Name: Condicional Genetic transsináptica Tracing no Embryonic do cérebro do rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Aprenda a rastrear circuitos neurais no cérebro embrionário de camundongo usando traçadores transsinápticos geneticamente codificados. Este método permite visualizar o desenvolvimento de circuitos neurais com resolução de célula única.

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Agradecemos a Michael Candlish pelos comentários críticos sobre o manuscrito. Este projeto foi apoiado pelas concessões da Deutsche Forschungsgemeinschaft BO1743/6 e SFB/TRR 152 P11 e Z02 a Ulrich Boehm.

NOTA: Ética Declaração: os procedimentos de indivíduos animais foram aprovados pelo comitê de bem-estar dos animais, da Universidade de Hamburgo e da Universidade de Saarland. 1. Preparação e fixação de tecido embrionário <ol><li> Organizar todos os equipamentos necessários para dissecar os embriões e preparar soluções para posterior fixação do tecido antes de sacrificar os animais. NOTA: Sempre preparar uma nova solução de 4% de paraformaldeído (PFA) (PFA a 4% em 0,1 M de solução salina de fosfato tamponada (PBS), pH ajustado a 7,4). </li><li> Eutanásia cronometrado rato fêmea grávida de um procedimento eticamente aprovado. </li><li> Transferir o rato sobre uma plataforma. Molhe o lado ventral do abdômen com etanol 70% e fazer uma incisão vertical usando uma tesoura afiada para expor a cavidade abdominal. </li><li> Identificar a cadeia embrionário e retire-o com cuidado, usando uma pinça sem corte e colocá-lo em PBS gelado. </li><li> Remover os embriões individuaisa cadeia embrionárias usando uma tesoura fina e fórceps. Remover tecido extra em torno dos embriões e lave-os em PBS gelado. </li><li> Pegue uma pequena biópsia de cauda (antes da transferência do embrião para PFA) e incubar-lo em tampão de lise da cauda para a identificação de gênero e alelo tracer genotipagem PCR. </li><li> Iniciar a partir do embrião no lado mais lateral e transferir cada embrião separadamente para um tubo arrefecido com gelo contendo PFA a 4% em gelo num agitador. </li><li> Embeber os embriões com a idade de E13.5 ou menos durante 1,5 horas em gelo com agitação constante. Mergulhe os embriões na E14.5 idade e E15.5 durante 2,5 horas em gelo com agitação constante. </li><li> Para E16.5 embriões idade ou mais, decapitar e remova a pele exterior antes de mergulhar a cabeça em solução PFA. Chefes de embriões E16.5 pode ser embebido durante 4,5 horas em gelo com agitação constante. </li><li> Após a fixação adequada, lavar os embriões três vezes com PBS gelado. Transferir os embriões em sacarose a 30% em solução de PBS a 4 ° C até se afundempara a parte inferior. </li></ol> 2. Congelamento <ol><li> Organizar todos os materiais necessários antes de iniciar o processo de congelamento: crio-mofo, crio-luvas, pinças pluma entomologia, caneta marcador e corte ideal compostos temperatura (OCT) </li><li> Rotular o crio-molde com um marcador permanente resistente ao álcool (mencionar a orientação do tecido, da data e do genótipo). Prepare uma lama de gelo seco moído e 100% de etanol em um balde de gelo. Coloque um copo de vidro no interior contendo isopentano. Aguarde 10 minutos para o isopentano para esfriar. </li><li> Enquanto isso, remover o tecido a partir da solução de sacarose, limpe o excesso de sacarose em torno do tecido usando lenços de laboratório. Transferir o tecido em um pré-rotulados crio-molde com suficiente OCT para cobrir o tecido. Evite as bolhas de ar no PTU; especialmente em torno do tecido. </li><li> Orientar o tecido em outubro com a pinça entomologia pluma para evitar danos aos tecidos. Comece congelamento transferindo o crio-mold para o banho isopentano pré-resfriada. Não salpique isopentano na outubro, pois não irá congelar corretamente. Enrole as amostras em folha de alumínio e armazenar a -80 ° C. </li></ol> 3. cryosectioning <ol><li> Cortar 14 mm cortes seriados finos em série de cinco usando um criostato e recolher em lâminas de vidro SuperFrost® Plus para análise de imunofluorescência (IF). Armazenar as lâminas a -80 ° C até ser utilizado. </li></ol> 4. Usando a visualização Tracer (TSA) Protocolo Tyramide Signal Amplification <ol><li> Prepare os tampões e reagentes necessários para a coloração. Sempre recentemente preparar o tampão Tris-NaCl-Tween (TNT) no dia da utilização. <ol><li> Preparar tampão TNT usando 100 ml de 1 M de Tris-HCl pH 7,5, 30 ml de NaCl 5 M e ddH2O até ao volume final de 1 L. Adicionar 500 ul de Tween 20 utilizando uma pipeta de 