de Petri, 15/50 mL tubos, frascos T25, etc.) como pré-esterilizado. </li><li> Pressione cuidadosamente e pulverizar a cabeça e pescoço do cachorro rato com 70% de etanol e decapitar usando uma tesoura esterilizada afiadas [Figura 1 (1)]. </li><li> Realizar uma incisão mediana de posterior para anterior crânio com uma tesoura pequena ao longo do couro cabeludo para expor o cérebro [Figura 1 (2-3)]. </li><li> Cortar o crânio com cuidado desde o pescoço até o nariz com uma tesoura pequena. Em seguida, corte crânio anterior para os bulbos olfatórios e inferior ao cerebelo para desconectar o crânio da base do crânio. </li><li> Fazer uma pequena incisão na base do crânio e cortar ao longo da linha média. Use uma pinça de ponta chata estéreis para descascar o crânio. Remover o tronco cerebral com a ajuda de uma pinça curvos. Remover o cérebro do crânio e colocar para o primeiro prato de dissecação [Figura 1 (4-9)] 21. </li><li> Usando uma pinça curva, virar o cérebro de modo que a superfície ventral do cérebro é voltado para cima e, em seguida, separar os dois hemisférios com uma lâmina cirúrgica estéril afiada [Figura 1 (10,11)] </li><li> Retire os hemisférios cerebrais e remova cuidadosamente o tecido mesencéfalo e tálamo abaulamento com um estéreis pinças curvas planas para revelar o hipocampo, uma estrutura pequena, cavalo marinho em forma no lobo temporal medial [Figura 1 (12-14)]. </li><li> Remova ambos os lóbulos do hipocampo [Figura 1 (15,16)] e dissecar cuidadosamente as meninges de lobos puxando com a pinça fina. Este passo evita a contaminação da cultura final do astrócito por células meníngeas e fibroblastos. </li><li> Transferir os lóbulos do hipocampo preparados para o segundo prato cheio com HBSS e devolvê-lo em gelo [Figura 1 (17,18)]. Piscina ambos hipocampo lóbulos de um único rato (P0 - P2) para preparação de hipopótamoculturas Campal astrócitos. Isto dá a densidade apropriada dos astrócitos. Picar lobos do hipocampo, utilizando uma lâmina cirúrgica estéril afiada (aproximadamente 4 vezes). </li><li> Aspirar HBSS de prato usando uma ponta estéril ligada a uma pipeta de 1 mL e adicionar 3 ml de 0,25% de tripsina, misturar e transferir para um tubo cónico de 15 ml estéril e a incubação do tecido a 37 ° C durante 20 min com agitação suave. </li><li> tubo de centrifugação a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante cuidadosamente, utilizando uma pipeta de vidro estéril ligada a uma linha de vácuo. Adicionar 10 ml de astrócitos chapeamento médio e triturado (20 - 30 vezes) usando um fogo polido pipeta de vidro até pedaços de tecido homogeneizar. </li><li> tubo de centrifugação a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e adicionar 2 mL de meio de astrócitos chapeamento pré-aquecido fresco. Passar as células através de um filtro de malha de 70 um (filtro de células) para um novo tubo cónico de 50 mL. </li><li> suspensão de células em placa inteira num frasco de cultura T25 estéril poli-D-lisina / laminina, contendo 3 mL revestido demeios de astrócitos plaqueamento, depois incubar o balão a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. </li><li> Toda Aspirar mídia na dia- i n-vitro (DIV) 1, DIV 3 e DIV 7, e substituir com 2 mL de meio de astrócitos chapeamento frescos. Observe a progressão e confluência astrocitária sob microscópio de luz cada vez que ao substituir a mídia astrócitos chapeamento. NOTA: A DIV 1, todos os astrócitos viáveis ​​são ligadas à superfície do frasco de cultura e as células mortas ou a morrer que incluem neurónios estão a