Name: Desenvolvimento de um In Vitro Ensaio para avaliar contrátil Função de células mesenquimais que a transição epitelial-mesenquimal Sofreu (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Aprenda a avaliar a contratilidade de células mesenquimais pós-EMT usando ensaio de contração de gel. Este método simples estuda fibrose pulmonar e asma grave sem equipamentos especializados.

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Agradecemos ao Dr. Tadashi Koyama pela ajuda técnica. Este trabalho foi apoiado em parte pelos números de concessão JSPS KAKENHI 23249045, 15K09211, 15K19172; uma bolsa para o Grupo de Pesquisa em Insuficiência Respiratória do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar, Japão; uma bolsa para pesquisa em doenças alérgicas e imunologia, Japão.

1. Preparações e cultivo de células epiteliais do pulmão <ol><li> As células epiteliais do pulmão humano A549 (linha de cultura de células aderentes) em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 UI / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina. </li><li> Remover e descartar o meio de cultura celular a partir de placa de cultura, e lava-se uma vez com 5 - 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Após a lavagem, aspirar imediatamente o PBS. </li><li> Adicionar 2 ml de ácido Tripsina / etilenodiaminotetra-acético (EDTA) (0,05%) e incuba-se a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 3 min. </li><li> Recolher as células isoladas em tubos de centrífuga contendo meio de cultura de células, os tubos de centrifugação à TA durante 4 minutos a 150 x g. </li><li> Ressuspender as células sedimentar em 2 ml de meio de cultura celular e remover uma amostra para contagem de células. Contar o número de células utilizando um hemocitómetro com Trypan mancha azul para verificar a viabilidade das células. </li><li> As células A549 semente sobre10 cm placas de poliestireno com uma densidade de 0,5 - 1,0 x 10 6 células / prato com 10 ml de meio para o ensaio de contracção do gel. Semear as células em placas de 6 cavidades de poliestireno com uma densidade de 0,5 - 1,0 x 10 5 células / poço com 2 ml de meio de confirmação EMT. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 horas. </li></ol> 2. EMT Procedimento <ol><li> Adicionar 10 ul de TGF-β1 (5 ug / ml) e 10 ul de TNF-α (10 ug / ml) para a placa de ensaio de contracção de gel semeada na etapa 1.6. Adicionar 2 mL de TGF-β1 (5 ug / ml) e 2 ul de TNF-α (10 ug / ml) à placa a confirmação EMT semeadas no passo 1.6. Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 48 horas. </li></ol> 3. Confirmação de EMT Procedimento por PCR e Western Blotting <ol><li> Confirmar alteração na morfologia (a partir de pedra-como remendar a fuso forma) das células tratadas por meio de microscopia de contraste de fase. Nota: NormaAs células A549 al têm aparência godo tipo pedra e triangulares, que é uma característica das células epiteliais, mas após estimulação com TGF-β1 e TNF-α, as células aparecem longo e em forma de fuso que é semelhante às células mesenquimais 14,15. </li><li> Avaliar a expressão de um marcador epitelial, tal como E-caderina, e marcadores de mesenquimais, tais como N-caderina, vimentina, actina de músculo liso-α usando PCR ou transferência de Western. <ol><li> Extrair o ARN total a partir das células utilizando o kit de extracção de ARN 16 e sintetizar ADNc, utilizando transcriptase reversa 17 de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Medir a expressão dos níveis de ARNm utilizando PCR em tempo real do sistema 18 e corante de cianina monomérico Kit de PCR de acordo com as instruções dos fabricantes. Os iniciadores específicos para GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase), ACTA2 (alfa-actina-2), CDH1 (caderina-1; E-caderina), e VIM (vimentina) são mostrados na Tabela 1 </strong&gt;. </li><li> Lisar as células, utilizando um tampão de lise (Tabela 2), contendo 1% de cocktail inibidor de protease. Medir todas as concentrações de proteína de amostra utilizando um kit de ensaio de proteína 19,20, e aplicar as mesmas quantidades de proteína para um gel de poliacrilamida. <ol><li> Realizar SDS-gel de electroforese e transferência semi-seco das proteínas para uma membrana de PVDF 21. Incubar a membrana com anticorpos primários em tampão de bloqueio durante 1 - 2 h. Após a incubação, lavar duas vezes a membrana com tampão de lavagem e incubar a membrana 1 h com segundos anticorpos. Nota: Veja a Tabela de materiais / equipamentos para detecção de anticorpos e diluições utilizadas nestes estudos. Ver Tabela 2 para os componentes do tampão de bloqueio. </li><li> Lava-se a membrana com tampão de lavagem por duas vezes. Tire fotos da membrana com o kit de detecção de Western blot 22 usando um CCD frio câmera 11,23. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Gel Contração Ensaio de Avaliação EMT <ol><li> Aspirar o meio condicionado a partir do recipiente de cultura de células, e lava-se bem com 5 - 10 ml de PBS para remover as células mortas. Após a lavagem, aspirar imediatamente o PBS. </li><li> Adicionar 2 ml de 0,05% de tripsina / EDTA e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 3 min. </li><li> Recolher as células isoladas em tubos de centrífuga contendo DMEM suplementado com inibidor de tripsina (1 mg / ml), centrifugar os tubos à temperatura ambiente durante 4 minutos a 150 x g. </li><li> Misture tipo gel de colagénio 1 com água destilada, e 4 × DMEM concentrado para ajustar o volume para se atingir uma concentração de colagénio de 1,75 mg / ml, e 1 x concentração de DMEM. Certifique-se de manter o meio de gel em gelo durante esta etapa. Nota: Para efectuar a 6 ml de meio de gel, misturar bem 3,5 ml de gel de colagénio de tipo 1 (3 mg / ml), 1,5 ml de 4 × DMEM concentrada, e 1 ml de água destilada. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de PBS e remover uma amostra para contagem de células. Contagemo número de células utilizando um hemocitómetro com corante azul de tripano para verificar a viabilidade das células. </li><li> Adicionar a forma de gel para ajustar os volumes para atingir uma densidade celular de 3,0 x 10 5 células / poço (6,0 x 10 5 células / ml) e cuidadosamente mas rapidamente misturá-lo por pipetagem sem gelificação. </li><li> Pipetar 0,5 mL da mistura em cada cavidade de uma placa de 24 poços não-tratada de forma rápida e cuidadosamente para ter a forma cilíndrica pura. Tenha cuidado para não permitir que as bolhas de ar para contaminar os géis (Figura 1A). Nota: O meio de gel que contém as células é viscoso e pode facilmente gel e forma forma crescente no poço. </li><li> Incubar a placa durante 15 minutos numa incubadora celular a 37 ° C, 5% de CO 2 e 95% de humidade para gelificar completamente. </li><li> Retire a placa de géis sem quebrar, movendo uma espátula esterilizada de forma a tirar uma circunferência numa direcção. Com uma espátula, transferir cuidadosamente os géis para pratos de cultura de tecidos de 60 mmcontendo 5 ml de DMEM / FBS a 1%, com ou sem TGF-β1 (5 ng / ml) e TNF-α (10 ng / ml). </li><li> Agite suavemente os pratos para garantir géis estão flutuando no meio. Incubar numa incubadora celular a 37 ° C, 5% de CO 2 e 95% de humidade. </li></ol> 5. Medição de Gel Tamanho <ol><li> Medir o tamanho do gel de colagénio após 0, 24, 48, e 72 h usando um sistema de análise de imagem. <ol><li> Ligue o sistema de documentação do gel (Figura 2A), e colocar pratos no armário de blindagem leve. Em seguida, retire a tampa de pratos no armário. </li><li> Abra o software de análise de gel relacionado. Clique no botão &quot;aquisição de imagem&quot; no menu do bar para mostrar a imagem dos géis no gabinete. Em seguida, clique em &quot;adquirir&quot; na barra de menu para tirar fotos dos géis (Figura 2B). </li><li> Clique no botão &quot;detecção&quot; na barra de menu (Figura 2C) e ajustar a região de medição (círculo i amarelon Figura 2C), arrastando o mouse. Em seguida, clique no botão &quot;auto-detectar&quot; na barra de menu (veja o botão na Figura 2D). O software detecta automaticamente os geles que mostram um mapa térmico (Figura 2D). </li><li> Clique em &quot;OK&quot; para extrair o contorno dos géis de processamento de imagem e calcular áreas cercadas pelo contorno (Figura 2E). Depois que a área é calculada, a área calculada é exibida na janela pop-up separada. Nota: Se os géis sobrepõem uns aos outros durante a imagem, mova géis suavemente com uma ponta de pipeta estéril. </li></ol></li></ol>