1 ml. Adicionar lentamente o Tween 20 e lave a pipeta para cima e para baixo várias vezes para assegurar que todo o Tween 20 é emsolução. </li><li> Prepare Tris-NaCl-tampão de bloqueio (TNB) usando 100 ml de 1 M de Tris-HCl pH 7,5, 30 ml de NaCl 5 M e ddH2O até ao volume final de 1 L. Adicionar 5 g de reagente bloqueador (fornecida com o Kit) lentamente em pequenos incrementos para o buffer enquanto se agitava. Aquece-se a solução gradualmente até 55 ° C com agitação contínua, para dissolver completamente o reagente de bloqueio (o que não deveria demorar mais de 30-60 minutos). Para atingir o aquecimento homogéneo utilizar um banho de água a 55 ° C. A solução aparece leitoso. Levar a solução à temperatura ambiente antes de usar. Alíquotas e armazenar a -20 ° C para armazenamento a longo prazo. </li><li> Reconstituir biotina reagente de tiramida (fornecido com o kit) em Biologia Molecular / DMSO de grau HPLC. Consoante o kit é utilizado a quantidade apropriada de DMSO pode variar. Guardar a solução estoque a 4 ° C. NOTA: Os cortes de animais heterozigotos para os respectivos alelos Cre e R26 pode ser usado para análise de circuitos. Use sexões de ninhada que transportam uma Cre ou um alelo R26, respectivamente, como controles negativos. Trate lâminas de controlo negativas exatamente como slides de animais heterozigotos duplas. Além disso, incluem uma lâmina de controlo de um animal heterozigoto duplo, mas deixar de fora o reagente TSA (controlo sem amplificação). </li></ol></li><li> Usando um bisturi afiado fresco remover o excesso de outubro em torno das secções de tecido e marcar o limite em torno das secções com uma caneta PAP. </li><li> Secam-se as lâminas durante 2-3 minutos à temperatura ambiente (TA). Lavar as lâminas em RT 3x com TNT para 5 min cada. Incubar as lâminas à temperatura ambiente durante 30 min em 0,3% de H 2 O 2 em solução de metanol arrefecido em gelo para extinguir a actividade da peroxidase endógena. </li><li> Lavar 3x com PBS durante 5 minutos cada à temperatura ambiente. Incubar durante 10 min em 0,5% de Triton X-100 em PBS durante a permeabilização dos tecidos. Lavar as lâminas em RT 3x com TNT para 5 min cada. </li><li> Bloco com TNB (solução de bloqueio, 200-300 mL por lâmina) para 30min à temperatura ambiente numa câmara humidificada. Certifique-se de todas as seções são completamente cobertas por TNB. Não deixe que as lâminas secar entre as etapas. </li><li> Drenar o excesso de tampão de bloqueio e aplicar o anti-soro primário que reconhece o marcador (1: 1000 de cabra anti-WGA por BL, 1: 15.000 de coelho anti-GFP para GTT) diluído em TNB durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. Certifique-se de usar um volume suficiente para cobrir totalmente a secção de tecido (200-300 mL por lâmina). NOTA: As diluições anti-soros primários recomendadas aqui pode ter de ser ajustada. </li><li> Lavar as lâminas em RT 3x com TNT para 5 min cada um com agitação. </li><li> Incubar as secções com soro secundário biotinilado reconhecem o anfitrião do primeiro anti-soro (1: 500 cavalo IgG anti-cabra para anti-WGA, 1: 5.000 de cabra anti-IgG de coelho para o anti-GFP em TNB durante 1 hora a RT). </li><li> Lavar 3x com TNT à temperatura ambiente durante 5 min cada, com agitação. Incubar em 1: 100 estreptavidina (SA) conjugado a peroxidase de rábano (SA-HRP, wi fornecidath o kit) em TNB durante 30 min à temperatura ambiente numa câmara humidificada. Lavar as lâminas em RT 3x com TNT para 5 min cada. Enquanto isso descongelar a TSA. </li><li> Diluir 1:50 em TSA TSA diluente amplificação (fornecido com o kit, use o kit TSA para a visualização de BL e o kit de TSA + por GTT). Incubam-se as secções de tecido em TSA diluído para precisamente 10 min à temperatura ambiente. Diluir TSA imediatamente antes da utilização, de preferência durante a etapa de lavagem anterior, não use qualquer restante reagente TSA diluída para experiências futuras; elaborar sempre fresco. </li><li> Lavar as lâminas em RT 3x com TNT para 5 min cada um com agitação. Incubar com 1: 500 de Alexa Fluor ® 546 em TNB estreptavidina conjugada durante 30 min à TA. Lavar as lâminas em RT 3x com TNT para 5 min cada um com agitação. </li><li> Incubar durante 10 min em solução de bisbenzimida 5% em PBS à temperatura ambiente durante a coloração nuclear. Lavar as lâminas em RT 3x com TNT para 5 min cada um com agitação. Montar com Fluromount G e realizar epifluorescência ou microscopia confocal. <em&gt; Solução de problemas: A eficácia da transferência do marcador vai depender do nível