Name: Um método rápido e eficiente para a purificação de células da endoderme Gerado de células estaminais embrionárias humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprenda a purificar células da endoderme a partir de células estaminais embrionárias humanas usando separação por imã. Este método remove células não diferenciadas para obter populações puras.

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1. Diferenciação de ESC Humano para o Endoderma Definitive <ol><li> Cultivar as células estaminais embrionárias humanas (CES) em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Revestimento um novo 6 poços da placa de cultura de células com 1 ml de uma matriz de membrana basal e incubar a cultura-louças durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente. Para obter detalhes específicos por favor, ligue com as instruções dos respectivos fabricantes. </li><li> Confirmar que os CES humanas cultivadas atingiram 80% -90% de confluência ao microscópio utilizando uma ampliação baixa (por exemplo, 4X). Aspirar o meio das cavidades por sucção fora o meio com uma pipeta de Pasteur de vidro estéril. Lavar as células uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Por isso, adicionar 2 ml de PBS a cada poço suavemente agitar a placa e chupam a solução para remover as células mortas e detritos celulares. </li><li> Adicionar 1 ml de reagente solução passaging livre de enzima para a dissociação suave de grupos de células. Incubar as células a 37 ° C, umd 5% de CO 2 até que as células apresentam sinais claros de perturbações de agregados de pequenas. NOTA: O tempo de incubação depende do reagente utilizado. Para a solução Passaging isento de enzimas mencionados na secção de materiais, o tempo de incubação é de cerca de 7 minutos. </li><li> Adicionar 1 ml de DMEM meio F-12 / e perturbar os agregados de células remanescentes em células individuais pipetando para cima e para baixo usando uma pipeta de 1 ml de ponta. Utilizar esta para lavar as células a partir da superfície e transferência das células para um tubo de centrifugação. Para obter todas as células, lavagem de cada poço com 1 ml de meio DMEM / F-12 e adicionar o meio ao tubo de centrifugação. </li><li> Centrifugar as células durante 5 min a 300 x g. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 ml de meio de cultura de células ES contendo 10 uM de inibidor a Rho-cinase (ROCHA). </li><li> Contar as células ao microscópio usando um hemocitómetro e sementes 150.000 - 400.000 células por 6 poços ou em outra disposição de placa, dependendo da linha de células ES utilizadas. Use culture meio contendo inibidor ROCHA 10 uM para evitar apoptose e cultivar as células em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Aproximadamente 24 horas após a sementeira Aspirar o meio com uma pipeta de Pasteur de vidro estéril e adicionar 2 ml de meio de indução linha primitiva. NOTA: Este meio contém concentrações finais de 1% de glutamina, 0,2% de FCS, 5 uM e CHIR-99021 50 ng / ml de activina A em meio RPMI-1640 avançada. Geralmente, utilizar 2 ml de meio de cultura em placas de 6 poços. </li><li> 48 horas após a semeadura, substitua a médio e endoderme meio de indução. Cultivar as células neste meio durante mais 48 horas com troca de meio por dia. NOTA: Este meio contém 1% de glutamina, 0,2% de FCS e 50 ng / ml de activina A em meio RPMI-1640 avançada. As células que estão comprometidos para a endoderme definitiva expressam o marcador de superfície CXCR4. A coloração de CXCR4 pode ser utilizado para quantificar o número de células anuladas. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Coloração de CXCR4 + endoderme definitivo Células para Análise de Citometria de Fluxo <ol><li> Para o final de 24 horas, mas, pelo menos, 1 hora antes da colheita das células adicionar inibidor ROCHA 10 uM para o meio de cultura. </li><li> Revestir a cultura de células-louças que vai ser utilizado para re-sementeira com uma matriz de membrana basal, ou seja, placas de 12 poços para análise ou câmara de lâminas qPCR para coloração por imunofluorescência. Incubar as placas ou lâminas durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar o meio com uma pipeta de Pasteur de vidro estéril a partir dos poços das células diferenciadas utilizados para a coloração e / ou classificação. </li><li> Adicionar 1 ml de reagente solução passaging livre de enzima para a dissociação suave de grupos de células. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 até que as células apresentam sinais claros de ruptura em pequenos aglomerados. NOTA: O tempo de incubação depende do reagente utilizado. Para a solução Passaging livre de enzima mencionada no materiseção de als, o tempo de incubação é de cerca de 7 min. </li><li> Adicione 1 ml meio DMEM / F-12 e perturbar restantes agregados de células em células individuais pipetando cima e para baixo usando uma ponta de 1 ml. Utilizar esta para lavar as células a partir da superfície e transferência das células para um tubo de centrifugação. Para obter todas as células, lavar cada cavidade com 1 mL de meio DMEM / F-12 w / o FCS e adicionar o meio ao tubo de centrifugação. </li><li> Contar as células ao microscópio utilizando um hemocitômetro. As células a partir de três cavidades de uma placa de 6 poços deve resultar em 10-15 x 10 6 células após três dias de diferenciação. Centrifugar as células durante 5 min a 300 x g. NOTA: O número exato de células obtidas dependerá da linha de células pluripotentes utilizado para a diferenciação. