HSV-Mediated expressão do transgene da quiméricos Construções para estudar a função comportamental de GPCR heterómeros em Ratos

O objetivo geral deste método é observar como a transferência gênica mediada por vírus afeta fenótipos comportamentais que requerem heterodimerização de receptores acoplados à proteína G em modelos murinos. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área de neuro e psicofarmacologia. Especificamente, como os receptores acoplados à proteína G interagem entre si em nível molecular.

Utilizando este método, podemos compreender como essa interação afeta o comportamento em modelos de transtornos psiquiátricos, como esquizofrenia e depressão. Com o uso deste método, vamos analisar especificamente o receptor de serotonina 2a e o receptor metabotrópico de glutamato 2, ambos já demonstrados como envolvidos no mecanismo de ação de medicamentos utilizados no tratamento de pacientes com esquizofrenia. Comece por anestesiar adequadamente o camundongo conforme métodos aprovados.

Certifique-se de que um plano cirúrgico de anestesia foi alcançado realizando um aperto no dedo do pé e observando a ausência de resposta. Em seguida, aplique gel oftálmico para proteger os olhos. Prenda o camundongo no estereotáxico, certificando-se de ajustar a inclinação da cabeça para que o crânio fique nivelado e plano.

Aplicar iodopovidona no couro cabeludo exposto. Com um bisturi, fazer uma incisão sagital ao longo da linha média do crânio na área exposta e raspada. Em seguida, prender grampos Pureit na pele no local da incisão para garantir que o crânio permaneça exposto.

Aplicar peróxido de hidrogênio para dissolver o periósteo e expor as suturas do crânio. Agora que o bregma e as suturas estão visíveis, ajuste o quadro estereotáxico para garantir que o crânio esteja nivelado. Alinhe as pontas das agulhas das seringas com o bregma e registre as coordenadas do bregma.

Para injetar bilateralmente a camada frontal, adicione 1,6 mm à coordenada bregmática rostrocaudal registrada e 2,6 mm à coordenada bregmática mediolateral registrada. Marque os locais de injeção sobre o crânio e, em seguida, faça pequenos furos nos locais de injeção. Com um aplicador de algodão, remova qualquer sangue ou fragmentos ósseos em excesso.

Traga a agulha até a superfície do cérebro e abaixe até a profundidade da coordenada dorsal-ventral. Em seguida, injete lentamente o conteúdo da seringa girando o êmbolo da agulha para administrar 0,1 microlitros por minuto durante cinco minutos, resultando em uma injeção de 0,5 microlitro. Deixe a seringa permanecer no local por cinco minutos.

Após o tempo determinado, retire o animal da estereotaxia, feche a incisão e coloque sobre uma placa aquecida. Administre analgesia pós-operatória de acordo com o protocolo aprovado para o uso de animais. Realize testes comportamentais dois a três dias após a injeção estereotáxica de partículas virais.

Habitue os camundongos na sala por pelo menos quatro horas antes do início do experimento. Comece dissolvendo DOI em uma solução salina a 0,9 por cento até a concentração de dois miligramas por quilograma. Prepare uma gaiola domiciliar sem qualquer cama e, com o auxílio de um tripé, posicione uma câmera diretamente acima da gaiola.

Calibre a câmera para que toda a gaiola de alojamento esteja no campo de visão. Pese o camundongo e injete intraperitonealmente a dose apropriada de solução salina a 0,9 por cento ou DOI. Coloque o camundongo de volta na gaiola de alojamento por dez minutos.

Após dez minutos, coloque o camundongo no centro da gaiola domiciliar vazia e certifique-se de que não há pontos cegos no campo de visão da câmera. Pressione o botão de gravação na câmera e saia da sala. Após 30 minutos, pare a gravação e devolva o camundongo à gaiola domiciliar original.

Repita o teste comportamental no próximo camundongo. Peça ao avaliador revisar os vídeos sem conhecimento das condições experimentais. Registre manualmente todos os movimentos rápidos da cabeça ao longo do vídeo.

Um tremor da cabeça é definido como um movimento rápido de sacudida da cabeça realizado por um camundongo. Processe os dados conforme descrito na parte escrita do protocolo. Aqui é mostrada uma imagem representativa da expressão de transgene mediada por HSV no córtex frontal.

O HSV mGlu2 GFP foi injetado no córtex frontal e a expressão de GFP foi revelada por imunocitoquímica. Esta barra de escala representa 200 micrômetros. Esta imagem mostra um western blot da expressão do transgene mediada por HSV e da reatividade anti-mGlu2 no córtex frontal de camundongos knockout para mGlu2.

Aqui medimos a imunorreatividade do mGlu2 como monômero. Este histograma mostra que a expressão mediada por vírus do mGlu2, mas não do mGlu2 quimérico na córtex frontal de camundongos knockout para mGlu2, resgata significativamente a resposta de espasmo da cabeça induzida pelo agonista do receptor de serotonina 2a, DOI, alucinógeno. As etapas mais críticas deste experimento são os intervalos entre as injeções virais, a resposta de espasmo da cabeça e o momento em que os camundongos são sacrificados.

Qualquer atraso pode alterar os resultados do experimento ou introduzir ambiguidade nos dados. Após dominada, a cirurgia em camundongo levará aproximadamente 30 minutos para injetar o vírus. O experimento de tremor da cabeça também deve levar aproximadamente 35 minutos por camundongo.

Recomenda-se realizar cirurgias escalonadas, ou seja, operar mais de um camundongo ao mesmo tempo. Dessa forma, é possível manter uma cronologia que permite realizar os experimentos de movimento sacádico da cabeça entre três e quatro dias após a cirurgia, período em que ocorre a expressão máxima do vetor viral. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.