do locus ROSA26 nas células produtoras (determinado pelo controlador de linha de Cre utilizado) e expressão do circuito neural analisados ​​(por exemplo, número de neurónios que produzem o marcador, de convergência, etc.). Por conseguinte, as diluições de anti-soros primários recomendadas aqui podem ter de ser ajustados para impedir sinal baixo ou em excesso. Fundo devem ser sempre analisados ​​utilizando lâminas de controlo adequados (veja acima). </li></ol> 5. τlacZ Coloração para Seções embrionárias <ol><li> Prepare os tampões e reagentes necessários para a coloração. Sempre recém preparar o LacZ tampão C antes do uso. <ol><li> Prepare 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (X-gal) de solução-mãe (40 mg / ml) por adição de 40 g de X-gal a 1 ml de 70% de dimetilformamida (DMF). Cubra com folha de alumínio e armazenar a -20 ° C para armazenamento a longo prazo. </li><li> Prepare nitro blue tetrazolium (NBT) stock solução (50 mg / ml) por adição de 50 g de NBT a 1 ml de 70% de DMF. Cubra com folha de alumínio e armazenar a -20 ° C para armazenamento a longo prazo. </li><li> Prepare LacZ fixador utilizando 80 ul de 25% de glutaraldeído, 5 ml de 4% de PFA, 20 ul de 1 M de MgCl2, 100 ul de 500 mM de EGTA, 1 ml de 1 M de tampão fosfato pH 7,4 e ddH2O até ao final, volume de 10 ml. </li><li> Prepare LacZ tampão A com 1 ml de 1 M de MgCl2, 5 ml de 500 mM de EGTA, 50 ml de 1 M de tampão de fosfato de pH 7,4 e ddH2O até um volume final de 500 ml. </li><li> Preparar tampão de LacZ B com 1 ml de solução 1 M de MgCl2, 5 ml de 500 mM de EGTA, 5 ml de 1% de desoxicolato de sódio, 100 ml de 10% de NP-40, 50 ml de tampão de fosfato 1 M a pH 7,4 e ddH2O até um volume final de 500 ml. </li><li> Preparar tampão de LacZ C por adição de 10 ul de solução de estoque de NBT e 12,5 ml de solução de estoque de X-gal a 1 ml de tampão B. LacZ fazem fresco imediatamente antes da utilização e cobrir com folha de alumínio. </li></ol&gt; </li><li> Seque as lâminas a RT pelo menos por 10-15 min (entretanto preparar os slides com uma caneta PAP). </li><li> Fixar a secção com LacZ fixador durante 2 min à temperatura ambiente numa câmara humidificada fumos dentro de um capuz-química. Lavar 3 vezes com PBS suplementado com 2 mM de MgCl2. </li><li> Lavar as lâminas com tampão LacZ A. Lavar as lâminas com LacZ tampão A 3 vezes por 10 min cada, a RT. Lavar duas vezes com tampão de LacZ B durante 5 minutos cada. Incubar as lâminas em tampão LacZ C a 30-37 ° C durante 6 horas ou durante a noite numa câmara humidificada. NOTA: Adicionar um volume suficiente de tampão LacZ C; slides não devem secar durante a incubação. </li><li> Após incubação adequada lavar as lâminas com PBS suplementado com 2 mM de MgCl2. Enxágüe seções brevemente com DDH 2 O. Lamela com glicina gelatina de Mayer. Apropriado para um microscópio de luz equipado com um contraste de interferência diferencial (DIC) de imagem set-up. </li></ol> 6. Gender e Tracer Genotipagem <ol><li> Preparar tampão de lise cauda usando 1 ml de 1 M de Tris-HCl pH 8,5, 100 uL de EGTA 500 ​​mM, 200 ul de SDS a 10%, 400 ul de NaCl 5 M e ddH2O para obter um volume final de 10 ml. </li><li> Adicionar 500 ul de tampão de lise cauda para cada tubo Eppendorf contendo uma biopsia da cauda. Adicionar proteinase K para uma concentração final de 100 mg / ml. Incubar durante a noite num agitador a 55 ° C. </li><li> Centrifugar as amostras a 17.000 xg durante 10 min à TA. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga. Adicionar 500 mL de isopropanol ao sobrenadante. Misturar durante pelo menos 5 min invertendo os tubos para cima e para baixo. </li><li> Girar numa centrífuga a 17.000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Retirar o sobrenadante. Adicionar 200 ul de etanol a 70%. Agita-se durante pelo menos 5 min. </li><li> Centrifuga-se a 17000 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante com uma Pipetman (não deitar fora). Seca-se o granulado em uma câmara quente (37 ° C) durante 15-30 min. </li><li> Ressuspender o sedimento em 100 ulde baixo TE pH 8,0 ou água usando dicas wide-bore filtrados. Colocar em 55 ° C durante 1 hora e a 37 ° C durante a noite para dissolução adequada. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Use 1 ul de DNA para a reacção de PCR (mistura de reacção de 50 ul contendo 1 uL de ADN da cauda, ​​de 2,5 mL de DMSO, a 10 pM de cada iniciador, 25 uM de cada dNTP, e 1M de betaína). Iniciadores de PCR para genotipagem e identificação de gênero estão listados na tabela de Materiais. </li></ol>

