Name: Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Aprenda a induzir transição epitelial-mesenquimal (EMT) em várias linhagens celulares usando meio de cultura específico. Este método reprodutível permite análise por imunocitoquímica e estudo de metástase.

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Os autores gostariam de agradecer Julia Hatler e Martin Ramsden (R &amp; D Systems) para discussão útil e revisão do manuscrito.

1. Indução de EMT <ol><li> Meios de cultura de aquecer a 37 ° C em um banho de água. O meio de cultura utilizado é o mesmo que os meios utilizados para a cultura padrão de suas células de interesse. Por exemplo, a linha de células de pulmão humano A549 carcinoma é cultivado em F12 de Kaighn suplementado com 10% de soro fetal bovino e glutamina 2 mM. </li><li> Células colheita de interesse usando uma solução de dissociação (por exemplo TrypLE Express). </li><li> Suspender as células em meios de cultura pré-aquecido em um tubo de 15 ml. </li><li> Centrifugar a suspensão de células a 400 xg durante 5 min. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante por derrama em um recipiente de resíduos. </li><li> Suspende-se o sedimento de células em meio de cultura de pré-aquecido. </li><li> Contagem de células viáveis ​​utilizando azul de tripano. Retirar uma amostra de suspensão de células e dilui-se em 0,4% de solução de azul de tripano. Coloque 10 ml da amostra diluída em um hemocitômetro e contagem de células viáveis ​​(células que não ficam azuis). Utilizar a contagem de células para determinar a célula density em sua solução. </li><li> Células placa sobre placas de cultura de tecidos tratados ou frascos de 0,9-1,0 x 10 4 culas por cm 2. Por exemplo, 0,5 x 10 6 células plaqueadas numa placa de 100 mm de meio de cultura contendo 1X Suplemento EMT Indução de media (6 ml de meio por placa de 100 mm). </li><li> Cultura de células plaqueadas numa 37 ° C / 5% de CO2. Monitorar morfologia celular diariamente. </li><li> Três dias após o plaqueamento, remover e substituir a mídia com meios de cultura pré-aquecido fresco contendo 1X EMT Induzir Mídia Suplemento. Continuar a cultura em um 37 ° C / 5% de CO2. </li><li> Cinco dias após o plaqueamento, as células estão prontas para análise. Morfologia celular é visualizado por microscopia de luz invertida. </li></ol> 2. Análise da expressão das proteínas por imunocitoquímica <ol><li> Prepare estéreis lamelas 12 milímetros para uma placa de 24 poços colocando lamelas numa placa de petri contendo 95% de etanol. Remova cuidadosamente lamelas de etanol nosção de uma agulha e uma pinça curva e chama esterilizar. Coloque lamela esterilizada para um poço de uma placa de 24 poços. Repita com lamelas restantes. </li><li> Prepare a suspensão de células como descrito na seção 1,1-1,7. </li><li> Placa 1,6 x 10 4 células / poço em 0,5 ml de meio de cultura pré-aquecido contendo 1X EMT Induzir Mídia Suplemento. </li><li> Crescer e alimentar as células, conforme descrito nas seções 1,9-1,11. </li><li> Cinco dias após o plaqueamento, retirar o suporte e fixar as células com 300 ^ l / poço de paraformaldeído a 4% em 1X tampão fosfato salino (PBS) durante 20 min à temperatura ambiente. </li><li> Remover fixador e lavar as células 2x com 1X PBS, 500 ul / poço. </li><li> Incubar as células em 400 ul / poço de tampão de bloqueio (1X PBS contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA), 10% de soro de burro normal, e 0,3% de Triton X-100) durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Incubar em anticorpo primário em fabricantes concentração recomendada em 400 ul / poço de tampão de bloqueio durante 3 horas a temperatur ambientee ou durante a noite a 4 ° C. Quando se utiliza um anticorpo primário directamente conjugado com um fluorocromo, incubar as amostras no escuro. </li><li> Lave as células três vezes em 500 ul / poço de 1X PBS contendo BSA a 0,1% durante 5 min cada lavagem. Quando se utiliza um anticorpo primário diretamente conjugado a um fluorocromo, prossiga diretamente para o passo 2.12. </li><li> Incubar as células em anticorpo secundário na concentração recomendada pelo fabricante em 400 ul / poço de 1X PBS contendo 1% de BSA durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Lave as células três vezes em 500 ul / poço de 1X PBS contendo BSA a 0,1% durante 5 min cada lavagem. </li><li> Se se desejar, os núcleos com DAPI contracoloração solução. </li><li> Lavar as células em água deionizada e montar lamelas de bruços sobre um slide usando a mídia de montagem. </li></ol>

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<li>Pon, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p70+S6+kinase+promotes+epithelial+to+mesenchymal+transition+through+Snail+induction+in+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells.</a> Cancer Research. 68, 6524-6532 (2008).</li>
<li>Wegner, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+changes+in+receptor+tyrosine+kinase+phosphorylation+using+antibody+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
</ol>

R &amp; D Systems, Inc. é uma empresa pública com fins lucrativos. Produção e livre acesso a este artigo é patrocinado pela R &amp; D Systems, Inc.

