Name: HSV-Mediated expressão do transgene da quiméricos Construções para estudar a função comportamental de GPCR heterómeros em Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Aprenda a usar transferência gênica mediada por HSV para estudar heterodimerização de GPCRs em camundongos. Este método permite investigar respostas comportamentais induzidas por alucinógenos e o papel do complexo 5-HT2A-mGlu2 em modelos de psicose.

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NIH R01MH084894 participou no financiamento deste estudo. Nós gostaríamos de agradecer Drs. Yasmin Hurd e Scott Russo no Mount Sinai School of Medicine para a doação de ratos eo uso de suas instalações de cirurgia e comportamento durante as filmagens deste trabalho.

NOTA: Todos os procedimentos para a criação e dos cuidados dos animais foram realizados de acordo com o regulamento da Comissão de Cuidados e Uso de Animais Institucional (IACUC) de Icahn Faculdade de Medicina Mount Sinai. Certifique-se de usar luvas estéreis durante todo o procedimento. 1. Preparação de drogas e vírus <ol><li> Preparação da droga <ol><li> Prepare 15,0 ml de cetamina / xilazina anestésico por dissolução de 1,35 ml de 100 mg / ml de cetamina e 0,75 ml de 20 mg / ml de xilazina em 12,9 mL de 0,9% solução salina. Misture bem solução. </li></ol></li><li> Preparação de vírus <ol><li> Clone a mGlu2 e mGlu2ΔTM4N constrói num vector bicistrónico vírus do herpes simplex (HSV) seguindo protocolos convencionais anteriormente descrito 6. Compactar as partículas virais, como anteriormente descrito 6,13,14. A substituição de resíduos de Ala-677 4,40, Ala-681 4,44 e 4,48 em Ala685 mGlu2 para Ser686 4,40, PhE690 4,44 e Gli-694 4,48 em mGlu3 (HA-mGlu2ΔTM4N) foram descritos anteriormente 6. NOTA: foi previamente demonstrado que a construção quimérica HA-mGlu2ΔTM4N é expresso na membrana plasmática intacta com G dependente de proteína de sinalização 6. </li><li> Armazenar vectores virais em -80 ° C quando não estiver em uso. Descongelar vector viral em gelo, e, em seguida, aliquotar em alíquotas de 10 ul. Para o procedimento cirúrgico, manter em gelo. </li></ol></li></ol> 2. Cirurgia <ol><li> Preparação cirurgia <ol><li> Pesar do mouse e injetar rato com dose apropriada de cocktail de cetamina / xilazina (para detalhes, ver 1.1.1). </li><li> Verifique mouse para ver se devidamente anestesiados, espremer pé e cauda de resposta à dor, se não for possível obter uma resposta, o mouse está devidamente anestesiados. </li><li> Raspar a cabeça do rato a partir da base do crânio até a ponta do nariz usando cortadores. Aplique gel oftalmológico à af ratoterward para prevenir a cegueira do mouse. </li><li> Carregue cada seringa no quadro estereotáxico. Depois incline porção perpendicular de cada braço da armação estereotáxica de modo que eles estão 10 graus fora do normal. Certifique-se de que os braços são inclinadas, de modo que as agulhas estão enfrentando uns aos outros. </li><li> Limpar cada seringa, enchendo a agulha com 70% de etanol. Encher a agulha de, pelo menos, três vezes para garantir que a seringa é limpa. </li><li> Uma vez que a agulha foi limpa, lave a agulha, preenchendo a agulha com dupla H2O destilada Uma vez liberado, encha cada agulha com 1,3 l de dupla H2O destilada Torcer o êmbolo da seringa para libertar 0,3 ul de dupla H2O destilada Se contas de água na ponta da agulha, cuidadosamente limpar a água. Se nada sai da seringa, empurre o êmbolo completamente para baixo e, em seguida, repita a limpeza da seringa. </li><li> Depois de encher com água, em seguida, puxe a seringa encher a seringa com0,5 l de ar. </li><li> Uma vez que o ar e a água está na seringa, cuidadosamente encher a seringa, com 1,3 ml de solução de vírus. Neste ponto a que o volume total da seringa é de 2,8 ul. Novamente torcer a ponta da seringa para libertar 0,3 mL de vírus. Se os grânulos de líquido na extremidade da agulha, cuidadosamente enxugar líquido. Se nada sai da seringa, empurre o êmbolo completamente para baixo e, em seguida, repita a limpeza da seringa. </li></ol></li><li> Cirurgia <ol><li> Anexar o mouse para o quadro estereotáxico, certificando-se de ajustar o quadro estereotáxico para que o crânio é plana e na horizontal. Aplicar povodine-iodo para o couro cabeludo exposto. Utilizando um bisturi, fazer uma incisão sagital na linha média do crânio dentro da área rapada exposta. Em seguida, anexar os grampos buret para a pele no local da incisão para se certificar de que o crânio permanece exposta. </li><li> Use H 2 O 2 a dissolver o periósteo para expor as suturas docrânio. Agora que o bregma e suturas são visíveis, não se esqueça de ajustar o quadro estereotáxico para se certificar de que o crânio é nível. </li><li> Alinhar as pontas das agulhas das seringas com a bregma e gravar as coordenadas do bregma. Calcular as coordenadas do que as agulhas vão ser inseridas. <ol><li> Para o plano Rostral-Cauldal (RC), adicionar 1,6 mm para os gravados RC coordenadas bregma (+1,6 da bregma). Para o plano dorsal-ventral (DV), subtrair 2,4 mm a partir das coordenadas bregma DV gravadas (-2,4 partir de bregma). </li><li> Finalmente, para o plano Medial Lateral (ML), adicionar 2,6 mm para os gravados ML coordenadas bregma (+2,6 da bregma). Para todas as coordenadas