flutuar no sobrenadante. No DIV 3, as células ligadas começar a dividir para formar a camada de células de astrócitos. Na ausência de condições favoráveis, a cultura é quase desprovida de qualquer crescimento neuronal. No DIV 7, astrócitos camada é de cerca de 80 - 90% confluentes e alguns microglia, bem como células precursoras de oligodendrócitos estão presentes no topo da camada de astrócitos. </li><li> Aspirar o meio chapeamento do frasco, adicionar 2 mL de meio de astrócitos chapeamento pré-aquecido fresco, lavar and remover novamente no DIV 11, quando os astrócitos são confluentes e pronto para a sub cultura. </li><li> Adicionar 2 mL de tripsina a 0,25%, rode suavemente o frasco algumas vezes e aspirado de tripsina usando uma pipeta de vidro esterilizado. </li><li> Adicionar 2 mL de tripsina a 0,25% e deixar que o balão se sentar na capa de cultura de tecidos para 4-5 min a RT. </li><li> Remover a tripsina e manter o balão a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5% durante 10 min. Adicionar 5 mL pré-aquecido astrócitos chapeamento médio e retirar a camada de astrócitos tocando o frasco contra a palma da sua mão (3 - 4 vezes) seguido por trituração suave para conseguir separação completa e recolher os astrócitos em um tubo cônico de 15 mL. </li><li> tubo de centrifugação a 300 xg durante 5 min, aspirar o sobrenadante e adicionar 1 mL de meio fresco astrócitos chapeamento. </li><li> Adicionam-se 10 uL da suspensão de células para um hemocitómetro e contar as células na grande superfície reticulada central (1 mm2), utilizando um microscópio de contraste de fase invertida (objectiva 10X). Multiply por 10 4 para estimar o número de células por mL. Um balão T25 produzirá ~ 1 x 10 6 células totais dissociado. Semente ~ 1 x 10 5 células em 2 ml de astrócitos do plaqueamento em meio de um diâmetro de Poli-D-Lisina lamela de vidro pré-revestidas com 12 mm de o poço de uma placa de cultura de 24 poços. </li><li> Incubar a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. Execute OGD / Reox na DIV 12-14 (seção 2). </li><li> Tratar as culturas de astrócitos na DIV 3 com cloridrato de 5 mM L-leucina éster metílico (LME) até DIV 11 se culturas de hipocampo desprovidas de microglia são desejados. Após LME incubação, as culturas sujeitas a agitação (300 rpm durante 1 h) para remover contaminantes microglia. NOTA: LME é um agente citotóxico da microglia que tem sido amplamente utilizado como um método para eliminar a proliferação microglia 22. </li></ol> 2. OGD / Reox Tratamento <ol><li> media aspirado de lamela contendo cultura de astrócitos aderente (DIV 12-14) e lavar 3 vezespor rotação suave a 24 poços de cultura prato que prende a lamela algumas vezes com 1 mL de solução isotónica OGD (pH 7,4) contendo (em mM): 0 de glucose, 21 de NaHCO3, 120 NaCl, 5.36 KCl, 0,33 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 1,27 de CaCl2, e 0,81 MgSO 4. </li><li> Adicionar 0,2 mL de solução a OGD bem para cobrir a lamela e incubar durante 2 h numa incubadora hipóxico contendo 94% de N 2, 1% de O2, e 5% de CO 2. Misturar suavemente com um agitador orbital (50 rpm) durante os primeiros 30 minutos de hipoxia para facilitar o intercâmbio de gás. </li><li> Incubar as células de controlo normóxicas durante 2 h em 5% de CO 2 e o ar atmosférico em um tampão idêntica à solução OGD, excepto a adição de 5,5 mM de glucose. </li><li> Para Reox, aspirado solução OGD e adicionar 2 mL de astrócitos chapeamento médio. Incubar em 5% de CO 2 e o ar atmosférico, a 37 ° C durante 5 h. </li></ol> 