<ol><li>Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+techniques+for+tracing+pathways+in+the+central+nervous+system+of+developing+and+adult+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals.</a> Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).</li>
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<li>Seminara, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GPR54+gene+as+a+regulator+of+puberty%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">The GPR54 gene as a regulator of puberty.</a> N. Engl. J. Med. 349, 1614-1627 (2003).</li>
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<li>Semaan, S. J., Kauffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+on+the+epigenetic+and+transcriptional+regulation+of+the+Kiss1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts on the epigenetic and transcriptional regulation of the Kiss1 gene.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 31, 452-462 (2013).</li>
<li>Feil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-activated+site-specific+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ligand-activated site-specific recombination in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10887-10890 (1996).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesses declarado.

Expressando traçadores transsináptica como transgenes para rastrear os circuitos neurais das populações neuronais geneticamente definidos tem várias vantagens em comparação com a injeção estereotáxica de marcadores ou vírus neurotopic. Em primeiro lugar, o marcador é produzido como uma proteína endógena e, por conseguinte, não provocam qualquer resposta imune e uma via neural selectiva pode ser analisada em diferentes animais com elevada reprodutibilidade. Em segundo lugar, porque este é um método não-invasivo que pode ...

Rastreamento de trajeto anatômico é uma das ferramentas mais utilizadas para decifrar a relação entre cérebro e comportamento 1. Avanço nas tecnologias de rastreamento de circuitos neurais concedeu neurocientistas com a capacidade de rastrear circuitos neurais a partir de populações de neurônios geneticamente identificadas em camundongos 2. Apesar desses avanços técnicos que continua sendo um desafio para desvendar a formação de circuitos neurais especialmente durante a maturação embrionária. Isto é porque a maioria dos métodos de rastreio desenvolvidos até à data baseiam-se a injecção estereotáxica de marcadores transsináptica ou vírus neurotrópico geneticamente modificados (Figura 1) 2,3. Embora essas técnicas obter uma resolução espacial e temporal da conectividade, várias limitações inerentes, tais como injecções traçadores tecnicamente difíceis para o desenvolvimento do cérebro, a reprodutibilidade do local da injecção, inflamação potencial no local da injecção e mais importantly citotoxicidade causada por vírus neurotrópicas limitar a sua utilização 4. Um método alternativo é a de expressar os transgenes marcadores transsináptica como em murganhos geneticamente modificados. Temos recentemente modificado esta técnica e desenvolveu um sistema binário transsináptica genética rastreamento para mapear os circuitos neurais de qualquer população neuronal geneticamente identificado 5. A nossa estratégia experimental baseia-se em duas novas estirpes knock-no rato, que expressam a lectina ou bidirecional cevada traçador (BL) 6 ou o traçador retrógrado fragmento C da toxina do tétano fundido a GFP (GTT) a partir da 7 ROSA 26 lócus após mediada por Cre recombinação. Aqui usamos estas linhagens de camundongos para expressar seletivamente BL e GTT em neurônios que produzem kisspeptin, um neuropeptídeo que está implicado na regulação da maturação do eixo reprodutivo 8,9. Nós demonstramos que esta técnica é adequado para a visualização do desenvolvimento e maturação de ósculocircuitos neurais peptina durante o desenvolvimento embrionário do cérebro do rato fêmea 5. Estratégia para a criação O os R26-GFP-TTC (GTT) linhas traçadores R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) e são knock-in cepas 5 que carregam alelos ROSA26 recombinantes. O R26-BIZ e os alelos R26-GTT são transcricionalmente silencioso devido à presença de um sinal de paragem da transcrição forte, que é flanqueado por dois sítios loxP 5. A expressão do transgene e BIZ GTT é activado por remoção mediada por Cre do sinal de paragem da transcrição. Os alelos-R26 e R26-BIZ GTT pode ser usado de forma independente através da simples cruzamento com uma linha de condutor Cre. Para os animais de análise heterozigótica para os respectivos alelos Cre e R26 pode ser usado. Da mesma ninhada que transportam uma Cre ou um alelo R26, respectivamente, devem ser utilizadas como controlos. Em alternativa, também é possível gerar triple knock-nos animais com os alelos Cre, R26 e R26-BIZ-GTT, porém isso vai exigir uma cruz adicional.