Os métodos anteriores para a indução de EMT têm geralmente usado estimulação de TGF-β ou modificação genética. Embora o TGF-β sozinho demonstrou induzir EMT em alguns tipos de células, que já foi demonstrado que TGF-β é necessário para EMT, mas não é suficiente em todos os tipos de células de 6,14. Usando modificação genética para a indução de EMT é demorado e trabalhoso. O método descrito aqui utiliza uma combinação de factores, incluindo, anti-humano de E-caderina, sFRP-1 anti-humano, Dkk-1 anti-humano, recombinante humana de Wnt-5a, e recombinante humana TGF-β1 para induzir de forma fiável EMT. Esta combinação de factores é concebido para bloquear a adesão de E-caderina-base, um passo crítico para a indução de EMT 4, e melhorar a sinalização de Wnt, adicionando a proteína Wnt-5a, bem como a utilização de anticorpos de bloqueio para os inibidores de Wnt, sFRP-1 e Dkk -1. Wnt e de sinalização de TGF-β foram mostrados para agir em um loop autócrino para induzir e manter a estatística de células mesenquimaise 6. Este método evita a indução da manipulação genética e é mais eficaz do que a utilização de TGF-β sozinho. Importante, que é capaz de observar a indução de EMT em tipos de células, incluindo MCF7 e PANC-1 de células, que tenham sido previamente demonstrado que não respondem exclusivamente a estimulação de TGF-β (Figura 5) 14. As células tratadas com o EMT Induzir Mídia Suplemento show de morfologia fusiforme menos compacto e maior (Figura 1). Além disso, há uma diminuição da superfície de E-caderina expressão concomitante com um aumento na expressão de fibronectina, que são características de EMT (Figuras 2 e 3). Mesenquimais marcadores adicionais tais como vimentina e caracol também são regulados positivamente em células induzidas EMT, em comparação com os controlos não induzidos (Figura 4). Aumento habilidades de migração e invasão são as principais características funcionais das células mesenquimais. Em in vitro </em&gt; Migração e invasão ensaios, as células tratadas com o Suplemento EMT Indução de mídia demonstraram um aumento significativo da capacidade de migrar e invadir (Figura 6). Este método simples para a indução de EMT é útil para o estudo da sinalização EMT como demonstrado utilizando os dados de expressão de anticorpo de matriz mostradas na Figura 7. Diferentes tipos de células podem ser comparadas e pré-indução de pós-EMT para obter assinaturas de expressão mais comuns associados com EMT, tais como o aumento da CREB fosforilado e ERK1 / 2 observada em ambos MCF7 e de células induzida por EMT A549. S133 fosforilação de CREB estimula a ligação ao ADN e tem sido mostrado que actua a jusante de TGF-induzida por β1 EMT 15. ERK1 / 2 fosforilação também foi mostrado que actua a jusante de TGF-induzida por β1 EMT 16. Diferenças nas vias de sinalização entre os tipos de células também pode ser elucidada como pode ser visto com o aumento na GSK-3β fosforilação em células A549 contra p70S6K fosforilação em MCF7. Fosforilação GSK-3β na serina 9 diminui a função, e GSK-3β foi mostrado para inibir o factor de transcrição pró-EMT, caracol 17. Em contraste, p70S6K induz actividade de Snail e a sua fosforilação está associada com a activação de esta proteína de 18. No geral, a indução simples e confiável de EMT, particularmente em células previamente apresentados não responder unicamente para TGF-β, é útil para a compreensão da biologia da EMT, identificar assinaturas de expressão comuns para o uso como marcadores prognósticos e desenvolvimento e avaliação de novas terapias para o câncer e doença fibrótica.