3. imunocitoquímica Coloração &lt;/ P&gt; <ol><li> Aspirar o meio de cultura usando uma pipeta de vidro estéril ligada a uma linha de vácuo e rapidamente enxaguar lamela uma vez por adição de 1 mL de 0,1 M de Tris salino tamponado (TBS) (NaCl 154 mM, 16 mM, de Trizma base, Tris-HCl a 84, pH 7,4) para o poço. Aspirar e juntar 2 ml de paraformaldeído a 4% (PFA) em 1x tampão fosfato salino (PBS). Incubar durante 15 minutos à TA. </li><li> Aspirar e adicionar 1 mL de 0,1 M TBS, em seguida, coloque em um agitador de balanço por 2 min. Repita 3 vezes. Adicionar 1 ml de solução (soro de cabra a 10%, 10 mg / mL de BSA, 0,025% de Triton X-100 a 0,1 M em TBS) de bloqueio e incubar durante 30 min a 37 ° C num agitador de balanço. </li><li> Aspirar solução de bloqueio e adicionar anticorpo-GFAP monoclonal anti-primário do rato (0,2 mL de uma diluição de 1: 500 em solução de bloqueio) e soro policlonal de coelho anti-S100B (1: 500) ou anticorpo policlonal de coelho anti-HIF1α (1: 200) durante 60 min a 37 ° C num agitador de balanço. </li><li> Alternativamente, alguns astrócitos são incubadas com anticorpo policlonal de coelho anti-IBA1 (1: 200) e seg ratooclonal anti-MAP2 para acessar a pureza da cultura. </li><li> Aspirar anticorpo primário e enxaguar lamela pela adição de 1 mL de 0,1 M TBS e colocação num agitador de balanço por 2 min e depois aspirar. Repita duas vezes. </li><li> Adicionar 0,2 ml de uma diluição 1: 200 dos anticorpos anti-coelho conjugados 568-488-conjugados e anti-ratinho de cabra secundário em solução de bloqueio durante 60 minutos a 37 ° C num agitador de balanço. </li><li> Aspirar anticorpo secundário e enxaguar lamela pela adição de 1 mL de 0,1 M TBS e coloque num agitador de balanço por 2 min e depois aspirar. Repita duas vezes. </li><li> Remover lamela de bem e seco, colocando em um slide posicionado sobre uma lâmina de cabelo. Mount lamela em um novo slide, invertendo em uma única gota de Vectashield hardset meio de montagem com DAPI (1,5 ng / mL). </li><li> lamelas de imagem em um microscópio confocal usando 20X objetivo óleo seco ou 60X. Aquisição de imagens (512 x 512) para DAPI (405 nm ex / 450 nm em) e fluorocromo 488 etiquetado anticorpo GFAP (488 nm ex / 515 nmem). Manter parâmetros de aquisição constantes dentro do 20X e 60X grupos. </li></ol> 4. A determinação do sexo Usando PCR <ol><li> Calor pup dedo do pé ou dedo para recortes de 95 ° C durante 45 min em NaOH 50 mM e neutraliza-se com igual volume de Tris 1 M, pH 6,8. </li><li> Adicionar 1 mL da solução de ADN extraído a 19 uL da mistura seguinte: 5 pmol de iniciadores para os genes Myog e Sry, 1x tampão de reacção, 0,2 mM de cada desoxinucleótido e 8 U de Taq polimerase. </li><li> Use sequências de primers; Sry 5&#39;TCATGAGACTGCCAACCACAG3 &#39;, 5&#39;CATGACCACCACCACCACCAA3&#39; e Myog 5&#39;TTACGTCCATCGTGGACAGC3 &#39;, 5&#39;TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3&#39; 23. </li><li> Executar o seguinte protocolo de PCR: 95 ° C durante 3 min, depois 30 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 15 s, emparelhamento a 58 ° C durante 15 s, e alongamento a 72 ° C durante 1 min. Seguindo esta 30 ciclos, a reacção termina com um final de 72 ° C alongamento durante 1 min. </li><li> PC separadoProdutos R electroforeticamente num gel de brometo de etidio contendo 2% de agarose e visualização sob luz UV. (Figura 2A). CUIDADO! O brometo de etídio é um potencial cancerígeno e deve ser manuseado com cuidado e descartados de forma apropriada de acordo com os regulamentos da instituição. </li></ol>