<table><tbody><tr><td>Bisbenzimida (corante Hoechst 33258)</td><td>Sigma</td><td>14530-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>32205-1L</td><td></td></tr><tr><td>Molde criogênico (Peel-a-way)</td><td>Polyscience Inc.</td><td>18646A-1</td><td>22 x 22 x 20mm</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Formamida (DMF)</td> <td>VWR Produtos químicos</td><td>23470,293</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ROTH</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído</td><td>Sigma</td><td>G5882-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>Sigma</td><td>34988-7</td><td></td></tr><tr><td>gelatina</td><td>Merck</td><td>1092420100</td><td></td></tr> do magnésio <tr><td>Sigma</td><td>M32631-2.5L</td><td></td>do<td>isopentano (2-butano metílico</td></tr>) <tr><td></td><td>Sigma</td><td>494437-1L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ROTH</td><td>HN00.2</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Sigma</td><td>298-83-9</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 substituto</td><td>Fluka</td><td>743.85</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Leica</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>caneta PAP</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Parafarmaldeído</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma</td><td>D6750-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas Superfrost</td><td>Kit Thermo Scientific</td><td>FT4981GLPLUS</td><td></td></tr><tr><td>TSA</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL700</td><td></td></tr><tr><td>TSA plus kit</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL749A001KT</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>ROTH</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>ROTH</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>ROTH</td><td>2315.1</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de luz equipado com imagem DIC</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 equipado com o software</td><td></td>Axio Vision</tr><tr><td>Microscópio de fluroscência</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 equipado com o software</td><td></td>Axio Vision</tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>PS6</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-WGA (reconhece BL)</td><td>Vector Laboatários</td><td>AS-2024</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylayted cavalo anti-cabra IgG</td><td>Vector Laboatories</td><td>BA-9500</td><td></td></tr> Cabra <tr><td>biotinilada anti-coelho IgG</td><td>Vector Laboatories</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Coelho anti-GFP (reconhece GTT)</td> <td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Coelho anti-GnRH</td><td>Affinity Bio Reagente</td><td>PA1-121</td><td></td></tr><tr><td>Dylight488-burro anti-coelho IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>SA5-10038</td><td></td></tr><tr><td>SA-Alexa Fluor 546</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Primers</td></tr><tr><td>BL Fwd (para genotipagem BIZ)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>ATGAAGATGAGCACCAGGGC</td></tr><tr><td>BL Rev (para genotipagem BIZ)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCCCTCGCCGCAGAACTC</td></tr><tr><td>Cre Fwd (para genotipagem Cre)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG</td></tr><tr><td>Cre Rev (para genotipagem de Cre)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC</td></tr><tr><td>TTC Fwd (para genotipagem de GTT)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT</td></tr><tr><td>TTC Rev (para genotipagem de GTT)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA</td></tr><tr><td>XY Fwd (para genotipagem de gênero)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>TGAAGCTTTTGGCTTTGA</td></tr><tr><td>XY Rev (para genotipagem de gênero)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CCGCTGCCAAATTCTTTG</td></tr><tr><td>ROSA26 Fwd</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td></tr><tr><td>ROSA26 Rev</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GCAGATGGAGCGGGAGAAAT</td></tr><tr><td>SA Rev</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td></tr></tbody></table>