certifique-se de gravar ambas as coordenadas esquerda e direita, como esta é uma injeção bilateral. </li></ol></li><li> Traga as agulhas para as coordenadas desejadas. Marque os locais de onde as agulhas estão indo para ser inserido e com uma broca, perfurar as áreas marcadas. </li><li> Com um aplicador de ponta de algodão wipe afastado qualquer fragmento de sangue ou osso excesso. </li><li> Traga as agulhas para o crânio onde as pontas das agulhas estão em contacto a superfície do cérebro. Em seguida, abaixe as agulhas para as coordenadas desejadas lentamente abaixá-los. </li><li> Uma vez que as agulhas são as coordenadas desejadas, lentamente injectar o conteúdo da seringa, rodando o êmbolo da agulha de 0,1 ul por minuto ao longo de 5 minutos (no total 0,5 mL). </li><li> Depois de a injecção ter sido feita sair da seringa no córtex durante mais 5 min. </li></ol></li><li> Fechando Up / Cuidados <ol><li> Retirar as agulhas a partir do córtex de rato de forma constante e lentamente. Em seguida, retire o mouse do quadro estereotáxico. </li><li> Aplicar cianoacrilato (adesivo dérmico) para as abas de base de pele a partir da incisão com uma pinça e, em seguida, agarrar as abas de pele e colocá-los em conjunto. </li><li> Permitir que o cianoacrilato para secar. Coloque o rato na gaiola sobre uma almofada de aquecimento (almofada de aquecimento é opcional se o surgsuíte iCal é mantida sob RT de 37 ° C - caso contrário, não é necessário). Certifique-se de colocar o mouse sobre uma toalha de papel para se certificar de que a cama não adere ao local da cirurgia. </li><li> Dependendo da duração do processo cirúrgico, assegurar que os ratos é de anestesia dentro de 30 - 60 min após o procedimento. Após a cirurgia, o animal é colocado na sua própria gaiola e monitorizado até que se torne consciente antes de retornar ao seu ambiente para recuperar. Nenhum analgésicos são usados ​​no pós-operatório, porque podem alterar os resultados de nossos experimentos, modificando alguns dos caminhos bioquímicos cerebrais. No entanto, os animais são monitorizados até recuperarem da anestesia no dia da cirurgia, e pós-operação diariamente para sinais de infecção e avaliação de dor / desconforto. </li></ol></li></ol> Experiência 3. Cabeça Twitch Response <ol><li> Configuração <ol><li> Realizar todos os testes comportamentais 10:00 - 14:00, 2 - 3 dias após stereotaCTIC injecção de partículas virais. </li><li> Dissolve-se (±) -1- (2,5-dimetoxi-4-iodofenil) -2-aminopropano (DOI) em uma solução salina a 0,9% para 2,0 mg / kg. Também prepare uma solução salina a 0,9%. </li><li> Prepare uma gaiola (28 x 18 x 15 cm), sem qualquer roupa de cama e usando um tri-pod, ajustar a câmera para que a vista da câmera de vídeo está diretamente acima da gaiola. </li><li> Habituar os ratos ao ambiente durante pelo menos 4 horas antes do início da experiência. </li><li> Configurar uma câmera de vídeo para gravar a contração cabeça. </li></ol></li><li> Experimentar <ol><li> Posicione a câmera de modo que é diretamente sobre uma gaiola. Calibrar a câmara para que toda a gaiola está no campo de visão. </li><li> Pesar ratinho e rato injectar por via intraperitoneal com a dose apropriada de qualquer de 0,9% de solução salina ou DOI (0,01 ml / g). NOTA: Se um rato pesa 25 gramas, administrar a dose para um volume total de 0,25 ml. </li><li> Coloque cada mouse de volta em sua gaiola casa foR 10 min. Após 10 min, rato lugar no centro da gaiola vazio e validar que não existem pontos cegos no campo de visão da câmara. Pressione gravar na câmara de vídeo. Deixe o quarto. NOTA: Movimentos do mouse e várias respostas comportamentais nele (... A cabeça contração muscular, zero ouvido, etc Por favor, consulte a tabela de dados suplementar 1 de Gonzalez-Maeso et al 2007 para a lista completa de respostas comportamentais induzidas por DOI) 3, será gravado por 30 minutos. Portanto, é importante não existem pontos cegos no campo de visão gravada. </li><li> Após 30 min parar a gravação no mouse câmara de vídeo e lugar de volta na gaiola lar original. Repita esse processo para cada rato. </li></ol></li><li> revisão <ol><li> Tem cada revisão árbitro as fitas cegar para as condições experimentais de rato (ie., Os medicamentos utilizados durante cabeça contração experiência ou vírus utilizado durante a injeção intracraniana)). registrar manualmente cada cabeça contração througHout o vídeo. NOTA: Head-contração é definido como um movimento rápido balançando a cabeça conduzida por um mouse (vídeo suplementar). </li><li> Para cada rato, em média, a resposta HTR final os três totais dos árbitros cegos. Em seguida, agrupar esses valores por condição experimental e realizar análises estatísticas (ie., T-test ou ANOVA). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Juntamente com os resultados anteriores em ratinhos KO-mGlu2 5, os resultados com mGlu2 e mGlu2 / mGlu3 construções quiméricas que não formam o complexo receptor 2A -mGlu2 5-HT, em células cultivadas sugerem que o 5-HT 2A -mGlu2 complexo receptor heteromérico em rato córtex frontal é necessário para induzir o comportamento cabeça de contração por agonistas dos receptores 5-HT2A alucinógenos semelhantes ao LSD. Uma limitação deste método é que ele não mede proximidade molecular...