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<li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).</li>
<li>Saura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cells+in+astroglial+cultures%3A+a+cautionary+note%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note.</a> J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).</li>
</ol>

Nenhum dos autores têm interesses concorrentes ou conflitantes.

Para estudar as diferenças entre os sexos nas propriedades e função de astrócitos em condições fisiológicas e patológicas, preparação de astrócitos primários sexado em cultura celular é uma ferramenta importante para utilizar. No presente estudo relatamos um altamente eficiente e um método reprodutível à cultura uma população homogénea altamente enriquecido de astrócitos do hipocampo sexado de recém-nascidos (P0-P2) C57BL / 6 (tipo selvagem) ou K19F (GFAP null) filhotes de rato in vitro. Estabelecer esta metodo...

Os astrócitos são um dos principais intervenientes mais importantes no sistema nervoso central (SNC). Crescente corpo de evidências indica que os papéis de astrócitos são mais do que apoio neuronal. Na verdade, o papel dos astrócitos em condições fisiológicas pode ser muito complexo, tais como guiar a migração de axónios em desenvolvimento 1, regulando SNC fluxo de sangue 2, a manutenção da homeostase do sináptica fluido intersticial 3 pH, e participam na barreira hemato-encefálica 4 e 5 da transmissão sináptica. Em condições patológicas, astrócitos responder a uma lesão com um processo chamado astrogliose reactivo em que a morfologia, número, localização, topografia (em relação à distância do insulto) e a função dos astrocitos podem mudar de uma forma heterogénea 6,7. Astrogliosis visto seguinte encefalopatia hipóxico-isquémica neonatal talvez contribuindo para a morbidade e mortalidade de recém-nascidos <saté&gt; 8. estudos clínicos e experimentais recentes indicam que a gravidade da lesão cerebral parece ser dependente do sexo e que os machos recém-nascidos são mais susceptíveis aos efeitos de hipoxia / isquemia (HI) lesão cerebral -relacionados, resultando nos resultados neurológicos mais graves, em comparação com mulheres com lesões cerebrais comparáveis 9-11. Embora a localização da lesão depende da idade gestacional e a duração e a gravidade da lesão, hipocampo é uma das regiões mais vulgarmente efectuada no SNC após HI neonatal prazo, e aumentou astrogliose hipocampo foi confirmada por super-regulação de a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) 3 d após a HI neonatal 7,10,12,13. Diferenças sexuais em função de astrócitos foram mostrados em ambos os recém-nascidos e roedores adultos após isquemia cerebral 14,15. Além disso, a susceptibilidade de astrócitos do sexo masculino de isquemia in vitro foi demonstrado por um aumento da CELl morte em comparação com astrócitos corticais do sexo feminino na cultura 16. Diferenças sexuais começar no útero e continuam até a morte 17. Durante a última década, a importância de incluir os sexos em condições experimentais em cultura celular e in vivo estudos têm sido a ênfase do Instituto de Medicina e NIH para buscar conhecimentos fundamentais nas diferenças de sexo visto em condições fisiológicas e patológicas 17,18 . Desenvolvimento de métodos confiáveis ​​para isolar e manter populações de astrócitos do hipocampo sexuado é essencial para compreender a base celular das diferenças sexuais nas consequências patológicas de HI neonatal. O presente estudo foi desenhado para proporcionar as técnicas para preparar culturas de astrócitos do hipocampo específicas do sexo enriquecidos de ratos recém-nascidos, a fim de avaliar os papéis de astrócitos GFAP-imunoreativos seguintes Oxygen / Glucose Privação (OGD) e reoxigenação (Reox), induzindoHl em meio de cultura de células. Esta técnica pode ser usado para testar qualquer hipótese referente a astrócitos do hipocampo em machos e fêmeas neonatais sob condições de normóxia e isquémicas.