condicional genetic transsináptica tracing no embryonic do cérebro do rato

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

O traçado anatômico do caminho é de fundamental importância para decifrar a relação entre cérebro e comportamento. Desvendar a formação de circuitos neurais durante a maturação embrionária do cérebro, no entanto, é tecnicamente desafiador porque a maioria dos métodos de rastreamento transsináptico desenvolvidos até o momento depende da injeção de traçador estereotáxico. Para superar esse problema, desenvolvemos uma estratégia genética binária para rastreamento transsináptico genético condicional no cérebro de camundongos. Para esse fim, geramos duas cepas complementares de camundongos knock-in para expressar seletivamente o traçador transsináptico bidirecional lectina de cevada (BL) e o traçador transsináptico retrógrado Toxina tetânica fragmento C do locus ROSA26 após recombinação mediada por Cre. A produção de traçadores específicos para células nesses camundongos é geneticamente codificada e não depende da injeção mecânica de traçadores. Portanto, nossa abordagem experimental é adequada para estudar a formação de circuitos neurais no cérebro murino embrionário. Além disso, como a transferência de traçadores entre sinapses depende da atividade sináptica, essas cepas de camundongos podem ser usadas para analisar a comunicação entre populações neuronais geneticamente definidas durante o desenvolvimento do cérebro em uma única resolução celular. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para rastreamento transsináptico em embriões de camundongos usando os novos alelos recombinantes ROSA26. Utilizamos esta técnica experimental para delinear o circuito neural subjacente à maturação do eixo reprodutivo no cérebro de camundongos fêmeas em desenvolvimento.

Esta seção apresenta os resultados representativos que podem ser obtidos a trabalhar com o R26-BIZ (B L- I RES-τlac Z) e o R26-GTT (G FP- TT C) alelos. Aqui usamos o R26-BIZ e os alelos R26-GTT para analisar a maturação dos circuitos neurais que regulam o eixo reprodutivo. Reprodução em vertebrados está centralmente controlada por um pequeno subconjunto de neurônios no hipotálamo, que secretam hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH). Kisspeptina, um pot...

Capitalizando uma estratégia genética binária, fornecemos um protocolo detalhado para rastreamento de circuitos neurais em camundongos que expressam traçadores transsinápticos complementares após a recombinação mediada por Cre. Como a produção de traçadores específicos da célula é codificada geneticamente, nossa abordagem experimental é adequada para estudar a formação e maturação de circuitos neurais durante o desenvolvimento do cérebro embrionário murino em uma única resolução celular.

