Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um método simples e reprodutível para a indução da transição epitelial para mesenquimal ou EMT in vitro. Isso é feito primeiro plaqueando o tipo de célula epitelial de interesse na presença do suplemento de mídia indutora de EMT. A segunda etapa do procedimento é substituir os meios de cultura por novos meios de cultura contendo o suplemento EMT Inducing Media três dias após o plaqueamento inicial.

A etapa final é colher células cinco dias após o plaqueamento inicial para caracterização a jusante, como imunocoloração. Em última análise, os resultados podem mostrar células obtendo características mesenquimais por meio de microscopia de luz, imunocitoquímica, matriz de análise de sangue ocidental ou outro procedimento de análise de sua escolha. As principais vantagens desta técnica sobre os métodos existentes, como estimulação beta TGF ou modificação genética, são que este método é rápido e fácil, ao contrário da modificação genética e permite a indução EMT em uma variedade de tipos de células, algumas das quais podem não responder apenas à estimulação beta TGF.

As implicações dessas técnicas se estendem à terapia e ao diagnóstico de metástases de câncer. Essa técnica permite aos pesquisadores a capacidade de desenvolver assinaturas de expressão comum de células metastáticas que podem ser usadas no diagnóstico. Ele também fornece células para serem usadas para triagem de drogas.

Comece aquecendo os meios de cultura para as células de interesse a 37 graus Celsius em banho-maria. Em seguida, colha as células usando uma solução de dissociação, como com triplo E express. Em seguida, suspender as células em meios de cultura pré-aquecidos num tubo cónico de 15 ml e centrifugar a suspensão celular a 400 Gs durante cinco minutos.

Remova cuidadosamente o sobrenadante, despejando-o em um recipiente de resíduos e suspenda o pellet celular em meio de cultura pré-aquecido. Agora conte as células viáveis, dilua uma amostra da suspensão celular em solução azul de 0,4% Triam. Coloque 10 microlitros da amostra diluída em um hemo, citômetro e conte as células viáveis.

Células viáveis. Não fique azul depois de calcular a densidade celular em sua placa de solução. Nove a 10.000 células por centímetro quadrado em meios de cultura pré-aquecidos contendo um suplemento de meio indutor de XEMT usaram placas tratadas com cultura de tecidos ou cultura de frascos.

As células revestidas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono monitoram sua morfologia diariamente usando um microscópio de luz invertida. Três dias depois, substitua o meio por um meio de cultura pré-aquecido fresco contendo um suplemento de meio indutor XEMT. Cinco dias após o plaqueamento, as células estão prontas para análise.

Visualize a morfologia das células sob uma luz invertida As células do microscópio agora podem ser fixadas ou colhidas Para estudos a jusante. Prepare lamínulas estéreis de 12 milímetros para uma placa de 24 poços, colocando lamínulas em uma placa de Petri contendo 95% de etanol. Remova cuidadosamente as lamínulas do etanol usando uma pinça curva.

As chamas esterilizam cada lamínula e transferem para um poço de um manuseio de placa de 24 poços As lamínulas requerem cuidado e prática. Em seguida, com 0,5 mililitros de meios de cultura pré-aquecidos contendo um meio indutor XEMT. Suplemento às células e placa 16.000 células por poço.

Agora cresça e alimente as células conforme descrito anteriormente. Cinco dias após o revestimento das células, remova o meio e fixe-os com 300 microlitros por poço de aldeído paraforme a 4% em um XPBS para permitir que a fixação prossiga por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, remova o fixador e enxágue as células duas vezes com 500 microlitros de um XPBS por poço.

Em seguida, incube as células fixas em 400 microlitros de tampão de bloqueio por poço por uma hora em temperatura ambiente. Após a aplicação do bloqueio, prepare o anticorpo primário na concentração recomendada pelo fabricante em 400 microlitros de tampão de bloqueio por poço. Em seguida, remova a solução em bloco dos poços e adicione a mistura de anticorpos às células.

Incube as células por três horas em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. E se o anticorpo primário estiver diretamente conjugado a um fluorocromo, incube-o no escuro. Em seguida, remova o anticorpo primário e lave os poços três vezes com 500 microlitros por poço de um XPBS contendo 0,1% BSA, deixe cada lavagem durar cinco minutos e, se necessário, proteja as células da luz.

Agora, se necessário, incube as células em um anticorpo secundário na concentração recomendada pelo fabricante. Dilua o anticorpo em 400 microlitros por poço de um XPBS contendo 1% de BSA. Deixe uma incubação de uma hora em temperatura ambiente protegida da luz após uma hora.

