Condicional Genetic transsináptica Tracing no Embryonic do cérebro do rato
22 de dezembro de 2014
Capitalizando uma estratégia genética binária, fornecemos um protocolo detalhado para rastreamento de circuitos neurais em camundongos que expressam traçadores transsinápticos complementares após a recombinação mediada por Cre. Como a produção de traçadores específicos da célula é codificada geneticamente, nossa abordagem experimental é adequada para estudar a formação e maturação de circuitos neurais durante o desenvolvimento do cérebro embrionário murino em uma única resolução celular.
O objetivo do experimento a seguir é visualizar o desenvolvimento de circuitos neurais no cérebro embrionário de camundongos usando três sistemas distintos de marcação de células usando um traçador trans-sináptico que viaja bidirecionalmente, um segundo traçador que viaja apenas de forma retrógrada e um terceiro marcador que não viaja da célula-alvo. É possível identificar os neurônios alvo a montante e os neurônios a jusante. Os resultados demonstram que este protocolo experimental pode ser usado para analisar a formação de circuitos neurais no cérebro embrionário de camundongos fêmeas em uma resolução de célula única.
Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência do desenvolvimento, como quando um circuito neural específico é formado e como eles são organizados durante o desenvolvimento embrionário. Este método também pode ser usado para rastrear circuitos neurais em camundongos adultos. Especificamente, ele pode ser utilizado para analisar a atividade sináptica entre neurônios geneticamente identificados e pode ser usado para analisar como diferentes condições experimentais podem modular um circuito neural ao longo do tempo.
Comece com um camundongo grávida recém-sacrificado. Limpe o lado ventral do abdômen com etanol a 70% e, em seguida, faça uma incisão vertical para expor os embriões. Remova a cadeia de embriões e transfira-os para um prato de PBS gelado no prato.
Remova os embriões individuais usando uma pinça embotada. Separe os embriões individuais em solução usando tesouras finas e pinças, removendo o tecido extra no processo quando os embriões estiverem totalmente limpos. Faça uma pequena biópsia de cauda de cada embrião e coloque em um tubo de tampão de lise para coletar DNA para identificação de gênero e genotipagem.
Em seguida, transfira o embrião para um gelado recém-feito, 4% PFA no gelo. Após o processamento de cada embrião, deixe-os incubar no PFA com agitação por pelo menos 1,5 horas, dependendo do tamanho. Quando a incubação estiver completa.
Lave os lenços fixos três vezes com PBS gelado por pelo menos cinco minutos por lavagem. Em seguida, transfira os embriões para uma solução de sacarose a 30%, mantida a quatro graus Celsius. Quando os tecidos estiverem totalmente afundados na solução, prossiga com a criosecção.
Primeiro, comece rotulando um molde criogênico usando um marcador permanente resistente ao álcool. Em seguida, prepare uma pasta de gelo seco picado em 100% de etanol em um balde de gelo usando a pasta e resfrie um copo de vidro de isop pentano por cerca de 10 minutos. Enquanto espera, remova os tecidos da solução de sacarose e limpe o excesso de sacarose com um lenço de laboratório padrão.
Em seguida, transfira o tecido para um molde criogênico pré-rotulado. Com OCT suficiente para cobrir o tecido. Não forme bolhas de ar na OCT, especialmente ao redor do tecido.
Em seguida, oriente o tecido usando uma pinça de entomologia de peso de pena para causar danos mínimos. Congele os moldes criogênicos no banho de iso pentano resfriado sem causar respingos, se necessário. Os moldes congelados podem ser embalados e armazenados a menos 80 graus Celsius para seccionar os moldes.
Corte-os em seções seriais de 14 mícrons de espessura em séries de cinco. Colete cada série de cinco fatias em uma lâmina de vidro super frost plus. Ao preparar a solução para este protocolo, certifique-se de adicionar a interpolação 20 lentamente ao tampão TNT, que deve ser preparado fresco.
Em seguida, lave a solução para cima e para baixo lentamente para misturar. Ao preparar o tampão TNB, adicione o reagente de bloqueio lentamente em pequenos incrementos enquanto mexe. Em seguida, aqueça a solução a 55 graus Celsius em banho-maria.
A solução se tornará leitosa. Agora, para começar a trabalhar nos tecidos, primeiro use um bisturi para remover o excesso de OCT ao redor das seções de tecido. Em seguida, marque os limites de cada seção usando uma caneta de papanicolau.
Deixe as lâminas atingirem a temperatura ambiente. Em seguida, lave-os em temperatura ambiente, um tampão XPBS, três vezes cada lavagem deve durar cinco minutos. Em seguida, extinguir a atividade da peroxidase endógena incubando as lâminas por meia hora em peróxido de hidrogênio a 0,3% em metanol.
Em seguida, faça três lavagens em PBS em temperatura ambiente por cinco minutos por lavagem. Em seguida, incube as lâminas por 10 minutos em PBST para permanenteizar os tecidos. Desta vez, lave as lâminas três vezes com TNT.