<table><tbody><tr><td>Meio de cultura de astrócitos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM, célula de alta glicose</td><td></td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Concentração</td> Final <td>Gibco</td><td>26050-070</td>: <td>10%</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>30-002-CI</td><td>Concentração Final: 1%</td></tr> <tr><td>de Cloridrato de L-Leucina Éster</td><td>Metílico Aldrich</td><td>L1002-25G</td><td>Concentração Final: 5 mM</td></tr><tr><td>Solução para digestão de tecidos cerebrais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>cellgro</td><td>25-050-CI</td><td>Concentração Final: 0,25% </td></tr><tr><td>Outro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% (vol/vol) etanol</td><td>Roth</td><td>9065.2</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lisina (PDL) 12 mm lamínulas redondas&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354087</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td>Grau de cultura de células</td></tr><tr><td>PBS</td><td>cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>Grau de cultura de células</td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Filtro de células estéreis&nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri de 3,5 cm</td><td>BD Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo Falcon</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo Falcon</td> BD <td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps, fino;</td><td>Dumont</td><td>2-1032; 2-1033</td><td># 3c; # 5</td></tr><tr><td>Fórceps, ponta plana</td><td>KLS Martin</td><td>12-120-11</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica de 13 cm</td> Microscópio Confocal <td>Aesculap</td><td>BC-140-R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>A1RSi&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5805000.017</td><td>5804R</td></tr><tr><td>Agitador Orbital</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE 4450-1CE</td><td>MaxQ 4450&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-IBA1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>Coelho monoclonal</td></tr><tr><td>Anti-MAP2</td><td>Sigma</td><td>M2320</td><td>Camundongo monoclonal</td></tr><tr><td>Anti-HIF1alfa</td><td>abcam</td><td>ab179483</td><td>Coelho monoclonal</td></tr><tr><td>Anti-S100B</td><td>Sigma</td><td>HPA015768</td><td>Coelho policlonal</td></tr><tr><td>Anti-GFAP (coquetel)</td><td>Biolegend</td><td>837602</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC Kit (Coelho IgG)</td><td>Vector Labs</td><td>PK-6101</td><td>Contém 4 Reagentes&nbsp;</td></tr><tr><td>Cabra Anti Coelho Alexa-Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11070</td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anti Mouse Alexa-Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11004</td><td></td></tr></tbody></table>

as diferenças sexuais no mouse do hipocampo astrócitos após<em&gt; in-vitro</em&gt; isquemia

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrogliosis seguinte hipóxia / isquemia (HI) lesão cerebral -relacionados desempenha um papel no aumento da morbidade e mortalidade em recém-nascidos. Estudos clínicos recentes indicam que a gravidade da lesão cerebral parece ser dependente do sexo, e que os machos recém-nascidos são mais susceptíveis aos efeitos de lesões cerebrais relacionadas-HI, resultando nos resultados neurológicos mais graves, em comparação com mulheres com lesões cerebrais comparáveis. O desenvolvimento de métodos confiáveis ​​para isolar e manter populações altamente enriquecido de astrócitos do hipocampo sexuado é essencial para compreender a base celular das diferenças sexuais nas consequências patológicas de HI neonatal. Neste estudo, descrevemos um método para a criação de culturas de astrócitos do sexo específicos do hipocampo que são submetidos a um modelo de isquemia in vitro, a privação de oxigénio-glicose, seguida por reoxigenação. astrogliosis reactiva subsequente foi examinado por immunostaiNing para a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e a S100B. Este método fornece uma ferramenta útil para estudar o papel do sexo masculino e astrócitos do hipocampo do sexo feminino seguinte HI neonatal, separadamente.

Compreender os papéis de funções de astrócitos sexado em condições fisiológicas ou fisiopatológicas foram imensamente elucidada por cultura destas células sob condições in vitro. O aspecto importante da cultura realizando sexuado é para determinar o sexo do filhote de rato antes da sua utilização. Determinou-se o sexo do ratinho geneticamente por PCR e por avaliação visual (Figura 2) 16. A metodologia de determinação do sexo usando PCR foi aprovado co...

Os astrócitos são um dos principais intervenientes mais importantes no sistema nervoso central (SNC). Aqui, nós estamos relatando um método prático de protocolo de cultura de astrócitos do hipocampo sexuado, a fim de estudar os mecanismos subjacentes a função de astrócitos em filhotes recém-nascidos do sexo masculino e feminino após isquemia in-vitro.