Alucinógenos, como o LSD, a psilocibina e mescalina causar mudanças significativas na consciência humana, cognição e emoção 7-9. Inactivação de sinalização do receptor de serotonina 5-HT2A por abordagens genéticas ou farmacológicas quer marcadamente atenuado provoca respostas comportamentais ao alucinógenos em ambos os modelos de roedores e seres humanos 3,10 11. Embora alucinógenos ligar outros subtipos de receptores 8, o receptor 5-HT 2A é considerado como necessário para a actividade comportamental única destes produtos químicos. Grupo II receptores de glutamato metabotrópicos (ie., MGlu2 e mGlu3) têm sido alvo de considerável atenção sobre o mecanismo molecular de alucinógenos e seu papel fundamental subjacente a psicose 12. Anteriormente, foi demonstrado que os ratinhos com nenhuma expressão de proteína de mGlu2 (ratinhos de mGlu2-KO) são insensíveis aos efeitos celulares e comportamentais de Hallucinogens 5. Também tem sido sugerido que a 5-HT 2A e os receptores de mGlu2 formar um complexo heteromérico específico através do qual a serotonina e glutamato ligandos modular o padrão de acoplamento de proteínas G em células vivas 1,2. Estruturalmente, transmembranares (TM) domínios 4 e 5 do mGlu2 desempenham um papel fundamental na formação heteromérica com o receptor 5-HT 2A 5. Adicionalmente, investigação adicional demonstrou que três resíduos localizados na extremidade intracelular de TM4 de mGlu2 são necessários para formar o heterocomplexo do receptor A2A -mGlu2 5-HT 6 em células vivas. Com base nestes resultados observados em sistemas de expressão heterólogos, aqui descreve-se o uso da expressão de HSV-mediada de tipo selvagem de mGlu2 e mGlu2 / mGlu3 construções quiméricas no córtex frontal de ratos mGlu2-KO para testar se a formação heteromérica entre 5-HT 2A e mGlu2 é necessário para ocomportamento cabeça de contração induzida por agonistas dos receptores 5-HT2A alucinógenas.

