HSV-Mediated expressão do transgene da quiméricos Construções para estudar a função comportamental de GPCR heterómeros em Ratos

O objetivo geral deste método é observar como a transferência de genes mediada por vírus afeta os fenótipos comportamentais que requerem heterodimerização de receptores acoplados à proteína G em modelos de camundongos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neuro e psicofarmacologia. Especificamente, como os receptores acoplados à proteína g interagem uns com os outros em nível molecular.

Ao usar esse método, podemos entender como essa interação afeta o comportamento em modelos de transtornos psiquiátricos, como esquizofrenia e depressão. Usando este método, vamos examinar especificamente a seratonina 2a e o receptor metabotrópico de glutamato 2, ambos os quais demonstraram estar implicados no mecanismo de ação de medicamentos usados para tratar pacientes com esquizofrenia. Comece anestesiando adequadamente o mouse de acordo com os métodos aprovados.

Certifique-se de que um plano cirúrgico de anestesia foi obtido realizando uma pinça do dedo do pé e observando a ausência de resposta. Em seguida, aplique gel oftálmico para proteger os olhos. Prenda o mouse ao quadro estereotáxico, certificando-se de ajustar a inclinação da cabeça para que o crânio fique nivelado e plano.

Aplique iodopovidona no couro cabeludo exposto. Usando um bisturi, faça uma incisão sagital ao longo da linha média do crânio dentro da área raspada exposta. Em seguida, prenda os grampos pureit na pele no local da incisão para garantir que o crânio permaneça exposto.

Aplique peróxido de hidrogênio para dissolver o periósteo e exponha as suturas do crânio. Agora que o bregma e as suturas estão visíveis, certifique-se de ajustar a estrutura estereotáxica para garantir que o crânio esteja nivelado. Alinhe as pontas das agulhas das seringas com bregma e registre as coordenadas de bregma.

Para injetar bilateralmente o córtex frontal, adicione 1,6 mm à coordenada do bregma caudal rostral registrada e 2,6 mm à coordenada do bregma lateral medial registrada. Marque os locais de injeção no crânio e, em seguida, faça pequenos furos nos locais de injeção. Com um aplicador de ponta de algodão, limpe qualquer excesso de sangue ou fragmentos ósseos.

Traga a agulha para a superfície do cérebro e abaixe até a profundidade da coordenada ventral dorsal. Em seguida, injete lentamente o conteúdo da seringa girando o êmbolo da agulha para administrar 0,1 microlitros por minuto por cinco minutos, para uma injeção de 0,5 microlitro. Deixe a seringa permanecer no lugar por cinco minutos.

Após o tempo previsto, remova o animal da estereotaxia, feche a incisão e coloque em uma almofada de aquecimento. Administre analgesia pós-operatória de acordo com o protocolo animal aprovado. Realize testes comportamentais dois a três dias após a injeção estereotáxica de partículas virais.

Habitue os ratos à sala por pelo menos quatro horas antes do início do experimento. Comece dissolvendo o DOI em uma solução salina a 0,9% a dois miligramas por quilograma. Prepare uma gaiola doméstica sem roupa de cama e, usando um tripé, ajuste uma câmera para que ela fique diretamente sobre a gaiola doméstica.

Calibre a câmera para que toda a gaiola doméstica fique no campo de view. Pese o camundongo e injete por via intraperitoneal com a dose apropriada de solução salina a 0,9% ou DOI. Coloque o mouse de volta na gaiola inicial por dez minutos.

Após dez minutos, coloque o mouse no centro da gaiola doméstica vazia e certifique-se de que não haja pontos cegos no campo de visão da câmera. Pressione gravar na câmera de vídeo e saia da sala. Após 30 minutos, pare a gravação e coloque o mouse de volta na gaiola original.

Repita o teste comportamental no próximo mouse. Peça ao revisor os vídeos cego para as condições experimentais. Grave manualmente cada contração da cabeça ao longo do vídeo.

Uma contração da cabeça é definida como um movimento rápido de sacudir a cabeça conduzido por um mouse. Processe os dados conforme descrito na parte escrita do protocolo. Aqui é mostrada uma imagem representativa da expressão do transgene mediado por HSV no córtex frontal.

HSV mGlu2 GFP foi injetado no córtex frontal e a expressão de GFP foi revelada por imunocitoquímica. Esta barra de escala representa 200 mícrons. Esta imagem mostra uma mancha ocidental da expressão transgênica mediada por HSV e reatividade anti-mGlu2 no córtex frontal de camundongos knockout para mGlu2.

Aqui medimos a imunorreatividade de mGlu2 como monômero. Este histograma mostra que a expressão mediada viral de mGlu2, mas não de mGlu2 quimérico no córtex frontal de camundongos knockout para mGlu2, resgata significativamente a resposta de contração da cabeça induzida pelo agonista alucinógeno do receptor seratonina 2a DOI. As etapas mais críticas deste experimento são o tempo entre as injeções virais, a resposta de contração da cabeça e quando os camundongos são sacrificados.

Qualquer atraso pode alterar os resultados do experimento ou introduzir ambiguidade nos dados. Uma vez dominada, a cirurgia do camundongo levará aproximadamente 30 minutos para injetar o vírus. O experimento de contração da cabeça também deve levar aproximadamente 35 minutos por mouse.

Cirurgias escalonadas ou operação em mais de um camundongo por vez são recomendadas. Dessa forma, pode-se manter uma linha do tempo que permite que os experimentos de contração da cabeça sejam feitos nos três a quatro dias após a cirurgia, que é o tempo de pico de expressão da construção viral. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.