Condicional Genetic transsináptica Tracing no Embryonic do cérebro do rato

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

O objetivo do experimento a seguir é visualizar o desenvolvimento de circuitos neurais no cérebro de camundongo embrionário utilizando três sistemas distintos de marcação celular, com um traçador transsináptico que se desloca bidirecionalmente, um segundo traçador que se move apenas de forma retrógrada e um terceiro marcador que não se desloca a partir da célula-alvo. É possível identificar o neurônio-alvo, neurônios ascendentes e neurônios descendentes. Os resultados demonstram que este protocolo experimental pode ser utilizado para analisar a formação de circuitos neurais no cérebro embrionário de camundongo fêmea com resolução de única célula.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da neurociência do desenvolvimento, como quando determinados circuitos neurais são formados e como são organizados durante o desenvolvimento embrionário. Este método também pode ser utilizado para rastrear circuitos neurais em camundongos adultos. Especificamente, pode ser empregado para analisar a atividade sináptica entre neurônios geneticamente identificados, e pode ser usado para analisar como diferentes condições experimentais podem modular um circuito neural ao longo do tempo.Inicie com um camundongo grávido recém-eutanasiado. Limpe o lado ventral do abdômen com etanol 70%, e então faça uma incisão vertical para expor os embriões. Remova a cadeia de embriões e transfira-os para um recipiente com PBS gelado no prato.Remova os embriões individuais utilizando pin&ccedil;as rombas. Separe os embri&otilde;es individuais em solu&ccedil;&atilde;o utilizando tesoura fina e pin&ccedil;as, removendo o tecido extra no processo, quando os embri&otilde;es estiverem completamente limpos. Colete uma pequena bi&oacute;psia da cauda de cada embri&atilde;o e coloque em um tubo com tampo de lise para coletar o DNA para identifica&ccedil;&atilde;o do sexo e genotipagem.Em seguida, transfira o embrião para uma solução recém-preparada e gelada de PFA a 4% em gelo. Após processar cada embrião, deixe-os incubar no PFA com agitação por pelo menos 1,5 horas, dependendo do seu tamanho. Quando a incubação estiver concluída.Lave os tecidos fixados três vezes com PBS gelado por pelo menos cinco minutos a cada lavagem. Em seguida, transfira os embriões para uma solução de sacarose a 30%, mantida a quatro graus Celsius. Quando os tecidos estiverem completamente submersos na solução, prossiga com a criosseção.Primeiro, comece rotulando um molde criogênico usando uma caneta permanente resistente ao álcool. Em seguida, prepare uma pasta de gelo seco triturado em Etanol 100% em um balde de gelo, utilizando a pasta para resfriar um béquer de vidro contendo isopentano por cerca de 10 minutos. Enquanto espera, remova os tecidos da solução de sacarose e limpe o excesso de sacarose com um lenço laboratorial comum.Em seguida, transfira o tecido para um molde criogênico previamente rotulado. Com quantidade suficiente de OCT para cobrir o tecido. Não forme bolhas de ar no OCT, especialmente ao redor do tecido.Em seguida, oriente o tecido utilizando pin&ccedil;as entomol&oacute;gicas de peso leve para causar danos m&iacute;nimos. Congele as f&ocirc;rmas de criomicrotomia no banho de iso-pentano resfriado, sem provocar respingos, se necess&aacute;rio. As f&ocirc;rmas congeladas podem ser embrulhadas e armazenadas a menos 80 graus c&eacute;lsius para o corte das f&ocirc;rmas.Corte-os em seções seriadas de 14 mícrons de espessura em séries de cinco. Colete cada série de cinco cortes em uma lâmina de vidro super frost plus. Ao preparar a solução para este protocolo, certifique-se de adicionar o tween 20 lentamente ao tampão TNT, que deve ser preparado na hora.Em seguida, movimente a solução para cima e para baixo lentamente para misturar. Ao preparar o tampão TNB, adicione lentamente o reagente bloqueador em pequenas quantidades enquanto agita. Em seguida, aqueça a solução a 55 graus Celsius utilizando um banho-maria.A solução ficará turva. Agora, para começar a trabalhar com os tecidos, utilize primeiro um bisturi para remover o excesso de OCT ao redor das seções de tecido. Em seguida, marque os limites de cada seção usando uma caneta pap.Deixe as lâminas atingirem a temperatura ambiente. Em seguida, lave-as em tampão XPBS a temperatura ambiente, três vezes, sendo cada lavagem de cinco minutos de duração. A seguir, inative a atividade de peroxidase endógena incubando as lâminas por meia hora em gelo com peróxido de hidrogênio a 0,3% em metanol.A seguir, realize três lavagens em PBS à temperatura ambiente, com cinco minutos cada