<table><tbody><tr><td>mGlu2 vetor do vírus herpes simplex (HSV) bicitrônico</td><td>O MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 e o mGlu2DTM4N foram subclonados no vetor do vírus bicistrônico HSV-GFP p1005+ HSV expressando GFP sob o controle do promotor do CMV. As partículas virais foram produzidas pelo Viral Core Facility do McGovern Institute (MIT). Para mais informações, entre em contato com a diretora, Dra. Rachael Neve (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>mGlu2&Delta; TM4N vetor do vírus do herpes simplex (HSV) bicitrônico</td><td>O MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 e o mGlu2DTM4N foram subclonados no vetor do vírus bicistrônico HSV-GFP p1005+ HSV expressando GFP sob o controle do promotor do CMV. As partículas virais foram produzidas pelo Viral Core Facility do McGovern Institute (MIT). Para mais informações, entre em contato com a diretora, Dra. Rachael Neve (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>GFP vetor do vírus herpes simplex bicitrônico (HSV)&nbsp;</td><td>O MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 e o mGlu2DTM4N foram subclonados no vetor do vírus bicistrônico HSV-GFP p1005+ HSV expressando GFP sob o controle do promotor do CMV. As partículas virais foram produzidas pelo Viral Core Facility do McGovern Institute (MIT). Para mais informações, entre em contato com a diretora, Dra. Rachael Neve (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>Xilazina&nbsp;</td><td>Lloyd</td><td>List no. 4811-20ml, NADA #139-236, Código(s) NDC: 61311-481-10</td><td>1,35 ml de cetamina (100 mg/ml) + 0,75 ml de xilazina (20 mg/ml) são diluídos em 12,0 ml de solução salina a 0,9%</td></tr><tr><td>Cetamina&nbsp;</td><td>Vedco</td><td>KetaVed-10ml, NADA #200-029, Código(s) NDC: 50989-161-06</td><td>1,35 ml de cetamina (100 mg/ml) + 0,75 ml de xilazina (20 mg/ml) são diluídos em 12,0 ml de solução salina a 0,9%</td></tr><tr><td>Gel oftálmico</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0550805</td><td></td></tr><tr><td>Clipes Burret Fisher</td><td>Scientific</td><td>NC9268369</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina cirúrgica Feather</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9032736</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peróxido</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-898-919&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>14815203</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton&trade; Agulhas Removíveis de Cubo Pequeno (33 Ga)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14816206</td><td></td></tr><tr><td>Micro Broca Sem Fio</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9089241</td><td></td></tr><tr><td>Dermabond Adesivo Dérmico</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0690470</td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)Cloridrato de -1-(2,5-dimetoxi-4-iodofenil)-2-aminopropano (DOI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42203-78-1</td><td>Dissolvido em solução salina a 0,9% na concentração de 2,0 mg/kg</td></tr></tbody></table>

hsv-mediated expressão do transgene da quiméricos construções para estudar a função comportamental de gpcr heterómeros em ratos