Epitelial para mesenquimal (EMT) é o processo pelo qual uma célula epitelial polarizada sofre uma variedade de alterações que resultam em, uma célula mesenquimal altamente móveis do tipo fibroblasto. Este processo ocorre, em parte, através de mudanças de expressão do gene e a degradação das junções aderentes, o que resulta num aumento da capacidade de migrar e invadem. Fisiologicamente, EMT desempenha um papel importante durante o desenvolvimento embrionário e cicatrização de feridas. Perda de controle adequado sobre EMT pode levar a fibrose e metástases de carcinomas 1,2. A redução de E-caderina sobre a superfície de células epiteliais é um passo crítico para a progressão de uma célula através de EMT 3,4. A E-caderina é uma proteína transmembranar com uma única passagem que interage directamente com as proteínas da caderina nas células adjacentes. Em adição ao seu papel na adesão celular, a sinalização de E-caderina influências celular através de interacções entre a cauda citoplasmática de E-caderina umda variedade de proteínas reguladoras, nomeadamente β-catenina. β-catenina desempenha um papel importante na estabilização de junções aderentes. Durante canónica sinalização Wnt, β-catenina é libertado a partir de E-caderina e translocado para o núcleo, onde actua como um factor de transcrição a jusante na via de Wnt 3,4,5. No núcleo, β-catenina foi mostrada para aumentar a transcrição de diversos factores relacionados com o EMT, incluindo torção, Slug, fibronectina, e uma variedade de metaloproteinases de matriz de 3,6. Além Wnts, a sinalização de TGF-β tem mostrado desempenhar um papel significativo na indução de EMT tanto durante o desenvolvimento normal e em estados de doença 7,8,9. TGF-β está envolvida na EMT que ocorre durante a formação da boca e no coração em desenvolvimento 10. Também foi implicada na fibrose e na progressão do cancro da metástase 7. O procedimento descrito aqui provides indução consistente de EMT em uma variedade de tipos de células, sem a necessidade de manipulação genética. Este processo utiliza uma mistura de E-caderina, sFRP-1, e Dkk-1 e anticorpos bloqueadores de Wnt-5a e proteínas recombinantes de TGF-β1. Este coquetel é projetado para bloquear E-caderina baseada adesão ao realçar Wnt e TGF-β sinalização. A capacidade para a indução de EMT robusta é fundamental para a compreensão da biologia do processo e como manipulá-lo para fins terapêuticos. Marcadores comuns atuais da EMT, E-caderina (downregulated em EMT) e vimentina (regulada em EMT), podem ser encontrados co-expressos em câncer e assim não fornecem os melhores marcadores de diagnóstico de potenciais células metastáticas 12. Mais importante, a análise de uma variedade de tipos de células que tenham sido submetidos a EMT é útil para o desenvolvimento de assinaturas de expressão de genes comuns que podem ser utilizados para fins de diagnóstico em cancro e fibrose 11. Além disso, estudos recentes demonstraram que a LMT pode desempenhar um papel na formação de células estaminais de cancro, o que sugere que as células que sofreram EMT pode ser útil para o rastreio de fármacos para identificar compostos que pode ter como alvo estas células 13.

