Desenvolvimento de um In Vitro Ensaio para avaliar contrátil Função de células mesenquimais que a transição epitelial-mesenquimal Sofreu

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a contratilidade das células mesenquimais que sofreram transição epitelial mesenquimal induzida por citocinas inflamatórias in vitro, ou EMT. Este mesenquimal é uma variação da função celular básica após EMT induzida por respostas imunes inflamatórias, como durante fibrose pulmonar idiopática ou remodelação das vias aéreas na asma grave. As principais vantagens desta técnica são que ela não requer dispositivos específicos e que demonstra um alto teor de demontrating o procedimento será Hideyuki Takeshima e Kosuke Makita alunos de pós-graduação do meu laboratório.

Comece lavando uma cultura de células epiteliais pulmonares humanas A-549 com cinco a dez mililitros de PBS. Em seguida, separe as células aderentes com dois mililitros de tripsina-EDTA a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono. Após três minutos, transferir a suspensão celular para tubos cónicos contendo meio de cultura celular e centrifugar as células numa centrífuga.

Ressuspender os sedimentos em dois mililitros de meio de cultura celular, reservando um pequeno eloquate para a contagem. Em seguida, semeie 0,5 a 1 vezes 10 elevado às 6ª células em dez mililitros de prato de poliesterno médio por dez centímetros e incube as culturas de células por 24 horas. Para a indução EMT, no dia seguinte, trate as células com 10 microlitros de TGF beta 1 e TNF alfa e devolva as placas à incubadora por mais 48 horas.

No quarto dia, lave as culturas induzidas por emt com cinco a dez mililitros de pbs e, em seguida, desprenda as células com tripsina-EDTA, conforme demonstrado. Em seguida, desligue-se as suspensões celulares em DMEM suplementado com inibidor de tripsina e ressuspenda os pellets em 500 microlitros de pbs. Em seguida, conte as células e adicione o meio gell recém-preparado a uma densidade de 3 vezes 10 às 5ª células por poço, misturando suavemente, mas rapidamente, a solução por pipeta antes da gelificação.

Prontamente, mas com cuidado, dispense 0,5 mililetores de células em cada poço de uma placa de 24 poços não tratada em formas cilíndricas e organizadas. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de cultura de células por 15 minutos. Quando o gel estiver completamente solidificado, mova um spatuala esterilizado em um círculo ao redor da parte externa de cada gel em uma direção, para separar os géis das placas sem quebrar.

Ao remover o gel, tome cuidado para não mover a espátula para frente e para trás no poço. Em seguida, use a espátula para transferir suavemente os géis para placas individuais de cultura de tecidos de 16 milímetros contendo cinco mililitros de DMEM suplementados com um por cento de FBS, com ou sem TGF beta 1 e TNF alfa. Por fim, agite suavemente os pratos para garantir que os géis estejam flutuando no meio e devolva os géis à incubadora de cultura de células.

As células a541 não tratadas exibem uma aparência semelhante a paralelepípedos e em forma de triângulo, característica das células epiteliais. Após a estimulação com TGF beta 1 e TNF alfa, no entanto, as células demonstram uma forma de fuso longo, semelhante à observada nas células mesinquêmicas. O QRTCPR da expressão de marcadores epiteliais e mesinquêmicos antes e depois da EMT revela que as células A541 tratadas com citocinas inflamatórias por 48 horas exibem uma expressão significativamente reduzida de CDH1 e expressões significativamente aumentadas de VIAM e ACTA2.

Além disso, a estimulação com essas citocinas atenua a expressão de E-caderina conforme determinado pela análise de sangue ocidental, enquanto as expressões de vimentina N-caderina e actina de músculo liso alfa são induzidas. Em um ensaio de contração em gel, após 48 horas, os géis contendo células tratadas com TGF beta 1 e TNF alfa são menores do que os géis controlados contendo células tratadas com PBS. De fato, após 72 horas, o tamanho dos géis contendo os géis tratados com citocinas é significativamente reduzido, em comparação com os géis controlados medidos por um analisador de gel.

Como observado, as etapas de contração do gel podem ser concluídas em três horas se forem executadas corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de confirmar se a EMT foi induzida com sucesso antes de realizar o ensaio de contração do gel. Após a observação, esta técnica fornece uma maneira de variar o processo de EMT durante o estado inflamatório, como fibrose ou remodelação pulmonar.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como emitir células que possuem EMT, em um tipo de cuagenter e espumá-las em meio.