Agora, em uma câmara umidificada, bloqueie o tecido em TNB suficiente para cobrir cada lâmina. Deixe o bloco funcionar por meia hora em temperatura ambiente. Não deixe as lâminas secarem.
Depois de drenar o tampão de bloqueio, cubra completamente a lâmina com o anticorpo primário em TNB para ligar o traçador. Incube por duas horas em RT ou durante a noite a quatro graus Celsius. Para remover o anticorpo primário, lave a lâmina com TNT três vezes em temperatura ambiente por cinco minutos por lavagem.
Durante essas lavagens, use um pouco de agitação suave. Em seguida, incube as seções na solução de anticorpos secundários por uma hora. À temperatura ambiente mais tarde, use três lavagens de TNT para remover o anticorpo secundário não ligado.
Em seguida, em uma câmara umidificada, incube os tecidos em uma a 100 peroxidase conjugada de rabanete em TNB por 30 minutos em temperatura ambiente enquanto lava as lâminas em TNT. Após a incubação, fazer uma nova diluição da solução TSA. Agora aplique a diluição TSA recém-feita nos tecidos por exatamente 10 minutos em temperatura ambiente.
O momento preciso da incubação da TSA é crítico. Portanto, não tente processar muitos slides de uma vez em nossas mãos. Até 10 lâminas podem ser manuseadas em uma única etapa.
Lâminas adicionais podem esperar no tampão de lavagem TNT até que sejam processadas após outra rodada de lavagens. Incube os tecidos com um a 500 Alexa piso 5 46 despojado. Tê-lo em conjugado em TNB por 30 minutos.
À temperatura ambiente, remova o conjugado de habitante descascado com mais três banhos de TNT. Em seguida, para coloração nuclear, aplique solução de benza 5% BIS em PBS em temperatura ambiente por 10 minutos, remova a mancha benzo BIS com três lavagens de TNT. Em seguida, monte as lâminas com fluoro Mount G e prossiga com sua análise.
Usando o protocolo descrito, a maturação dos circuitos neurais que regulam o eixo reprodutivo foi analisada em camundongos portadores dos alelos R 26 BIZ e R 26 GTT. A expressão dos transgenes foi ativada por recombinação dependente de credo em neurônios embrionários de kisspeptina no núcleo arqueado usando uma linha condutora de credo específica para kisspeptina em verde e BL em vermelho de um beijo. IC R 26 BIZ.
O camundongo mostra a ativação do BL no KISS IC R 26 GTT A imunofluorescência dupla do camundongo mostra o KISSPEPTIN em verde e o GTT ativado pelo driver Cree em vermelho. Esses e outros diagnósticos demonstraram que os transgenes eram funcionais em embriões experimentais E 18.5. Seus neurônios de pepina no núcleo arqueado já foram encontrados se comunicando com o GNRH.
Os neurônios sem Z foram confinados aos neurônios de kisspeptina que expressam CRE, enquanto BL foi transferido transsinapticamente para neurônios a montante e a jusante. Alguns, mas não todos. Os neurônios GNRH continham bl.
Assim, apenas um subconjunto de neurônios GNRH embrionários está sinapticamente conectado aos neurônios da kisspeptina do núcleo arqueado. Os neurônios GNRH não continham o traçador retrógrado. GTT demonstrando que esses neurônios estão a jusante dos neurônios da kisspeptina.
Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em um dia após este procedimento. Outros métodos, como a imunofluorescência dupla, podem ser utilizados para identificar a natureza bioquímica dos neurônios conectados. Essa técnica deve abrir caminho para pesquisadores no campo da neurociência e biologia do desenvolvimento explorarem a conectividade neural com uma única resolução celular durante o desenvolvimento e em animais adultos.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar a formação e maturação de circuitos neurais em camundongos.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para o rastreamento de circuitos neurais no cérebro de camundongo embrionário utilizando traçadores transsinápticos codificados geneticamente. O método permite a visualização do desenvolvimento de circuitos neurais com resolução em nível de célula única.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Circuitos Neurais
Contexto
- Compreender a formação dos circuitos neurais é fundamental para a neurociência do desenvolvimento.
- Os traçadores transsinápticos permitem o estudo da conectividade neuronal.
- O cérebro de camundongo embrionário serve como modelo para o estudo do desenvolvimento neural.
- A produção específica de traçadores em células permite análises direcionadas.
Objetivo do Estudo
- Visualizar o desenvolvimento de circuitos neurais no cérebro de camundongos embrionários.
- Analisar a organização de circuitos neurais específicos durante o desenvolvimento.
- Fornecer um protocolo aplicável tanto a camundongos embrionários quanto adultos.
Métodos Utilizados
- Utilização de três sistemas distintos de marcação celular.
- Aplicação de um traçador transsináptico bidirecional.
- Uso de um traçador retrógrado e de um marcador não propagável.
- Análise com resolução em nível de célula única de circuitos neurais.
Resultados Principais
- O protocolo identifica com sucesso neurônios ascendentes e descendentes.
- Os resultados demonstram a formação de circuitos neurais no cérebro embrionário de camundongos fêmeas.