<table><tbody><tr><td>Células epiteliais de interesse</td><td></td><td></td><td>Testamos A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7 e PANC1</td></tr><tr><td>EMT Suplemento de mídia indutora</td><td>R& D Systems</td><td>CCM017</td><td></td></tr><tr><td>TGF Humano Recombinante-&#946; 1</td><td>R& D Systems</td><td>240-B</td><td>usado em 10ng/ml</td></tr><tr><td>anticorpo conjugado anti-E-caderina NL557</td><td>R& D Systems</td><td>NL648R</td><td>Usado em uma diluição de 1:10 para imunocitoquímica</td></tr><tr><td>Anti-E-Caderina </td><td>R& D Systems</td><td>MAB1838</td><td>usado em 0,1 &mu; g/ml para western blotting</td></tr><tr><td>Anti-Fibronectina</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1918</td><td>Usado em 10 &mu; g/ml para imunocitoquímica; Usado em 0,5 &mu; g/ml para western blotting</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>R& D Systems</td><td>AF5718</td><td>Usado em 0.2 &mu; g/ml para o</td></tr><tr><td>anticorpo secundário NL493 do Anti-rato NL493 da cabra</td> do blotting ocidental <td>R& D Systems</td><td>NL009</td><td>Usado em uma diluição de 1:200 para imunocitoquímica</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-cabra HRP de burro</td><td>R& D Systems</td><td>HAF109</td><td>Usado em 1:2000 para western blotting</td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse HRP Anticorpo Secundário</td><td>R & D Systems</td><td>HAF007</td><td>Usado em 1:2000 para western blotting</td></tr><tr><td>EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit</td><td>R & D Systems</td><td>SC026</td><td>Usado de acordo com o fabricante' s instruções. Este kit contém anticorpos diretamente conjugados contra E-caderina, Vimentina e Caracol.</td></tr><tr><td>96 Ensaio de invasão de células BME de poço</td><td>R & D Systems</td><td>3455-096-K</td><td>Este kit foi usado de acordo com as recomendações do fabricante.</td></tr><tr><td>Kit de matriz Proteome Profiler Human Phospho-MAPK</td><td>R& D Systems</td><td>ARY002B</td><td>Este kit foi utilizado de acordo com as recomendações do fabricante19.</td></tr><tr><td>Mídia de montagem</td><td>R& D Systems</td><td>CTS011</td><td></td></tr><tr><td>0.4% Solução Azul de Tripano</td><td>Life Technologies</td><td>15350-061</td><td></td></tr><tr><td>1X Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>95% Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Soro de burro normal</td><td>Jackson Labs</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Roche Molecular Biochemicals</td><td>789-704</td><td>Diluir em 1X PBS para fazer uma solução estoque a 10%</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Diluir em 1X PBS até uma concentração de trabalho de 4%.</td></tr><tr><td>Solução DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Faça a solução de estoque a 14,3 mM dissolvendo-se em água. A solução de trabalho é uma diluição de 1:5000 da solução estoque em 1X PBS.</td></tr><tr><td>Pinça curva de ponta fina</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>08-875</td><td></td></tr><tr><td>12 mm lamínulas</td><td>Carolina Biological</td><td>633009</td><td></td></tr><tr><td>Leite</td><td></td><td></td> em pó desnatado <td>Usado a 5% em TBST para bloqueio em western blotting</td></tr><tr><td>TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20]</td><td></td><td></td><td>Para western blotting bloqueando e lavando</td></tr><tr><td>Membrana</td><td></td><td></td> <td>PVDFPara western blotting </td></tr><tr><td>4-20% SDS-page gel</td><td></td><td></td><td>Para western blotting</td></tr><tr><td>ECL substrato</td><td></td><td></td><td>Para western blotting</td></tr><tr><td>tubos</td><td></td><td></td><td></td>cônicos de 15 ml</tr><tr><td>Placas/frascos, placas de 24 poços tratadas</td><td></td><td></td><td></td></tr> para <tr><td>cultura de tecidos, tratadas para cultura</td><td></td><td></td><td></td>de tecidos</tr><tr><td>Pipetas / pontas de</td><td></td> <td>pipeta</td><td></td></tr><tr><td>Auxiliar de pipeta / pipetas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Banho-maria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C/5%CO2 Incubadora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td></td><td></td>de luz invertida</tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td></td><td></td> de fluorescência</tr></tbody></table>

indução e análise de epitelial para mesenquimal transição

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epitelial para mesenquimal (EMT) é essencial para a morfogénese adequada durante o desenvolvimento. A desregulação do processo tem sido implicada como um evento chave na fibrose e a progressão de carcinomas para um estado metastático. Compreender os processos que estão na base EMT é fundamental para o diagnóstico precoce e controle clínico dessas doenças. Indução de confiança de EMT in vitro é uma ferramenta útil para a descoberta de medicamentos, bem como para identificar as assinaturas comuns de expressão gênica para fins de diagnóstico. Aqui demonstramos um método simples para a indução de EMT em uma variedade de tipos de células. Os métodos para a análise de células de pré-e pós-indução por EMT imunocitoquímica também estão incluídos. Além disso, demonstram a eficácia deste método, através da análise de matriz baseada em anticorpos e ensaios de migração / invasão.