As diferenças sexuais no mouse do hipocampo astrócitos após<em&gt; In-Vitro</em&gt; Isquemia

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

O objetivo geral desta técnica é preparar culturas enriquecidas de astrócitos do hipocampo específicas para cada sexo a partir de camundongos recém-nascidos, como uma ferramenta para estudar os papéis específicos aos sexos dos astrócitos após privação de oxigênio e glicose e subsequente reoxigenação, com o intuito de simular in vitro a hipóxia-isquemia em um ambiente de cultura celular. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave mecanicistas e translacionais relativas ao papel específico aos sexos dos astrócitos do hipocampo após hipóxia-isquemia em cérebros em desenvolvimento de machos e fêmeas. Disseque o cérebro da cabeça de um filhote de camundongo recém-nascido utilizando pequenas tesouras para fazer uma incisão mediana de posterior para anterior através da pele, expondo assim o crânio.Corte cuidadosamente a linha média do crânio do pescoço até o nariz. Use pinça estéril de ponta plana para remover o crânio. Remova o tronco encefálico com a ajuda de pinça curva e coloque o cérebro restante em uma bacia de dissecação.Usando pin&ccedil;as curvas, vire o c&eacute;rebro de modo que a superf&iacute;cie ventral fique voltada para cima e, em seguida, separe os hemisf&eacute;rios com uma l&acirc;mina cir&uacute;rgica est&eacute;ril e afiada. Com pin&ccedil;as curvas planas, afaste os hemisf&eacute;rios cerebrais e remova cuidadosamente o tecido do mesenc&eacute;falo e do t&aacute;lemo, que est&atilde;o salientes, para expor o hipocampo, uma pequena estrutura com formato semelhante ao de um cavalo-marinho localizada no lobo temporal medial. Remova ambos os lobos hipocampais e limpe cuidadosamente as meninges e os fibroblastos da superf&iacute;cie dos lobos puxando com pin&ccedil;as finas.Transfira ambos os lobos hipocampais de um único camundongo para um segundo recipiente contendo aproximadamente 5 mililitros de HBSS e coloque sobre gelo. Pique os lobos aproximadamente 4 vezes usando uma lâmina cirúrgica estéril e afiada. Use uma pipeta estéril de 1 mililitro para transferir o HBSS e o tecido para um tubo cônico estéril de 50 mililitros e, em seguida, centrifugue a 300 vezes G durante 5 minutos.Após a centrifugação, aspire o sobrenadante. Adicione 3 mililitros de tripsina a 0,25 por cento, misture e incube o tecido a 37 graus Celsius por 20 minutos com agitação suave. Após a incubação, centrifugue o tubo a 300 vezes G por 5 minutos.Após a centrifugação, use uma pipeta de vidro estéril para aspirar cuidadosamente o sobrenatante e, em seguida, adicione 10 mililitros de meio de placa pré-aquecido para astrócitos. Pipete de 20 a 30 vezes usando uma pipeta de vidro flamejada. Após nova centrifugação de 5 minutos a 300 ×g, aspire o sobrenatante e adicione 2 mililitros de meio de placa para astrócitos.Passe a suspensão celular através de um filtro de malha de 70 micrômetros para um novo tubo cônico de 50 mililitros. Adicione toda a suspensão celular a um frasco de cultura estéril T-25 revestido contendo 3 mililitros de meio de plating para astrócitos. Incube o frasco a 37 graus Celsius em uma estufa com 5% de dióxido de carbono.No dia seguinte, observe a progressão da confluência astrocitária ao microscópio óptico, aspire o meio e substitua por 2 mililitros de meio fresco para placa de astrócitos. Por volta do 11º dia in vitro, colete os astrócitos confluentes aspirando o meio e, em seguida, adicionando 2 