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

O complexo receptor heteromérico entre 5-HT2A e mGlu2 tem sido implicado em alguns dos fenótipos comportamentais em modelos de psicose em camundongos1,2. Consequentemente, a investigação de detalhes estruturais da interação entre 5-HT2A e mGlu2 afetando comportamentos relacionados à esquizofrenia representa uma poderosa ferramenta translacional. Como mostrado anteriormente, a resposta de contração da cabeça (HTR) em camundongos é provocada por drogas alucinógenas e essa resposta comportamental está ausente em camundongos 5-HT2A knockout (KO)3,4. Além disso, ao expressar condicionalmente o receptor 5-HT2A apenas no córtex, foi demonstrado que as vias de sinalização dependentes do receptor 5-HT2A nos neurônios piramidais corticais são suficientes para provocar o comportamento de contração da cabeça em resposta a drogas alucinógenas3. Finalmente, foi demonstrado que a resposta comportamental de contração da cabeça induzida pelos alucinógenos DOI e dietilamida do ácido lisérgico (LSD) é significativamente diminuída em camundongos mGlu2-KO5. Esses achados sugerem que o mGlu2 é, pelo menos em parte, necessário para os efeitos comportamentais semelhantes à psicose dependente do receptor 5-HT2A induzidos por drogas semelhantes ao LSD. No entanto, isso não fornece evidências sobre se o complexo receptor 5-HT2A-mGlu2 é necessário para esse fenótipo comportamental. Para resolver essa questão, construções do vírus herpes simplex (HSV) para expressar mGlu2 ou mGlu2ΔTM4N (construção quimérica mGlu2 / mGlu3 que não forma o complexo receptor 5-HT2A-mGlu2) no córtex frontal de camundongos mGlu2-KO foram usadas para examinar se esse complexo heteromérico GPCR é necessário para os efeitos comportamentais induzidos por drogas semelhantes ao LSD6.

Constatações anteriores demonstram que a cabeça de contração resposta comportamental murino é confiável e robusta provocada por alucinógenos, e é ausente em 5-HT 2A ratos -Ko 3. Além disso, demonstrou-se que a resposta da cabeça de contração induzida por alucinogénios os agonistas de 5-HT 2A e DOI LSD foi significativamente diminuída em ratinhos KO mGlu2-5. No entanto, apesar de resultados anteriores demonstram de forma convincente que a 5-HT <...

Este artigo descreve como para injetar vetores virais no córtex frontal do rato para testar ensaios comportamentais que exigem formação heteromérica GPCR.

HSV-Mediated expressão do transgene da quiméricos Construções para estudar a função comportamental de GPCR heterómeros em Ratos