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Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

O protocolo desenvolvido neste estudo compreende duas etapas. O primeiro passo é realizado para induzir EMT, enquanto o segundo passo é o ensaio de contracção do gel. Uma vez que é importante para confirmar que as células foram submetidos a EMT, passo 2 proporciona um excelente complemento para as alterações morfológicas e expressão de genes. Estudos anteriores mostraram que as células de EMT A549 foi induzida por apenas 24 TGF-β1; No entanto, como já relatado anteriormente 10, o tratamento TNF-α a...

Fibrose está envolvida na patogénese de várias doenças progressivas, crónicas, tais como doença intersticial pulmonar, fibrose cardíaca, cirrose hepática, insuficiência renal terminal, esclerose sistémica, doença auto-imune e uma. Entre as doenças pulmonares intersticiais, fibrose pulmonar idiopática (PIF) é uma doença progressiva crónica e mostra mau prognóstico. marco patológico da FPI é o desenvolvimento de focos fibroblásticos consistindo de fibroblastos activados e miofibroblastos que estão associados com o prognóstico. As origens de tais fibroblastos pulmonares são propostos para ser derivadas de várias células mesenquimais, incluindo fibroblastos pulmonares originalmente residentes e fibrócitos que circulam a partir de medula óssea. Recentemente, tem sido proposto transição epitelial-mesenquimal (EMT) para ser associada com a formação de células mesenquimais 2, e para contribuir para a patogénese de doenças fibróticas. Pensa-se que o EMT desempenha um papel importante no processo de desenvolvimento fetal, a cicatrização de feridas, e progressão do cancro, incluindo a invasão do tumor e metástases 3. Seguindo o processo de EMT, células epiteliais obter a capacidade das células mesenquimais por perda de marcadores epiteliais, tais como E-caderina, e através da expressão de marcadores de mesenquimais, tais como, a vimentina e α-actina de músculo liso (SMA) 4,5. Estudos anteriores demonstraram a evidência de que EMT processo tem sido associada com o desenvolvimento de tecido fibroso no rim e pulmão 6 7. Além disso, a inflamação crónica promove doença fibrótica 8; Além disso, tais citocinas inflamatórias como o factor de necrose tumoral membro da superfamília 14 (TNFSF14; LUZ), -α factor de necrose tumoral (TNF) e interleucina-1β, têm sido mostrados para melhorar EMT 9-12. ensaio de contracção de gel de colagénio, um ensaio de contracção celular à base de colagénio, em que os fibroblastos são incorporados no tipo Igel de colagénio tridimensional, é um modelo in vitro ideal para a avaliação da contractilidade. Contractilidade é uma das funções características de fibroblastos e contribui para a reparação de feridas normal e fibrose 13. Neste ensaio, pensa-se que a fixação de fibroblastos ao colágeno tipo I através de mecanismos dependentes de integrina é suposto para produzir tensão mecânica sob certas condições, e, consequentemente, levar à contração do tecido. Aqui, o desenvolvimento do ensaio de contracção de gel é referido como sendo adaptado para avaliar a aquisição da função contráctil nas células que foram submetidos a EMT. Este relatório demonstra que este ensaio modificado é adequado para avaliar a contratilidade em células mesenquimais que foram submetidos a EMT.