mililitros de tripsina a 0,25%. Gire suavemente o frasco algumas vezes e, então, aspire a tripsina utilizando uma pipeta de vidro estéril.Adicione mais 2 mililitros de tripsina 0,25% e deixe o frasco em repouso à temperatura ambiente por 4 a 5 minutos. Após a remoção da tripsina, coloque o frasco a 37 graus Celsius em uma estufa com 5% de CO₂ por 10 minutos. Após a incubação, adicione 5 mililitros de meio de placa para astrócitos e desprenda a camada astrocitária batendo no frasco de 3 a 4 vezes.Triture suavemente a suspensão celular no fundo do frasco para obter uma dessacoplamento completo e, em seguida, colete os astrócitos em um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue o tubo a 300 ×g por 5 minutos. Aspire o sobrenadante e, em seguida, adicione 1 mililitro de meio fresco para placa de astrócitos.Adicione 10 microlitros da suspensão celular a um hemocitômetro e utilize um microscópio invertido com contraste de fase e objetiva de 10x para contar as células na área central gradeada grande. Dilua as células até aproximadamente 1 × 10⁵ células por 2 mililitros de meio de plating de astrócitos. Pipete 2 mililitros da suspensão celular sobre uma lamínula de vidro revestida com poli-d-lisina no poço de uma placa de cultura de 24 poços.Incubar a 37 graus Celsius em uma estufa com 5% de dióxido de carbono. Para iniciar a privação de oxigênio e glicose, aspire o meio do lamínula contendo astrócitos aderentes e lave uma vez com 1 mililitro de solução isotônica de OGD. Adicione 0,2 mililitros de solução de OGD ao poço e coloque em uma estufa hipóxica.Misture suavemente com um agitador orbital ajustado a 50 rpm durante os primeiros 30 minutos de hipóxia. Para a reoxigenação, substitua a solução de OGD por 2 mililitros de meio de placa para astrócitos e incube em 5% de dióxido de carbono e ar atmosférico a 37 graus Celsius por 5 horas. Esta imagem de imunofluorescência mostra a pureza do cultivo primário de astrócitos hipocampais de camundongo.O cultivo de astrócitos foi imunomarcado para mostrar o marcador de dendrito neuronal, MAP2, em vermelho, e o marcador de micróglias, IBA1, em verde. Os núcleos são corados com DAPI, que aparece em azul. A seta indica contaminação por micróglias.Esta imagem imunofluorescente representativa de astrócitos hipocampais cultivados em condições normóxicas mostra a imunorreatividade de GFAP em vermelho e a marcação de HIF1-alfa em verde. Novamente, os núcleos foram corados com DAPI, que aparece em azul. A seta indica baixa expressão de HIF1-alfa.Após 2 horas de privação de oxigênio e glicose e 5 horas de reoxigenação, a expressão de HIF1-alpha aumentou em astrócitos hipocampais cultivados, conforme indicado pela seta que aponta para a expressão nuclear elevada de HIF1-alpha. A expressão de GFAP e de S100b foi regulada para cima em culturas de astrócitos hipocampais de camundongos machos após privação de oxigênio e glicose e reoxigenação. A regulação positiva de S100b e GFAP também foi observada em astrócitos obtidos de camundongos fêmeas.Após este procedimento, outros métodos como PCR quantitativa, western blot, siRNA e colorações imunohistoquímicas podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como alterações específicas ao sexo em determinadas expressões gênicas e proteicas após isquemia in vitro. Após seu desenvolvimento, esta técnica pode abrir caminho para pesquisadores na área de neurociência explorarem os efeitos e consequências do acidente vascular cerebral no hipocampo, estudando os astrócitos em cultura.