Lave as células três vezes, assim como foi feito para remover o anticorpo primário após as lavagens. Se desejar, aplique uma coloração contrária de DPI nas células. Por fim, enxágue as células em água deionizada e monte as lamínulas voltadas para baixo nas lâminas usando mídia de montagem.

Novamente, tenha cuidado ao manusear as lamínulas. As condições de cultura indutoras de EMT fornecem um método robusto para a indução de EMT em uma variedade de tipos de células. Isso foi testado em quatro linhagens celulares humanas diferentes.

As células que foram tratadas com o suplemento de mídia indutora de EMT mudaram de uma morfologia epitelial clássica para uma morfologia em forma de fuso mesenquimal. A coloração dupla para a expressão de caderina e fibronectina demonstrou a regulação negativa do marcador epitelial e caderina em vermelho e a regulação positiva do marcador mesenquimal fibronectina em amostras verdes de CF 10 A não induzidas por continham aglomerados compactados cercados por células mais frouxamente compactadas. Esses clusters foram E aqui positivos mostrados em vermelho.

Os cachos desapareceram após o tratamento com o suplemento de mídia indutora de EMT. Isso coincidiu com um aumento na expressão de fibronectina em verde. T 98.

Verificou-se que G tinha um nível basal extremamente baixo de terrina antes da indução da EMT, o que impediu sua análise. Com esse marcador, no entanto, os níveis de fibronectina aumentaram significativamente com a indução de EMT nessas células. Os níveis de expressão de e adhere e fibronectina foram confirmados por western blotting de lisados celulares totais.

Embora o western blot não mostre redução significativa dos níveis totais de proteína de herrina EAD em células HT 29, houve uma redução na expressão superficial de terrina observada pela Imunoquímica para avaliar ainda mais o status de EMT marcadores mesenquimais característicos de EMT menton em verde e caracol em vermelho foram analisados pré e pós indução de EMT consistentes com resultados anteriores. Eki aqui em cinza foi regulado negativamente em todas as linhagens celulares examinadas, indicando que a EMT foi induzida. Além disso, houve regulação positiva de caracol em vermelho e menton em verde em células 5 49 T 98 G e MCF 10 A CCF sete células de câncer de mama humano e células de carcinoma pancreático humano PanIN são relatadas como não entrando em EMT apenas pela sinalização TGF beta.

Esses relatórios foram confirmados apenas com TGF beta um recombinante. Na concentração dentro do suplemento de mídia indutora de EMT, as células mantiveram sua morfologia epitelial e os níveis coerentes de E de superfície foram semelhantes aos das células controle. Em contraste, as células estimuladas com o suplemento de mídia indutora de EMT mostraram uma diminuição drástica em seus níveis de caderina E de superfície.

Essas células também obtiveram uma morfologia mais mesenquimal. Outra marca registrada das células mesenquimais é sua capacidade de migrar e invadir. Isso foi analisado usando o ensaio de invasão de células BME de 96 poços.

De acordo com as instruções do fabricante, aumentos significativos na migração celular foram observados com células 5 49 e pan one. Após a indução da EMT, o mesmo ensaio foi realizado com um filtro revestido de extrato de membrana basal para testar a invasão. As células induzidas por EMT mostraram um aumento significativo nas capacidades de invasão em comparação com as células não tratadas.

A indução robusta de EMT é útil para a análise de alterações na expressão gênica e sinalização que ocorrem nessas células. Um arranjo comercial baseado em anticorpos usando lisados de MCF sete e 5 49 células foi usado para analisar os níveis de membros da família MA quinase fosforilada. Ambos os tipos de células exibiram aumento da fosforilação de kreb irk um e irk dois em células induzidas por EMT em comparação com os controles.

A 5 49 células também mostrou um aumento na fosforilação beta de GSK três. Mc sete células apresentaram aumento da fosforilação de P 70, S seis K, além do aumento da fosforilação de kreb ou um e DIRK dois. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que pode haver alguma variabilidade nos resultados de diferentes tipos de células, não de todas as células.

Usamos as mesmas vias a jusante para indução de EMT, levando a diferenças na expressão de marcadores entre os tipos de células. Além disso, muitos marcadores de EMT não demonstram estados estritos de ligar e desligar e podem ter níveis basais nas células epiteliais. Tais marcadores podem mostrar um aumento no intercâmbio de localização após a transição mesenquimal Após este procedimento.

Outros métodos, como a triagem de drogas, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como quais compostos são capazes de modular a transição epitelial para mesenquimal. Esses compostos podem ser muito úteis no tratamento de câncer e fibrose.