. EMT induzem as condições de cultura aqui descritas proporcionam um método fiável para a indução de EMT em uma variedade de tipos de células As Figuras 1 e 2 mostram a morfologia da e os níveis de expressão do marcador de quatro diferentes linhas de células humanas: células de glioblastoma T98G, HT29, células de adenocarcinoma de cólon , células de carcinoma do pulmão A549 e MCF10A células epiteliais mamárias. As células que foram tratados com o suplemento de EMT Induzir Meios mudou de uma morfologia clássica epitelial (Figuras 1A - 1D) para um mesenquimal, morfologia fusiforme (figuras 1E - 1H). Células induzidas EMT apareceu menos densamente embalado em colônias apertados em comparação com células não induzidas. Amostras não induzidas MCF10A contidas aglomerados hermeticamente embalados cercadas por células mais frouxamente embalados. Estes agrupamentos foram hermeticamente embalados E-caderina positivo (Figura 2D) e desapareceu após o tratamento com a EMT Induzir Mídia Supplemento (Figura 2H). EMT, também foi avaliado pela regulação baixa de marcadores epiteliais e aumento da expressão de marcadores mesenquimais. A regulação negativa da expressão de E-caderina é tipicamente observado após a indução de EMT em diferentes tipos de células de 3,4 a Figura 2 mostra a expressão da superfície de E-caderina na maioria das células não tratadas (Figuras 2A - 2D; vermelho). Em comparação com a sua ausência depois indução EMT (Figuras 2E - 2H, vermelho). Uma linha celular, T98G, foi encontrado para ter um baixíssimo nível basal de E-caderina antes da indução EMT, o que impedia a sua análise. Upregulation do marcador mesenquimal, fibronectina, também foi visível após a indução com o Suplemento EMT Indução de mídia (Figuras 2A - 2D contra Figuras 2E - 2H; verde). Os níveis de E-caderina e Fibronectina expressão visto por imunocitoquímicaForam ainda confirmada através de Western blotting de lisados ​​de células totais (Figura 3). O Western blot confirmou a regulação negativa da E-caderina e a regulação positiva da expressão de fibronectina vista por imunocitoquímica. As bandas foram quantificadas utilizando densitometria e normalizados para GAPDH para determinar a mudança vezes em relação após a indução EMT. Níveis de E-caderina foi reduzida de 6,4 e 3,4 vezes na A549 e células MCF10A, respectivamente. Níveis de fibronectina foram aumentadas de 4,6, 4,1, e 2,3 vezes na T98G, A549 e células MCF10A, respectivamente. Embora o Western blot não mostram redução significativa dos níveis da proteína E-caderina nas células HT29 de indução pós-EMT, os resultados imunocitoquímica demonstram uma redução na expressão de superfície de E-caderina (Figura 2B contra 2F), que é capaz de ser distinguida em Western blotting de lisados ​​de células totais. Para melhor avaliar o estado EMT, conhecido marcador adicionals para EMT foram analisadas pré e pós-indução EMT. Consistente com os resultados anteriores, a E-caderina foi regulada negativamente em todas as linhas celulares examinadas, o que indica que foi induzida EMT. Além disso, os marcadores de mesenquimais, vimentina e caracol, foram regulados positivamente em A549, T98G e MCF10A células após o tratamento com EMT Induzir Meios suplemento (Figura 4). A linha de células HT29 não mostraram expressão destes marcadores mesenquimais com ou sem indução de EMT (dados não mostrados), o que pode indicar que as células utilizam vias alternativas para a indução de EMT. Embora o TGF-β é suficiente para induzir a EMT em certos contextos célula 7,8,9, outros tipos de células não respondem exclusivamente para a adição de TGF-β 14. MCF-7 células de câncer de mama humano e PANC-1 células de carcinoma do pâncreas humanos são ambos relataram não responder a sinalização sozinho 14 TGF-β. Para determinar se ambas as linhas podem sofrer EMT em VITRo, as células foram cultivadas na presença de suplemento EMT Induzir Media. As células foram estimuladas com proteína recombinante de TGF-β1 sozinho, com a concentração no interior do Suplemento EMT Induzir Media. Estas células mantiveram a sua morfologia epitelial, que consiste em colónias de células embaladas apertadamente (dados não mostrados) e os níveis de E-caderina de superfície foram semelhantes aos observados em células de controlo (Figuras 5C e 5D contra Figuras 5A e 5B). Em contraste, as células estimuladas com o Suplemento EMT Indução de mídia mostraram uma diminuição drástica nos níveis de E-caderina superfície (Figuras 5E e 5F). Estas células também obtida uma morfologia mais mesenquimais, as células tornaram-se menos compacto e mais fusiformes (dados não mostrados). Estes resultados demonstram que o método de indução de EMT aqui descrita é capaz de promover a morfologia EMT e marcadores mudanças de expressão em células normalmente resistentes ao TGF-β-iEMT nduced. Além de mudanças na expressão do marcador, outra marca registrada de células mesenquimais é a sua capacidade de migrar e invadir. A migração e invasão de células de cultura com ou sem suplemento de EMT Induzir Os meios foram analisados ​​utilizando o bem BME 96 invasão celular Ensaio de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 96 poços (50000 células / poço) contendo inserções de filtro com 8,0 mM poros. Após 48 horas, a migração foi avaliada por calceína AM de coloração de células que migraram através do filtro. Cada amostra foi testada em triplicado duas vezes com resultados semelhantes. Os resultados representativos de uma experiência são