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>sigma aldrich</td><td>11965-092</td><td>para A549 médio</td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Transformador-&beta; 1, humano, produtos químicos recombinantes</td><td>209-16544</td><td></td>do <td>laboratório de Wako</td></tr><tr><td>TNF-&alpha humano recombinante;</td><td>R& D systems</td><td>210-TA/CF</td><td></td></tr><tr><td>E-Caderina (24E10) Tecnologia</td><td>de Sinalização de Células</td> mAb de Coelho<td>#3195</td><td>diluição 1:3,000</td></tr><tr><td>Vimentina (D21H3) Tecnologia</td><td>de Sinalização de Células</td> mAb de Coelho<td>#5741</td><td>diluição 1:3,000</td></tr><tr><td>Anti-&alfa;-Tubulina anticorpo</td><td>sigma aldrich</td><td>T9026</td><td>diluição 1:10,000</td></tr><tr><td>Anti-Actina Monoclonal, &alfa;-Anticorpo de Músculo Liso& nbsp;</td><td>sigma aldrich</td><td>A5228</td><td>diluição 1:10.000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-N-caderina</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>#610920</td><td>1:1.000 diluição</td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG, Ovino Ab Inteiro Ligado a HRP (anticorpo secundário)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-100UL</td><td>Diluição 1:20.000</td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG, Burro Ab Inteiro Ligado a HRP (anticorpo secundário)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>1:20.000 reagente bloqueador de diluição</td></tr><tr><td></td><td>GE Healthcare</td><td>RPN418</td><td>2% em TBS-T</td></tr><tr><td>6 Placa de cultura de células multipoços tratadas com TC de fundo plano transparente, com tampa</td><td>corning</td><td>#353046</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Placa de cultura de células</td><td>TPP</td><td>#93100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, tecnologias</td><td>de vida em</td> pó <td>12100-046</td><td>Para 4&vezes; DMEM</td></tr><tr><td>Gel de colágeno tipo 1</td><td>Gelatina Nitta</td> Placa de cultura de células <td>Cellmatrix tipo I-A</td><td></td></tr><tr><td>24 Well</td><td>AGC TECHNO GLASS</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Documentação de Gel&nbsp;</td><td>ATTO</td><td>AE-6911FXN</td><td>Gerador de imagens em gel</td></tr><tr><td>Software de análise em gel</td><td>ATTO</td><td>Densitograph, ver. 3.00</td><td>software de análise fornecido com AE-6911FXN</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), tecnologias de vida útil de vermelho de fenol</td><td></td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>placas de 24 poços, solução não tratada</td><td>IWAKI</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue, 0,4%</td><td>life technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração de RNA</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologias de vida</td><td>de transcriptase reversa</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR em tempo real</td><td>Stratagene</td><td>Mx-3000P</td><td></td></tr><tr><td>SYBR kit de PCR verde</td><td>Qiagen</td><td>204145</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Protease Coquetel (100x)</td><td>life technologies</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Membrana</td> <td>PVDFKit</td><td>de</td> ensaio de proteína ATTO 2392390 <td></td></tr><tr><td></td><td>bio-rad</td><td>5000006JA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gel de poliacrilamida</td><td>ATTO</td><td>2331810</td><td></td></tr><tr><td>Western blotting reagente de detecção</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>câmera CCD fria</td><td>ATTO</td><td>Ez-Capture MG / ST</td><td></td></tr><tr><td>inibidor de tripsina</td><td>sigma aldrich</td><td>T9003-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Polioxietileno (20) monolaurato de sorbitano</td><td>Wako Produtos químicos de laboratório</td><td>163-11512</td><td></td></tr><tr><td>Éter octifenílico de polioxietileno (9)</td><td>Produtos químicos de laboratório Wako</td><td>141-08321</td><td></td></tr></tbody></table>

desenvolvimento de um<em&gt; in vitro</em&gt; ensaio para avaliar contrátil função de células mesenquimais que a transição epitelial-mesenquimal sofreu