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

O objetivo geral deste método é observar como a transferência gênica mediada por vírus afeta fenótipos comportamentais que requerem heterodimerização de receptores acoplados à proteína G em modelos murinos. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área de neuro e psicofarmacologia. Especificamente, como os receptores acoplados à proteína G interagem entre si em nível molecular.Utilizando este método, podemos compreender como essa interação afeta o comportamento em modelos de transtornos psiquiátricos, como esquizofrenia e depressão. Com o uso deste método, vamos analisar especificamente o receptor de serotonina 2a e o receptor metabotrópico de glutamato 2, ambos já demonstrados como envolvidos no mecanismo de ação de medicamentos utilizados no tratamento de pacientes com esquizofrenia. Comece por anestesiar adequadamente o camundongo conforme métodos aprovados.Certifique-se de que um plano cirúrgico de anestesia foi alcançado realizando um aperto no dedo do pé e observando a ausência de resposta. Em seguida, aplique gel oftálmico para proteger os olhos. Prenda o camundongo no estereotáxico, certificando-se de ajustar a inclinação da cabeça para que o crânio fique nivelado e plano.Aplicar iodopovidona no couro cabeludo exposto. Com um bisturi, fazer uma incisão sagital ao longo da linha média do crânio na área exposta e raspada. Em seguida, prender grampos Pureit na pele no local da incisão para garantir que o crânio permaneça exposto.Aplicar peróxido de hidrogênio para dissolver o periósteo e expor as suturas do crânio. Agora que o bregma e as suturas estão visíveis, ajuste o quadro estereotáxico para garantir que o crânio esteja nivelado. Alinhe as pontas das agulhas das seringas com o bregma e registre as coordenadas do bregma.Para injetar bilateralmente a camada frontal, adicione 1,6 mm à coordenada bregmática rostrocaudal registrada e 2,6 mm à coordenada bregmática mediolateral registrada. Marque os locais de injeção sobre o crânio e, em seguida, faça pequenos furos nos locais de injeção. Com um aplicador de algodão, remova qualquer sangue ou fragmentos ósseos em excesso.Traga a agulha até a superfície do cérebro e abaixe até a profundidade da coordenada dorsal-ventral. Em seguida, injete lentamente o conteúdo da seringa girando o êmbolo da agulha para administrar 0,1 microlitros por minuto durante cinco minutos, resultando em uma injeção de 0,5 microlitro. Deixe a seringa permanecer no local por cinco minutos.Após o tempo determinado, retire o animal da estereotaxia, feche a incisão e coloque sobre uma placa aquecida. Administre analgesia pós-operatória de acordo com o protocolo aprovado para o uso de animais. Realize testes comportamentais dois a três dias após a injeção estereotáxica de partículas virais.Habitue os camundongos na sala por pelo menos quatro horas antes do início do experimento. Comece dissolvendo DOI em uma solução salina a 0,9 por cento até a concentração de dois miligramas por quilograma. Prepare uma gaiola domiciliar sem qualquer cama e, com o auxílio de um tripé, posicione uma câmera diretamente acima da gaiola.Calibre a câmera para que toda a gaiola de alojamento esteja no campo de visão. Pese o camundongo e injete intraperitonealmente a dose apropriada de solução salina a 0,9 por cento ou DOI. Coloque o camundongo de volta na gaiola de alojamento por dez minutos.Após dez minutos, coloque o camundongo no centro da gaiola domiciliar vazia e certifique-se de que não há pontos cegos no campo de visão da câmera. Pressione o botão de gravação na câmera e saia da sala. Após 30 minutos, pare a gravação e devolva o camundongo à gaiola domiciliar original.Repita o teste comportamental no próximo camundongo. Peça ao avaliador revisar os vídeos sem conhecimento das condições experimentais. Registre manualmente todos os movimentos rápidos da cabeça ao longo do vídeo.Um tremor da cabeça é definido como um movimento rápido de sacudida da cabeça realizado por um camundongo. Processe os dados conforme descrito na parte escrita do protocolo. Aqui é mostrada uma imagem representativa da expressão de transgene mediada por HSV no córtex frontal.O HSV mGlu2 GFP foi injetado no córtex frontal e a expressão de GFP foi revelada por imunocitoquímica. Esta barra de escala representa 200 micrômetros. Esta imagem mostra um western blot da expressão do transgene mediada por HSV e da reatividade anti-mGlu2 no córtex frontal de camundongos knockout para mGlu2.Aqui medimos a imunorreatividade do mGlu2 como monômero. Este histograma mostra que a expressão mediada por vírus do mGlu2, mas não do mGlu2 quimérico na córtex frontal de camundongos knockout para mGlu2, resgata significativamente a resposta de espasmo da cabeça induzida pelo agonista do receptor de serotonina 2a, DOI, alucinógeno. As etapas mais críticas deste experimento são os intervalos entre as injeções virais, a resposta de espasmo da cabeça e o momento em que os camundongos são sacrificados.Qualquer atraso pode alterar os resultados do experimento ou introduzir ambiguidade nos dados. Após dominada, a cirurgia em camundongo levará aproximadamente 30 minutos para injetar o vírus. O experimento de tremor da cabeça também deve levar aproximadamente 35 minutos por camundongo.Recomenda-se realizar cirurgias escalonadas, ou seja, operar mais de um camundongo ao mesmo tempo. Dessa forma, é possível manter uma cronologia que permite realizar os experimentos de movimento sacádico da cabeça entre três e quatro dias após a cirurgia, período em que ocorre a expressão máxima do vetor viral. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós apresentamos um protocolo para a produção de antígenos específicos do mouse células T usando transdução...

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

Vetores virais permitem a manipulação de genes alvo. Nós demonstramos um método para a expressão de genes condicionais ou ablação da medula espinhal de rato, utilizando a injecção estereotáxica de um vector viral no corno dorsal, um local proeminente de contacto sináptico entre os aferentes primários e os neurónios de somatossensorial no sistema nervoso central.

Injeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação genética condicional no Cabo de Rato Spinal

Capitalizando uma estratégia genética binária, fornecemos um protocolo detalhado para rastreamento de circuitos neurais em camundongos que expressam traçadores transsinápticos complementares após a recombinação mediada por Cre. Como a produção de traçadores específicos da célula é codificada geneticamente, nossa abordagem experimental é adequada para estudar a formação e maturação de circuitos neurais durante o desenvolvimento do cérebro embrionário murino em uma única resolução celular.

Condicional Genetic transsináptica Tracing no Embryonic do cérebro do rato

O sistema nervoso entérico é formado por células da crista neural que proliferam, migram e colonizam o intestino. As células da crista neural se diferenciam em neurônios com marcadores específicos para seu fenótipo de neurotransmissor. Este protocolo descreve uma técnica de dissecação, fixação e imunocoloração do trato gastrointestinal embrionário murino para visualizar a expressão de neurotransmissores do sistema nervoso entérico.

Immunostaining para Visualize Murino desenvolvimento do sistema nervoso entérico

Este vídeo mostra o procedimento de craniotomia que permite imagens crônicas de neurônios no córtex retroesplenial de camundongos usando microscopia in vivo de dois fótons na linha transgênica Thy1-GFP. Essa abordagem é combinada com a injeção de vírus adeno-associado que expressa mCherry no hipocampo dorsal. Essas técnicas permitem o monitoramento de longo prazo da plasticidade estrutural dependente da experiência em RSC.

Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

O atual combina de protocolo único celular emparelhado humana TCR alfa e beta cadeia sequenciamento com simplificada geração de vetores retrovirais compatíveis com expressão de TCR in vitro e in vivo .

Aerodinâmico única célula TCR isolamento e geração de vetores retrovirais para In Vitro e In Vivo de expressão de TCRs humanas

Intraspinal injeção de recombinase dependente recombinante vírus adeno-associado (rAAV) pode ser usada para manipular qualquer tipo de célula geneticamente rotulados na medula espinhal. Aqui descrevemos como transduce neurônios no Corno dorsal da medula espinhal lombar. Esta técnica permite interrogatório funcional do subtipo neurônio manipulado.

Expressão do Transgene de mediada por vírus adeno-associado em geneticamente definidos neurônios da medula espinhal

Aqui, apresentamos um protocolo para promover a integração do transgene e produção de ratos transgénicos fundador com eficácia elevada por uma simples injeção de um vetor de Lentivirus no espaço de um oócito fertilizado perivitelline.

Particulas de Lentivirus mediada produção de camundongos transgênicos: um método simples e altamente eficiente para estudo direto dos fundadores

Apresentada aqui é uma plataforma microscópica multifotípica para imagens de superfície ocular de rato vivo. O camundongo transgênico fluorescente permite a visualização de núcleos celulares, membranas celulares, fibras nervosas e capilares dentro da superfície ocular. Sinais de segunda geração harmônica não lineares derivados de estruturas colágenas fornecem imagens sem rótulos para arquiteturas estromais.

Uma plataforma personalizada de microscopia multifotn para imagens ao vivo de córnea de rato e conjuntiva

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Direcionamento de genes mediados por CRISPR/Cas9 retroviral para o estudo da diferenciação Th17 in vitro

Apresentamos protocolos aprimorados para transdução retroviral de receptores de tráfego e homing competitivo para estudar o posicionamento de linfócitos específicos de órgãos e microambientes mediados por receptores. Este método oferece informações valiosas sobre os mecanismos de tráfego de células imunes e tem aplicações potenciais em futuras pesquisas básicas e terapêuticas.

Transdução retroviral eficiente e homing competitivo para investigar a localização de células T mediadas por GPCR em diversos microambientes teciduais

Aprenda a usar transferência gênica mediada por HSV para estudar heterodimerização de GPCRs em camundongos. Este método permite investigar respostas comportamentais induzidas por alucinógenos e o papel do complexo 5-HT2A-mGlu2 em modelos de psicose.

HSV-Mediated expressão do transgene da quiméricos Construções para estudar a função comportamental de GPCR heterómeros em Ratos

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