Um método rápido e eficiente para a purificação de células da endoderme Gerado de células estaminais embrionárias humanas

O objetivo geral deste método é purificar as células endodérmicas geradas a partir de células-tronco embrionárias humanas ou células ES. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das células-tronco sobre a diferenciação endodérmica. A principal vantagem desta técnica é que uma população pura de células endodérmicas pode ser obtida após a remoção de células indiferenciadas.

Antes de iniciar o procedimento, cubra seis placas de cultura de células de poço com um mililitro de matriz de membrana basal por poço. Por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, para colher as células ES humanas, aspire o meio de uma cultura de células-tronco embrionárias humanas 80 a 90% confluentes com uma pipeta de pastagem de vidro estéril.

E lave as células com dois mililitros de PBS por poço. Agitando a placa e aspirando a solução salina para remover as células mortas e detritos. Em seguida, dissocie suavemente os aglomerados de células com um mililitro de reagente de solução de passagem sem enzimas, a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, até que as células exibam sinais claros de ruptura em aglomerados menores.

Após cerca de sete minutos, adicione um mililitro de meio DMMF12 aos poços. E pipete para cima e para baixo algumas vezes com uma ponta de pipeta de um mililitro para separar os agregados celulares restantes em uma única suspensão celular. Usando a mesma pipeta, transfira as células para um tubo de centrifugação e lave os poços com um mililitro de meio DMMF12 fresco, acumulando as lavagens no tubo.

Depois de girar as células, ressuspenda o pellet em cinco mililitros de meio de cultura de células ES suplementado com inibidor de ROCK. Conte as células e semeie 1,5: 4 vezes 10 até o quinto células por poço nas placas revestidas com matriz da membrana basal em meio de cultura suplementado com inibidor de ROCK para evitar a apoptose. Incubar as células por aproximadamente 24 horas.

Em seguida, use uma pipeta Pasteur de vidro estéril para substituir o meio em cada poço por 2 mililitros de meio de indução de estrias primitivas. Após mais 24 horas de cultura, substitua o meio por meio de indução endoderme para uma incubação de 48 horas com trocas diárias de meio. No último dia de cultura e pelo menos uma hora antes da colheita das células, adicione um inibidor de ROCK fresco ao meio de cultura.

Em seguida, use uma pipeta Pasteur de vidro estéril para aspirar o meio de cada um dos poços e dissociar as células com o reagente de solução de passagem sem enzimas, como acabamos de demonstrar. Quando uma suspensão unicelular for alcançada, conte as células e centrifugue-as. Certifique-se de que, a partir deste ponto, todos os meios e tampões contenham o inibidor de ROCK para evitar que as células morram.

Caso contrário, eles não serão fixados corretamente após recuar. Ressuspenda o pellet em 100 microlitros de tampão PEB, suplementado com inibidor de ROCK por 1 vezes 10 para as sétimas células. Em seguida, adicione o anticorpo CXCR4 APC às células.

Agitando suavemente o tubo para misturar. Após 15 minutos a 4 graus Celsius, lave as células em um a dois mililitros de tampão PEB e use uma pipeta Pasteur de vidro estéril para aspirar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 80 microlitros de tampão PEB por 1 vezes 10 para as sétimas células e adicione 20 microlitros de microesferas anti-APC às células.

Misture a amostra com movimentos suaves. Em seguida, incube as células a quatro graus Celsius por 15 minutos. No final da incubação, lave as células com um a dois mililitros de tampão PEB suplementado com inibidor de ROCK.

E ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão PEB fresco mais inibidor. Para isolar as células CXCR4+ por separação de esferas magnéticas, carregue uma coluna magnética de tamanho médio em um ímã de tamanho apropriado e pré-enxágue a coluna com tampão PEB de 500 microlitros mais inibidor de ROCK. Quando toda a lavagem tiver sido drenada do topo da coluna, aplique todo o volume da célula rotulada com grânulo magnético na coluna, coletando o fluxo em um tubo cônico.

Lave a coluna com três aplicações de 500 microlitros de tampão PEB mais inibidor de ROCK. Em seguida, transfira a coluna do ímã para um tubo de coleta adequado. E mergulhe um mililitro de tampão PEB mais inibidor de ROCK através da coluna para coletar as células CXCR4+.

Opcionalmente, todas as amostras de fluxo podem ser coletadas separadamente e alíquotas de 20 microlitros de cada amostra podem ser usadas para determinar a porcentagem de células CXCR4+ em cada aluta por citometria de fluxo. Este procedimento pode ser repetido com o primeiro fluxo para coletar células que não se ligaram à coluna. Em seguida, agrupe as duas amostras CXCR4 + alocadas e centrifugue-as.

Finalmente, ressuspenda o pellet em um mililitro de meio de indução endoderma suplementado com inibidor de ROCK e semeie as células na densidade apropriada em um recipiente de cultura de células revestido com matriz de membrana basal. Antes de sua diferenciação, as células ES humanas expressam altos níveis do marcador de pluripotência SOX2. Considerando que, o marcador endodérmico definitivo, FOXA2 não é detectado.

Após a diferenciação, as células ES sofrem mudanças drásticas em sua expressão gênica e proteica. De fato, após quatro dias em meio de diferenciação, SOX17 e FOXA2 são co-expressos uniformemente dentro dos núcleos de muitas das antigas células ES, uma marca registrada do comprometimento definitivo do endoderme. Algumas células resistem ao processo de diferenciação, não expressando nenhuma das duas proteínas marcadoras.

E, de fato, mantêm sua expressão de SOX2 do marcador de pluripotência. Neste experimento representativo, no terceiro dia de diferenciação, quase 60% das células ES colhidas expressaram CXCR4, cuja pureza foi enriquecida a mais de 85% após a classificação magnética das células pluripotentes e de outras linhagens indesejadas. Após a semeadura das células CXCR4+ purificadas, apenas algumas células SOX2+ são detectadas, com a maioria das células semeadas expressando FOXA2.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em duas horas, se executada corretamente. Após este procedimento, outros como histoquímica imunológica ou QPCR podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre o processo de diferenciação. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como purificar as células endodérmicas por classificação magnética de contas.