- O método pode analisar a atividade sináptica em neurônios geneticamente identificados.
- Permite examinar como as condições experimentais afetam os circuitos neurais ao longo do tempo.
Conclusões
- Este protocolo experimental é eficaz para o estudo do desenvolvimento de circuitos neurais.
- Ele fornece informações sobre o momento e a organização dos circuitos neurais.
- O método é versátil para a análise de circuitos neurais tanto em embriões quanto em adultos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Compreender a formação de circuitos neurais durante o desenvolvimento embrionário fornece subsídios mecanicistas para distúrbios neurodesenvolvimentais e apoia a validação de alvos na descoberta de fármacos para o SNC. Essa abordagem de rastreamento transsináptico geneticamente codificada permite o mapeamento dependente da atividade das conexões sinápticas com resolução de única célula, oferecendo um sistema reprodutível para reduzir os riscos de hipóteses terapêuticas relacionadas à conectividade neural. Ao eliminar a necessidade de injeção estereotáxica, o método aumenta a padronização e a escalabilidade ao longo de diferentes pontos temporais de desenvolvimento e em diferentes contextos genéticos, favorecendo uma preparação consistente dos ensaios para estudos de engajamento de alvo.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da visualização da conectividade sináptica entre populações neuronais geneticamente definidas durante janelas críticas de desenvolvimento.
- Valor Operacional: Oferece um sistema codificado geneticamente e livre de injeções, que garante expressão consistente do traçador e reduz a variabilidade em experimentos de mapeamento de circuitos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas de sinal transsináptico dependentes da atividade que refletem a comunicação sináptica funcional entre neurônios upstream e downstream.
- Valor Operacional: Permite a padronização de ensaios por meio da expressão dependente de Cre e específica de locus a partir do locus ROSA26, possibilitando o preparo reprodutível de tecido neural para análises posteriores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a redução de riscos mecanicistas ao permitir que pesquisadores acompanhem como perturbações genéticas ou farmacológicas afetam a formação de circuitos neurais ao longo do tempo em modelos embrionários relevantes para doenças.
- Valor Operacional: Oferece um fluxo de trabalho compatível com plataformas que pode ser integrado a protocolos de imunofluorescência, genotipagem e imageamento para validação multiparamétrica do engajamento de alvos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método apóia fluxos de trabalho de descoberta precoce ao permitir o mapeamento de circuitos orientado por hipóteses antes da identificação de compostos líderes, com resultados que informam a confiança no alvo e a preparação para triagem fenotípica em programas de neurodesenvolvimento.
- Biologia da Descoberta: Apoia a desmistificação biológica por meio da visualização da formação e maturação de circuitos neurais específicos, como aqueles que regulam o eixo reprodutivo, com resolução em nível de única célula.
- Triagem: Permite a preparação de sistemas neurais padronizados e geneticamente rastreáveis, adequados para avaliar os efeitos de compostos sobre a conectividade sináptica em cérebros embrionários ou adultos.
- Análises: Gera leituras quantitativas baseadas em fluorescência (por exemplo, transferência de sinal BL, GTT) que permitem comparar a atividade sináptica entre diferentes condições, genótipos ou estágios de desenvolvimento.
- Pesquisa Translacional: Conecta a formação de circuitos embrionários à função pós-natal, permitindo a análise longitudinal de como perturbações precoces no desenvolvimento influenciam a conectividade neural na vida adulta.
- Reutilização Empresarial: As linhagens duplas de inserção no gene ROSA26 representam uma plataforma genética reutilizável, aplicável a múltiplos alvos do SNC e modelos de doenças, sem necessidade de intervenções cirúrgicas repetidas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao fornecer evidência direta, dependente da atividade, de conectividade sináptica entre populações de neurônios geneticamente definidas.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade e reduz a variabilidade técnica por meio de expressão dependente de Cre e controlada por locus, eliminando inconsistências associadas a injeções.
- Valor Estratégico: Aprimora a tomada de decisões de avanço ou interrupção na seleção de alvos do SNC ao permitir a visualização precoce dos efeitos em nível de circuito decorrentes de modulação genética ou farmacológica.
- Impacto no Portfólio: Apoia o avanço ajustado ao risco ao gerar dados mecanicistas sobre a formação de circuitos neurais, orientando a priorização de alvos em indicações neurodesenvolvimentais e psiquiátricas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em embriologia de camundongo, genotipagem e microscopia de fluorescência para o manejo adequado de embriões, seccionamento e detecção de sinal.
- Depende da disponibilidade de linhagens acionadoras de Cre e sistemas repórteres fluorescentes para marcação celular específica e validação multimodal.
- Necessita de protocolos padronizados de fixação, criosseccionamento e imuno-histoquímica para preservar o sinal do traçador e garantir qualidade reprodutível dos cortes.
- A adaptação entre sistemas modelo depende da conservação da funcionalidade do traçador transsináptico e da especificidade do promotor em espécies não murinas.
- As limitações práticas incluem a dependência da atividade sináptica para a transferência do traçador, o que pode afetar a sensibilidade em circuitos com baixa atividade ou imaturos.