lavagem. Em seguida, incube as lâminas por 10 minutos em PBST para permeabilizar os tecidos. Nesta etapa, lave as lâminas três vezes com TNT.Agora, em uma câmara umidificada, bloqueie o tecido com quantidade suficiente de TNB para cobrir cada lâmina. Deixe o bloqueio agir por meia hora à temperatura ambiente. Não permita que as lâminas sequem.Após drenar completamente o tamp&atilde;o de bloqueio, cubra totalmente a l&acirc;mina com o anticorpo prim&aacute;rio em TNB para ligar o marcador. Incube por duas horas &agrave; temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Para remover o anticorpo prim&aacute;rio, lave a l&acirc;mina com TNT tr&ecirc;s vezes &agrave; temperatura ambiente, durante cinco minutos por lavagem.Durante essas lavagens, utilize uma agitação suave. Em seguida, incube as seções na solução de anticorpo secundário por uma hora. Posteriormente, à temperatura ambiente, utilize três lavagens com TNT para remover o anticorpo secundário não ligado.Em seguida, em uma câmara umidificada, incubar os tecidos em uma a 100 diluições de heparina desnudada conjugada à peroxidase de rábano-forrageiro em TNB por 30 minutos à temperatura ambiente, enquanto lava as lâminas em TNT. Após a incubação, preparar uma diluição fresca da solução TSA. Aplicar então a diluição recém-preparada de TSA aos tecidos por exatos 10 minutos à temperatura ambiente.O tempo exato de incubação com o TSA é crítico. Portanto, não tente processar muitos lâminas de uma vez em suas mãos. Até 10 lâminas podem ser manipuladas em uma única etapa.Lâminas adicionais podem permanecer no tampão de lavagem TNT até serem processadas após outra rodada de lavagens. Incube os tecidos com um conjugado Alexa Fluor 546 diluído em TNB na proporção de 1:500 por 30 minutos.À temperatura ambiente, remova o conjugado do habitante destacado com mais três banhos de TNT. Em seguida, para coloração nuclear, aplique solução de benzol a 5% em BIS no PBS à temperatura ambiente por 10 minutos, removendo a coloração de benzol com BIS por meio de três lavagens com TNT. Em seguida, monte as lâminas com Fluoro Mount G e prossiga com sua análise.Utilizando o protocolo descrito, analisou-se a maturação dos circuitos neurais que regulam o eixo reprodutivo em camundongos portadores dos alelos R 26 BIZ e R 26 GTT. A expressão dos transgenes foi ativada por recombinação dependente da cre em neurônios embrionários de kisspeptina no núcleo arqueado, utilizando uma linhagem específica de driver da cre para kisspeptina, e dupla imunofluorescência para kisspeptina em verde e BL em vermelho a partir de um kiss. IC R 26 BIZ.O camundongo mostra ativação do BL no camundongo KISS IC R 26 GTT. A dupla imunofluorescência mostra KISSPEPTINA em verde e GTT ativada pelo driver Cree em vermelho. Esses e outros diagnósticos demonstraram que os transgenes estavam funcionais em embriões experimentais E 18,5. Os neurônios pepin no núcleo arqueado já foram encontrados comunicando-se com GNRH.Os neurônios que não possuíam Z estavam restritos aos neurônios produtores de kisspeptina que expressavam CRE, enquanto BL foi transferido transsinapticamente para os neurônios a montante e a jusante. Alguns, mas não todos, neurônios GNRH continham bl.Assim, apenas um subconjunto de neurônios GNRH embrionários está conectado sinapticamente aos neurônios de kisspeptina do núcleo arqueado. Os neurônios GNRH não continham o traçador retrógrado. TOT demonstrando que esses neurônios estão a jusante dos neurônios de kisspeptina.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em um dia seguindo este procedimento. Outros métodos, como a imunofluorescência dupla, podem ser utilizados para identificar a natureza bioquímica dos neurônios conectados. Esta técnica deverá abrir caminho para pesquisadores na área de neurociência e biologia do desenvolvimento explorarem a conectividade neural com resolução de única célula, tanto durante o desenvolvimento quanto em animais adultos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como visualizar a formação e a maturação de circuitos neurais em camundongos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando<em&gt; Em Utero</em&gt; Electroporação

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Imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais em fatias de cérebro de camundongo embrionário

Aprenda a rastrear circuitos neurais no cérebro embrionário de camundongo usando traçadores transsinápticos geneticamente codificados. Este método permite visualizar o desenvolvimento de circuitos neurais com resolução de célula única.

Condicional Genetic transsináptica Tracing no Embryonic do cérebro do rato

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