apresentados na Figura 6A. Aumentos estatisticamente significativos (P-valor &lt;0,003) na migração celular foram vistos com tanto A549 e PANC-1 células após indução EMT. Para avaliar a capacidade destas células para invadir (ou seja, migram através da matriz extracelular), o mesmo ensaio foirealizada com um filtro revestido com extracto de membrana basal. As células induzidas por EMT mostrou um (valor P &lt;0,001) aumento estatisticamente significativo na capacidade de invasão em comparação com células não tratadas, como visto na Figura 6B. A indução robusta de EMT é útil para a análise de alterações de expressão de genes e de sinalização que ocorrem nestas células. A análise de matriz à base de anticorpo utilizando os lisados ​​de células tratadas e não tratadas, tanto é um método para analisar os níveis de uma variedade de moléculas de expressão numa única amostra. Como exemplo, foram analisados ​​os níveis de fosforilados membros da família MAPK em lisados ​​de un-induzido e EMT-induzida MCF7 e células A549 utilizando o Kit Matriz Proteoma Humano Profiler Phospho-MAPK. A matriz foi executado duas vezes a partir de tratamentos independentes EMT-indução, com resultados semelhantes. Figura 7 mostra dados representativos a partir de uma matriz. Ambos os tipos de células exibiram aumento da fosforilação de CREB (S133), a ERK1 (T2<html> 02/Y204) e ERK2 (T185/Y187) em células induzidas por EMT comparação com os controlos. Foram observadas diferenças nos acontecimentos de sinalização entre os dois tipos de células, bem. As células A549 apresentaram um aumento na GSK-3 β (S9) de fosforilação, enquanto que as células MCF-7 mostraram um aumento p70S6K (T421/S424) fosforilação. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1highres.jpg" fo:width="6in"/> Figura 1. Mesenquimais morfologia indução após estimulação com o Suplemento EMT Induzir Mídia (A - D). Morfologia epitelial nos quatro tipos de células indicado seguinte cultura por 5 dias em meio de cultura padrão sem suplemento EMT Indução de mídia (E - H). Morfologia mesenquimais no quatro tipos de células indicado cultivados com suplemento EMT Indução de mídia durante 5 dias. nt &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2highres.jpg" fo:width="6in"/> Figura 2. Regulação negativa da expressão de marcadores epiteliais e supra-regulação de expressão do marcador mesenquimais em células induzidas por EMT. Células foram coradas por imuno-fluorescência para detectar a expressão do marcador epitelial, a E-caderina (vermelho), e o marcador mesenquimal, fibronectina (verde). (A - D) células cultivadas de controle sem suplemento EMT Indução de mídia para 5 dias (E - H.) Células cultivadas com o Suplemento EMT Indução de mídia durante 5 dias. Todas as células são contrastado com DAPI (azul). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. A confirmação da expressão do marcador epitelial e mesenquimal com um western blot<html> . alysis Western blot de lisados ​​de células totais dos quatro tipos de células indicado, tratou-se com (EMT) ou sem (-) o suplemento de EMT Induzir meios durante 5 dias. Bandas para a E-caderina, fibronectina, e o controlo de GAPDH carregamento são como indicado no lado esquerdo. O marcador de tamanho é tal como indicado no lado direito. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. A sobre-regulação dos marcadores mesenquimais, vimentina e Snail em células induzidas por EMT. Células foram coradas por imuno-fluorescência multicolor para detectar a expressão do marcador epitelial, a E-caderina (cinzento), e os marcadores de mesenquimais, vimentina (verde) e caracol (vermelho) células cultivadas de controle sem o suplemento EMT Indução de mídia durante 5 dias. - (C A). (D - F) Células cultivadas com o Suplemento EMT Indução de mídia durante 5 dias. lways &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5.jpg" alt="Figura 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5highres.jpg" fo:width="6in"/> Figura 5. Indução de EMT em células que não respondem TGF-β1. (A e B) Células cultivadas com meio sozinho durante 5 dias. (C e D) Células cultivadas em meio contendo 10 ng / ml de TGF-β1 durante 5 dias. (E e F) células cultivadas em EMT Induzir Mídia Suplemento 5 dias. Todas as células são coradas para a expressão da caderina-E (vermelho) e contrastado com DAPI (azul). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Células induzidas por EMT têm aumentado as capacidades de migração e invasão. A. número de células que migraram através de um filtro de poros 8 mM após incubação de 48 horas. Número médio de B.As células que eram capazes de invadir através de um filtro de poro de 8 um revestidas com extracto de membrana basal, após incubação durante 48 horas. As barras de erro indicam o desvio padrão de 3 poços. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig7.jpg" alt="Figura 7"/> Matriz de análise de expressão baseado no anticorpo Figura 7. De indução EMT. Lisados ​​de A549 (A e C) e MCF7 (B e D), as células cultivadas com ou sem EMT Induzir Mídia Supplement foram utilizados para análise matriz usando o Kit Matriz Proteoma Humano Profiler Phospho-MAPK. Spots em destaque na A e B foram então quantificadas utilizando densitometria. Comparações de induzidas un lisados ​​induzidas a EMT são mostrados nos gráficos de barras correspondentes abaixo (C e D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50478/50478fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura &lt;</a>/ A&gt;.