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

A fibrose está frequentemente envolvida na patogênese de várias doenças crônicas progressivas, como doença pulmonar intersticial. A característica patológica é a formação de focos fibroblásticos, que está associada à gravidade da doença. Propõe-se que as células mesenquimais que consistem nos focos fibroblásticos sejam derivadas de várias fontes celulares, incluindo fibroblastos intrapulmonares originalmente residentes e fibrócitos circulantes da medula óssea. Recentemente, as células mesenquimais que sofreram transição epitelial-mesenquimal (EMT) também devem contribuir para a patogênese da fibrose. Além disso, a EMT pode ser induzida pela transformação do fator de crescimento β, e a EMT pode ser aumentada por citocinas pró-inflamatórias, como o fator de necrose tumoral α. O ensaio de contração em gel é um modelo in vitro ideal para a avaliação da contratilidade, que é uma das funções características dos fibroblastos e contribui para o reparo e fibrose de feridas. Aqui, o desenvolvimento de um ensaio de contração em gel é demonstrado para avaliar a capacidade contrátil de células mesenquimais submetidas a EMT.

Durante EMT, células epiteliais perdem marcadores epiteliais, como a E-caderina, e ganhar a expressão de marcadores mesenquimais, como vimentina e músculo α-suave agindo 4,5. A incubação de células epiteliais do pulmão humano A549 com TGF-β1 e TNF-α induz EMT. O aparecimento de células A549 normais são de calçada como forma e forma de triângulo, que é uma característica de células epiteliais (Figura 3A), mas depois estimuladas com TGF-β1 e TNF-α, a aparência a...

Aqui, descrevemos o desenvolvimento e a aplicação de um ensaio de contração em gel para avaliar a função contrátil em células mesenquimais que sofreram transição epitelial-mesenquimal.

Desenvolvimento de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio para avaliar contrátil Função de células mesenquimais que a transição epitelial-mesenquimal Sofreu