sex-differences-mouse-hippocampal-astrocytes-after-vitro

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Moye, S. L., et.al.  Visualizando a morfologia dos astrócitos usando a iontoforese amarela de Lúcifer. J. Vis. Exp. (2019).  Este vídeo demonstra o uso de iontoforese de corante fluorescente para estudar a morfologia de astrócitos em fatias fixas de cérebro. Ele detalha a perfuração do soma do astrócito com um eletrodo para fornecer um corante aniônico e hidrofílico no citoplasma sob uma corrente de baixa voltagem, permitindo que o corante se difunda e rotule o soma e os ramos. A...

Visualizando a morfologia dos astrócitos usando iontoforese de corante fluorescente em uma fatia de cérebro de camundongo fixa

Culturas neuronais embrionárias primárias dissociadas do hipocampo são úteis para investigar os mecanismos de sinalização envolvidos na morte dos neurônios. A sexagem dos embriões antes do isolamento e dissociação do hipocampo permite a preparação de culturas masculinas e femininas separadas, o que permite ao pesquisador identificar e investigar a sinalização celular específica do sexo.

Culturas neuronais estratificadas por sexo para estudar vias de morte celular isquêmica

Trauma cerebral aguda é uma lesão grave que não tem tratamento adequado à data. Microscopia Multiphoton permite estudar longitudinalmente o processo de desenvolvimento agudo trauma cerebral e sondagem estratégias terapêuticas em roedores. Dois modelos de trauma cerebral aguda estudou com in vivo de dois fótons de imagem de cérebro são demonstrados neste protocolo.

Aguda Cérebro Trauma em camundongos seguiu por Longitudinal dois fótons de imagem

Um protocolo para culturas fatia organotípica entorhino-hipocampal, que permite a reprodução de muitos aspectos da lesão cerebral isquêmica, é apresentado. Ao estudar as mudanças do neurovasculature além de alterações nos neurônios, este protocolo é uma ferramenta versátil para estudar mudanças plásticas no tecido neural após lesão.

A Análise de Neurovascular Remodelação em Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia

Nós descrevemos um protocolo de imuno-histoquímica para estudar o perfil de ativação dos neurônios do hipocampo após a exposição a uma tarefa de aprendizagem espacial em um modelo de rato caracterizado por déficits cognitivos de origem do desenvolvimento neurológico. Este protocolo pode ser aplicado a ambos os modelos genéticos ou farmacológicos de ratinho caracterizadas por disfunções cognitivas.

A visualização imuno-histoquímica de Hippocampal Neuron Atividade Após Spatial Aprendizagem em um rato modelo de desordens do desenvolvimento neurológico

Realizamos a oclusão da artéria carótida unilateral no pós-Natal dia 7-10 CD-1 mouse filhotes para criar um modelo de (HI) hipóxico-isquêmica neonatal e investigaram os efeitos da lesão cerebral de HI. Nós estudamos funções Neurocomportamentais nestes ratos em comparação com camundongos normais não operado.

Neurocomportamentais avaliações em um modelo do rato de lesão cerebral hipóxica-isquêmica Neonatal

O presente manuscrito detalha como isolar as artérias hipocampais e capilares do cérebro do rato e como pressioná-las para a miografia de pressão, imunofluorescência, bioquímica e estudos moleculares.

Ex Vivo pressurizado Hipocampal Capilar-Parenchymal Arteriole Preparação para estudo funcional

Este protocolo descreve métodos de seção, coloração e seções de tecido flutuante de imagem do cérebro do camundongo, seguido por uma descrição detalhada da análise do volume de território de astrócito e da sobreposição de território de astrócito.

Análise do volume do território de astutação e revestimento em seções de tecido livre grossa

O protocolo descreve traumatismo cranioencefálico leve em modelo de camundongo. Em particular, um protocolo passo-a-passo para induzir um traumatismo cranioencefálico fechado na linha média leve e a caracterização do modelo animal são totalmente explicados.

Modelo de Lesão Cerebral Traumática Leve em Camundongos com Controle Eletromagnético

Este protocolo descreve a expressão ectópica mediada por vírus de Neurod1 após acidente vascular cerebral isquêmico cortical. O Neurod1 é administrado (1) usando o sistema Cre-Flex AAV em camundongos do tipo selvagem durante a fase subaguda pós-AVC (7 dias) e (2) usando um único vetor AAV em camundongos repórteres condicionais durante a fase crônica pós-AVC (21 dias).

Sistemas AAV e modelos de camundongos para investigar a expressão ectópica de Neurod1 em células transduzidas em tempos subagudos e crônicos pós-AVC isquêmico

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir hipóxia em camundongos neonatais, entregando-os em ambientes controlados com concentrações variáveis de oxigênio. Modelos de camundongos submetidos a variações de oxigênio ao nascimento variaram de forma duradoura a expressão de miRNAs envolvidos na indução de alterações fenotípicas comportamentais, como o autismo.

Hipóxia altera os níveis de miRNAs envolvidos na herança não mendeliana do transtorno do espectro autista em camundongos

Aprenda a isolar e cultivar astrócitos hipocampais sexo-específicos de camundongos neonatos para estudar respostas à privação de oxigênio e glicose. Este método permite investigar diferenças sexuais na lesão cerebral hipóxico-isquêmica neonatal.

As diferenças sexuais no mouse do hipocampo astrócitos após

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