Um método simples é descrito para a indução de células epiteliais para mesenquimal (EMT) em uma variedade de tipos de células. Métodos de análise de células em EMT estados por imunocitoquímica estão incluídos.

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um método simples e reprodutível para a indução da transição epitelial para mesenquimal, ou EMT, in vitro. Isso é realizado primeiramente semeando o tipo celular epitelial de interesse na presença do suplemento de meio indutor de EMT. O segundo passo do procedimento consiste em substituir o meio de cultura por meio fresco contendo o suplemento de meio indutor de EMT três dias após a semeadura inicial.O passo final é colher as células cinco dias após o plaqueamento inicial para caracterização posterior, como imunomarcação. Em última análise, os resultados podem mostrar que as células adquirem características mesenquimais por meio de microscopia de luz, imunocitoquímica, análise de matriz de western blot ou outro procedimento analítico de escolha. As principais vantagens desta técnica em comparação com métodos existentes, como estimulação com TGF-beta ou modificação genética, são que este método é rápido e fácil, ao contrário da modificação genética, e permite a indução de EMT em uma variedade de tipos celulares, alguns dos quais podem não responder apenas à estimulação com TGF-beta.As implicações desta técnica estendem-se à terapia e ao diagnóstico da metástase do câncer. Esta técnica permite aos pesquisadores desenvolver assinaturas comuns de expressão de células metastáticas que poderiam ser utilizadas no diagnóstico. Também fornece células para serem usadas na triagem de fármacos.Inicie aquecendo o meio de cultura para as células de interesse a 37 graus Celsius em banho-maria. Em seguida, recolha as células utilizando uma solução de dissociação, como a triple E express. Então, suspenda as células em meio de cultura pré-aquecido em um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue a suspensão celular a 400 Gs por cinco minutos.Remova cuidadosamente o sobrenatante despejando-o em um recipiente de resíduos e suspenda o pellet celular em meio de cultura pré-aquecido. Agora, conte as células viáveis, diluindo uma amostra da suspensão celular em solução de azul de tripano a 0,4%. Coloque 10 microlitros da amostra diluída em um hemocitômetro e conte as células viáveis.Células viáveis. Não ficam azuis após o cálculo da densidade celular na sua placa de solução. Nove a 10.000 células por centímetro quadrado em meio de cultura pré-aquecido contendo um suplemento de meio indutor XEMT, utilizando placas ou frascos de cultura de tecidos tratados.Cultive as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e monitore diariamente sua morfologia utilizando um microscópio óptico invertido. Três dias depois, substitua o meio por meio de cultura fresco, pré-aquecido, contendo um suplemento de meio indutor XEMT. Cinco dias após a semeadura, as células estarão prontas para análise.Visualize a morfologia das células sob um microscópio invertido de luz. As células agora podem ser fixadas ou colhidas para estudos posteriores. Prepare lâminas de cobertura estéreis de 12 milímetros para uma placa de 24 poços colocando as lâminas em uma placa de Petri contendo etanol a 95%. Remova cuidadosamente as lâminas do etanol usando uma pinça curva.Chamas esterilizam cada lamínula e a transferem para um poço de uma placa de 24 poços; o manuseio das lamínulas exige cuidado e prática. Em seguida, adiciona-se 0,5 mililitros de meio de cultura pré-aquecido contendo meio indutor de XEMT. Suplementa-se as células e placa 16.000 células por poço.Agora, cultive e alimente as células conforme descrito anteriormente. Cinco dias após o plaqueamento das células, remova o meio e fixe-as com 300 microlitros por poço de paraformaldeído 4% em PBS 1X, permitindo que a fixação prossiga por 20 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, remova o fixador e lave as células duas vezes com 500 microlitros de PBS 1X por poço.Em seguida, incubar as células fixadas em 400 microlitros de tampão bloqueador por poço durante uma hora à temperatura ambiente. Após aplicar o bloqueio, preparar o anticorpo primário na concentração recomendada pelo fabricante em 400 microlitros de tampão bloqueador por poço. Em seguida, remover a solução de bloqueio dos poços e adicionar a mistura de anticorpos às células.Incube as células por três horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. E se o anticorpo primário estiver diretamente conjugado a um fluorocromo, incube-as no escuro. Em seguida, remova o anticorpo primário e lave os poços três vezes com 500 microlitros por poço de PBS 1X contendo 0,1% de BSA, permitindo que cada lavagem dure cinco minutos e, se necessário, proteja as células da luz.Agora, se necessário, incubar as células com um anticorpo secundário na concentração recomendada pelo fabricante. Diluir o anticorpo em 400 microlitros por poço de PBS 1% BSA. Após uma hora, permitir uma incubação de uma hora à temperatura ambiente, protegida da luz.Lave as células três vezes da