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a contratilidade das células mesenquimais que sofreram transição epitelial mesenquimal induzida por citocinas inflamatórias in vitro, ou EMT. Este mesenquimal é uma variação da função celular básica após EMT induzida por respostas imunes inflamatórias, como durante fibrose pulmonar idiopática ou remodelação das vias aéreas na asma grave. As principais vantagens desta técnica são que ela não requer dispositivos específicos e que demonstra um alto teor de demontrating o procedimento será Hideyuki Takeshima e Kosuke Makita alunos de pós-graduação do meu laboratório.Comece lavando uma cultura de células epiteliais pulmonares humanas A-549 com cinco a dez mililitros de PBS. Em seguida, separe as células aderentes com dois mililitros de tripsina-EDTA a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono. Após três minutos, transferir a suspensão celular para tubos cónicos contendo meio de cultura celular e centrifugar as células numa centrífuga.Ressuspender os sedimentos em dois mililitros de meio de cultura celular, reservando um pequeno eloquate para a contagem. Em seguida, semeie 0,5 a 1 vezes 10 elevado às 6ª células em dez mililitros de prato de poliesterno médio por dez centímetros e incube as culturas de células por 24 horas. Para a indução EMT, no dia seguinte, trate as células com 10 microlitros de TGF beta 1 e TNF alfa e devolva as placas à incubadora por mais 48 horas.No quarto dia, lave as culturas induzidas por emt com cinco a dez mililitros de pbs e, em seguida, desprenda as células com tripsina-EDTA, conforme demonstrado. Em seguida, desligue-se as suspensões celulares em DMEM suplementado com inibidor de tripsina e ressuspenda os pellets em 500 microlitros de pbs. Em seguida, conte as células e adicione o meio gell recém-preparado a uma densidade de 3 vezes 10 às 5ª células por poço, misturando suavemente, mas rapidamente, a solução por pipeta antes da gelificação.Prontamente, mas com cuidado, dispense 0,5 mililetores de células em cada poço de uma placa de 24 poços não tratada em formas cilíndricas e organizadas. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de cultura de células por 15 minutos. Quando o gel estiver completamente solidificado, mova um spatuala esterilizado em um círculo ao redor da parte externa de cada gel em uma direção, para separar os géis das placas sem quebrar.Ao remover o gel, tome cuidado para não mover a espátula para frente e para trás no poço. Em seguida, use a espátula para transferir suavemente os géis para placas individuais de cultura de tecidos de 16 milímetros contendo cinco mililitros de DMEM suplementados com um por cento de FBS, com ou sem TGF beta 1 e TNF alfa. Por fim, agite suavemente os pratos para garantir que os géis estejam flutuando no meio e devolva os géis à incubadora de cultura de células.As células a541 não tratadas exibem uma aparência semelhante a paralelepípedos e em forma de triângulo, característica das células epiteliais. Após a estimulação com TGF beta 1 e TNF alfa, no entanto, as células demonstram uma forma de fuso longo, semelhante à observada nas células mesinquêmicas. O QRTCPR da expressão de marcadores epiteliais e mesinquêmicos antes e depois da EMT revela que as células A541 tratadas com citocinas inflamatórias por 48 horas exibem uma expressão significativamente reduzida de CDH1 e expressões significativamente aumentadas de VIAM e ACTA2.Além disso, a estimulação com essas citocinas atenua a expressão de E-caderina conforme determinado pela análise de sangue ocidental, enquanto as expressões de vimentina N-caderina e actina de músculo liso alfa são induzidas. Em um ensaio de contração em gel, após 48 horas, os géis contendo células tratadas com TGF beta 1 e TNF alfa são menores do que os géis controlados contendo células tratadas com PBS. De fato, após 72 horas, o tamanho dos géis contendo os géis tratados com citocinas é significativamente reduzido, em comparação com os géis controlados medidos por um analisador de gel.Como observado, as etapas de contração do gel podem ser concluídas em três horas se forem executadas corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de confirmar se a EMT foi induzida com sucesso antes de realizar o ensaio de contração do gel. Após a observação, esta técnica fornece uma maneira de variar o processo de EMT durante o estado inflamatório, como fibrose ou remodelação pulmonar.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como emitir células que possuem EMT, em um tipo de cuagenter e espumá-las em meio.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Nós descrevemos o uso de um ensaio de células de rato ES base para identificar janelas de tempo crítico para Wnt / β-catenina e ativação do sinal BMP durante a indução cardiogênico. O método fornece uma plataforma padronizada, que quantifica a eficiência confiável cardiogênico, e é aplicável ao estudo de linhagens de célula.

Modificado embrionárias de camundongos com células-tronco Ensaio baseado para quantificar a eficiência de indução cardiogênico

O mesênquima craniana sofre movimentos morfogênicos dramáticas que provavelmente fornece uma força motriz para a elevação das pregas...

Um ensaio de explante para avaliar o comportamento celular do mesênquima craniana

Um método simples é descrito para a indução de células epiteliais para mesenquimal (EMT) em uma variedade de tipos de células. Métodos de análise de células em EMT estados por imunocitoquímica estão incluídos.

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

A regulação alternativa do splicing demonstrou contribuir para a transição epitelial-mesenquimal (EMT), um programa celular essencial em vários processos fisiológicos e patológicos. Aqui descrevemos um método utilizando um modelo EMT induzível para a detecção de splicing alternativo durante EMT.

