Um método rápido e eficiente para a purificação de células da endoderme Gerado de células estaminais embrionárias humanas

O objetivo geral deste método é purificar células endodérmicas geradas a partir de células-tronco embrionárias humanas ou células ES. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de células-tronco sobre a diferenciação endodérmica. A principal vantagem desta técnica é que uma população pura de células endodérmicas pode ser obtida após a remoção das células indiferenciadas.

Antes de iniciar o procedimento, recubra placas de cultura celular de seis poços com um mililitro de matriz da membrana basal por poço. Deixe por pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, para colher as células ES humanas, aspire o meio de um cultivo de células-tronco embrionárias humanas com 80 a 90% de confluência utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro estéril.

E lave as células com dois mililitros de PBS por poço. Agite a placa e aspire o líquido salino para remover as células mortas e os detritos. Em seguida, dissocie suavemente os agregados celulares com um mililitro do reagente de passagem livre de enzimas, a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, até que as células apresentem sinais claros de desagregação em agregados menores.

Após cerca de sete minutos, adicione um mililitro de meio DMMF12 aos poços. E pipete para cima e para baixo algumas vezes com uma ponteira de pipeta de um mililitro para destacar os agregados celulares remanescentes, obtendo uma suspensão de células simples. Usando a mesma pipeta, transfira as células para um tubo de centrífuga e enxágue os poços com um mililitro de meio DMMF12 fresco, reunindo as lavagens no tubo.

Após centrifugar as células, re-suspenda o pellet em cinco mililitros de meio de cultura de células ES suplementado com inibidor de ROCK. Conte as células e plaque 1,5:4 vezes 10 à quinta células por poço em placas revestidas com matriz de membrana basal, em meio de cultura suplementado com inibidor de ROCK para prevenir apoptose. Incube as células por aproximadamente 24 horas.

Em seguida, utilize uma pipeta de Pasteur estéril de vidro para substituir o meio em cada poço por 2 mililitros de meio de indução da estria primitiva. Após mais 24 horas de cultivo, substitua o meio por meio de indução de endoderme para uma incubação de 48 horas com trocas diárias do meio. No último dia de cultivo e pelo menos uma hora antes da coleta das células, adicione inibidor de ROCK fresco ao meio de cultura.

Em seguida, utilize uma pipeta de Pasteur estéril de vidro para aspirar o meio de cada um dos poços e dissociar as células com a solução enzimática para passagem, conforme acabou de ser demonstrado. Quando for obtida uma suspensão de células isoladas, conte as células e as centrifugue. Certifique-se de que, a partir deste ponto, todo o meio e tampões contenham o inibidor de ROCK para impedir que as células morram.

Do contrário, eles não serão fixados corretamente após o recuo. Re-suspenda o pellet em 100 microlitros de tampão PEB, suplementado com inibidor de ROCK por 1 vez 10 à sétima células. Em seguida, adicione o anticorpo CXCR4 APC às células.

Agite suavemente o tubo para homogeneizar. Após 15 minutos a 4 graus Celsius, lave as células em um a dois mililitros de tampão PEB e use uma pipeta de Pasteur de vidro estéril para aspirar o sobrenadante. Re-suspenda o pellet em 80 microlitros de tampão PEB por 1 × 10⁷ células e adicione 20 microlitros de microesferas anti-APC ao conjunto celular.

Misture a amostra com movimentos suaves. Em seguida, incube as células a quatro graus Celsius por 15 minutos. Ao final da incubação, lave as células com um a dois mililitros de tampão PEB suplementado com inibidor de ROCK.

E ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão PEB fresco mais inibidor. Para isolar as células CXCR4+ por separação com microesferas magnéticas, coloque uma coluna magnética de tamanho médio em um ímã de tamanho apropriado e pré-lave a coluna com 500 microlitros de tampão PEB mais inibidor de ROCK. Quando toda a solução de lavagem tiver drenado do topo da coluna, aplique todo o volume celular marcado com microesferas magnéticas à coluna, coletando o fluxo que passa em um tubo cônico.

Lave a coluna com três aplicações de 500 microlitros de tampão PEB mais inibidor ROCK. Em seguida, transfira a coluna do ímã para um tubo de coleta apropriado. E empurre um mililitro de tampão PEB mais inibidor ROCK através da coluna para coletar as células CXCR4+.

Opcionalmente, todas as amostras do fluxo passante podem ser coletadas separadamente e alíquotas de 20 microlitros de cada amostra podem ser usadas para determinar a porcentagem de células CXCR4+ em cada alíquota por citometria de fluxo. Este procedimento pode ser repetido com o primeiro fluxo passante para coletar células que não se ligaram à coluna. Em seguida, reúna todas as amostras aliquotadas de CXCR4+ e centrifugue-as.

Por fim, re-suspenda o pellet em um mililitro de meio de indução de endoderme suplementado com inibidor de ROCK e semeie as células na densidade apropriada em um recipiente de cultura celular revestido com matriz de membrana basal. Antes de sua diferenciação, as células-tronco embrionárias humanas expressam altos níveis do marcador de pluripotência SOX2. Por outro lado, o marcador de endoderme definitivo, FOXA2, não é detectado.

Após a diferenciação, as células ES sofrem mudanças drásticas na expressão de seus genes e proteínas. De fato, após quatro dias em meio de diferenciação, SOX17 e FOXA2 são coexpressos uniformemente dentro dos núcleos de muitas das células ES anteriores, uma característica marcante do comprometimento com o endoderma definitivo. Algumas células resistem ao processo de diferenciação, não expressando nenhuma das duas proteínas marcadoras.

E, de fato, mantêm a expressão do marcador de pluripotência SOX2. Neste experimento representativo, no terceiro dia de diferenciação, cerca de 60% das células-tronco embrionárias colhidas expressavam CXCR4, cuja pureza foi enriquecida para mais de 85% após o isolamento por microesferas magnéticas das células pluripotentes e de outras linhagens indesejadas. Após o cultivo das células CXCR4+ purificadas, apenas algumas células SOX2+ são detectadas, sendo que a maioria das células semeadas expressa FOXA2.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em até duas horas, se realizada corretamente. Após este procedimento, outras técnicas semelhantes, como imunohistoquímica ou QPCR, podem ser realizadas para responder perguntas adicionais sobre o processo de diferenciação. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como purificar células de endoderme por meio de separação magnética com microesferas.