mesma forma que foi feito para remover o anticorpo primário após as lavagens. Se desejado, aplique uma coloração contraste DPI às células. Por fim, enxágue as células com água desionizada e monte as lamínulas com a face voltada para baixo sobre lâminas, utilizando meio de montagem.Mais uma vez, tenha cuidado ao manipular as lamínulas. As condições de cultivo indutoras de EMT fornecem um método robusto para a indução de EMT em uma variedade de tipos celulares. Isso foi testado em quatro linhagens celulares humanas diferentes.Células tratadas com o suplemento de meio indutor de MET mudaram de uma morfologia epitelial clássica para uma morfologia alongada mesenquimal. A dupla coloração para expressão de E-caderina e fibronectina demonstrou a regulação negativa do marcador epitelial E-caderina em vermelho e a regulação positiva do marcador mesenquimal fibronectina em verde. Amostras de CF10A não induzidas continham aglomerados compactos cercados por células mais fracamente aderidas. Esses aglomerados eram positivos para E-caderina, mostrados em vermelho.Os agregados desapareceram após o tratamento com o suplemento do meio indutor de EMT. Isso coincidiu com um aumento na expressão de fibronectina em verde. T 98.Verificou-se que G possuía um nível basal extremamente baixo de terrina antes da indução da EMT, o que impediu sua análise. Com este marcador, no entanto, observou-se um aumento significativo nos níveis de fibronectina com a indução da EMT nessas células. Os níveis de expressão de e adere e fibronectina foram ainda confirmados por meio de western blotting de lisados totais de células.Embora o western blot não mostre uma redução significativa nos níveis totais da proteína EAD herrin em células HT 29, houve uma redução na expressão superficial da terrin observada por imunoquímica para avaliar ainda mais o estado de EMT. Marcadores mesenquimais característicos do EMT, menton em verde e snail em vermelho, foram analisados antes e após a indução de EMT, consistente com resultados anteriores. Eki, aqui em cinza, foi regulado negativamente em todas as linhagens celulares examinadas, indicando que o EMT foi induzido. Além disso, houve regulação positiva de snail em vermelho e menton em verde em células 5 49 T 98 G e MCF 10 A. Células CCF sete de câncer de mama humano e células PanIN de carcinoma pancreático humano são ambas relatadas como não entrando em EMT apenas pelo sinal do TGF beta.Esses relatos foram confirmados com TGF beta um recombinante isolado. Na concentração presente no suplemento do meio indutor de MET, as células mantiveram sua morfologia epitelial e os níveis superficiais de E-coerente foram semelhantes aos das células controle. Em contraste, as células estimuladas com o suplemento do meio indutor de MET mostraram uma diminuição acentuada nos níveis superficiais de E-caderina.Essas células também adquiriram uma morfologia mais mesenquimal. Outra característica marcante das células mesenquimais é a sua capacidade de migrar e invadir. Isso foi analisado utilizando o ensaio de invasão celular BME em placa de 96 poços.De acordo com as instruções do fabricante, aumentos significativos na migração celular foram observados tanto em células 5 49 quanto em células pan one. Após a indução de EMT, o mesmo ensaio foi realizado com um filtro revestido com extrato de membrana basal para testar a invasão. As células com EMT induzido mostraram um aumento significativo na capacidade de invasão em comparação com as células não tratadas.A indução robusta de EMT é útil para a análise das alterações na expressão gênica e sinalização que ocorrem nessas células. Um arranjo comercial baseado em anticorpos, utilizando lisados de células MCF seven e a 5 49, foi utilizado para analisar os níveis de fosforilação dos membros da família da quinase MA. Ambos os tipos celulares exibiram aumento da fosforilação de kreb irk um e irk dois em células com EMT induzido, em comparação aos controles.Células A549 também mostraram um aumento na fosforilação da GSK-3β. Células MC7 mostraram aumento na fosforilação da P70S6K, além da fosforilação aumentada da kreb ou um e da DIRK2. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que pode haver alguma variabilidade nos resultados entre diferentes tipos celulares, não todas as células.Utilizamos as mesmas vias a jusante para a indução de EMT, levando a diferenças na expressão de marcadores entre os tipos celulares. Além disso, muitos marcadores de EMT não demonstram estados estritamente ligados e desligados e podem apresentar níveis basais em células epiteliais. Tais marcadores podem mostrar uma intercâmbio aumentado de localização após a transição mesenquimal seguindo este procedimento.Outros métodos, como triagem de fármacos, podem ser utilizados para responder perguntas adicionais, como quais compostos são capazes de modular a transição epitelial para mesenquimal. Esses compostos poderiam ser muito úteis no tratamento de câncer e fibrose.

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Research

JoVE Journal

Biology

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