Detecção de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal Transição

Aqui, descrevemos métodos para isolar células epicárdicas primárias de camundongos por um ensaio de cultura de crescimento e avaliar a migração funcional de células derivadas de epicárdio (EPDC) usando um sistema de cultura cardíaca ex vivo. Esses protocolos são adequados para identificar moduladores genéticos e químicos da transição epicárdica epitelial-mesenquimal (EMT) e motilidade.

Epicárdio Conseqüência Cultura Ensaio e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Avaliação da migração celular Epicárdica derivado

A transição epitelial para mesenquimal (EMT) permite que os cânceres se tornem invasivos. Para investigar a EMT, é descrito um modelo in vitro baseado em células-tronco neurais (NSC) desprovido de soro e enzimas. Este sistema padronizado permite a avaliação quantitativa e qualitativa da migração celular, expressão gênica e proteica. O modelo é adequado para a descoberta de medicamentos.

Um Modelo de enzimas e Cultura de Células-Tronco Neural Serum-livre para EMT Investigation Adequado para Drug Discovery

Um protocolo para indução em vitro de transição endotelial-mesenquimais (EndMT), que é útil para investigar as vias de sinalização celulares envolvido em EndMT, é descrito. Neste modelo experimental, EndMT é induzida pelo tratamento com TGF-β em células endoteliais de MS-1.

Análise molecular de transição endotelial-mesenquimais induzida por transformar o fator de crescimento-β sinalização

Apresentamos um ensaio de força de tração de alta produtividade fabricado com borracha de silicone (PDMS). Este novo ensaio é adequado para o estudo de alterações físicas na contratilidade celular durante vários processos biológicos e biomédicos e doenças. Nós demonstramos a utilidade deste método medindo um aumento dependente TGF-β na contractilidade durante a transição epithelial-à-mesenchymal.

Microscopia de força de tração de alta produtividade usando PDMS revela efeitos dose-dependentes do fator de crescimento transformador-β na transição epitelial-para-mesenquimal

Descrevemos um fluxo de trabalho sistemático para investigar a sinalização TGF-β e o EMT induzido pelo TGF β, estudando a proteína e a expressão genética envolvidas nessa via de sinalização. Os métodos incluem mancha ocidental, ensaio de repórter de luciferase, qPCR e coloração de imunofluorescência.

Estudando a sinalização TGF-β e a transição epitelial-mesenquimal induzida pelo TGF-β em câncer de mama e células normais

Descrevemos métodos para investigar o EndMT induzido pelo TGF-β2 em células endoteliais observando alterações de morfologia celular e examinando as alterações de marcadores relacionadas ao EndMT usando a coloração da imunofluorescência. A edição de genes CRISPR/Cas9 foi descrita e usada para esgotar o caracol de codificação genética para investigar seu papel no EndMT induzido pelo TGF-β2.

Endotelial mediado por TGF-β para transição mesenquimal (EndMT) e a avaliação funcional dos efeitos endMT usando edição de genes CRISPR/Cas9

Este protocolo fornece métodos para gerar tecidos cardíacos e musculares esqueléticos modificados em 3D e descreve seu uso em modalidades de triagem pré-clínica de medicamentos. Os métodos descritos utilizam um sistema de detecção magnética para facilitar a avaliação simultânea de 24 tecidos em paralelo.

Teste pré-clínico de drogas em tecidos musculares escaláveis de engenharia 3D

Aprenda a avaliar a contratilidade de células mesenquimais pós-EMT usando ensaio de contração de gel. Este método simples estuda fibrose pulmonar e asma grave sem equipamentos especializados.

Desenvolvimento de um In Vitro Ensaio para avaliar contrátil Função de células mesenquimais que a transição epitelial-mesenquimal Sofreu (Vídeo) | JoVE Journal

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