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em tampão de PEB contendo 10 uM de inibidor ROCHA. Utilizar 100 ul desta tampão durante até 10 7 células. Adicionar o inibidor ROCHA 10 pM no dia da staining. Utilize este tampão para todas as aplicações a jusante (referido como tampão PEB + RI). NOTA: PEB tampão contém 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM em PBS. Se mais células são para ser corado, ajustar o volume de tampão em conformidade. </li><li> Adicionar 10 uL de um anticorpo CXCR4-APC por 10 7 células em 100 ul, isto representa aproximadamente uma diluição de 1:10. Nota: O uso de um anticorpo de APC-ligado não é obrigatória. Em vez disso, pode ser substituído de acordo com as micropérolas usadas. Se mais células são para ser coradas ajustar o volume de anticorpo em conformidade. </li><li> Misturar suavemente invertendo o tubo com os dedos e incubar a 4 ° C num frigorífico durante 15 min. Ressuspender as células com 1-2 ml de tampão de PEB. Centrifugar as células durante 5 min a 300 x g. </li><li> Aspirar o sobrenadante com uma pipeta Pasteur de vidro estéril e ressuspender o sedimento celular em 80 ul de PEB por 10 7 células e adicionar 20 ul microesferas anti-APC. NOTA: </strong&gt; Se mais células estão a ser manchado, ajustar o volume micro-esferas em conformidade. </li><li> Misturar suavemente invertendo o tubo com os dedos e incubar a 4 ° C num frigorífico durante 15 min. Volte a suspender as células com 1-2 ml de tampão PEB + RI. Centrifugar as células durante 5 min a 300 x g. Aspirar o tampão. Ressuspender em 500 ul de tampão PEB + RI. </li></ol> 3. Separação Magnética de CXCR4 + Células <ol><li> Coloque uma coluna magnética tamanho médio em um campo magnético, conforme as instruções de fabricação. Pré-lavar a coluna com tampão de 500 ul PEB + RI. Aplicar a suspensão de célula inteira para a coluna. Recolhe-se o fluxo através de células uma vez que nem todos se ligam à coluna. Certifique-se para não perturbar as colunas para a recuperação ideal de células CXCR4 +. </li><li> Lava-se a coluna três vezes com tampão de PEB 500 ul + RI. Recolher o primeiro fluxo através de e combiná-lo com as células coletadas de Passo 3.1. Retirar a coluna magnético do campo magnético e coloca-se numatubo de recolha adequado. Adicionar 1 ml de tampão de PEB + RI na coluna. Para eluir as células firmemente pressionar para baixo o êmbolo para dentro da coluna. </li><li> Opcional: Recolha todo o fluxo através de amostras separadamente e usar 20 l cada, para analisar o número de células CXCR4 + utilizando citometria de fluxo. Seu número deve diminuir com cada etapa de lavagem. NOTA: Pelo menos 2 x 10 4 viável, células fechadas deve ser contado para resultados confiáveis. </li><li> Repita os passos 3,1-3,3 com o fluxo coletados por meio de amostra do Passo 3.1 e o primeiro fluxo através da amostra a partir do passo 3.2 utilizando uma nova coluna. Não re-utilizar a coluna anterior. Ao utilizar o ar êmbolo é pressionado para a coluna, o que bloqueia. </li><li> Contar as células ao microscópio utilizando um hemocitômetro. Dependendo da eficiência da diferenciação até 6 x 10 6 células podem ser classificados inicialmente e mais 1 x 10 6 células, utilizando uma segunda coluna ao utilizar 10 7 células para o procedimento. </li&gt; <li> Centrifugar as células a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e com uma pipeta de Pasteur de vidro estéril e ressuspender as células em 1 ml de meio de indução endoderme do Passo 1.9, com inibidor adicional ROCHA 10 uM. </li><li> Contar as células ao microscópio utilizando um hemocitômetro. Semear as células a uma densidade adequada, isto é, ~ 4 x 10 5 células por poço de uma placa de 12 poços (app. 3,6 cm2 de superfície) ou ~ 1,5 x 10 5 células por poço de um de 8 poços câmara de corrediça. </li></ol> 4. Opcional: Análise de Purificada População Endoderma Definitive <ol><li> Para coloração por imunofluorescência fixar as células purificada do passo 3.7 aproximadamente 24 horas após a sementeira com paraformaldeído a 4% e de manchas de endoderme definitivo (DE) e / ou proteínas marcadoras pluripotência. NOTA: normalmente usado DE marcadores incluem Foxa2 e Sox17, marcadores de pluripotência comumente usados ​​incluem OCT3 / 4, NANOG e SOX2 6, 8. </li><li> foR análise de RT-qPCR, a colheita das células purificadas directamente ou 24 horas após a sementeira, extrato total de ARN e a transcrição reversa de ADNc a partir das amostras de ARN total de-extraídos. Use 10 cDNA ng como modelo por reacção RT-qPCR (triplicado) para analisar a expressão de DE e genes pluripotência marcador 6, 8. NOTA: genes marcadores comumente usados ​​são mencionados no Passo 4.1. As condições de ciclo são 5 min a 95 ° C e 40 ciclos de 15 seg a 95 ° C e 1 min a 60 ° C, seguido de análise da curva de fusão. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

protocolos de diferenciação utilizados actualmente raramente resultam em células diferenciadas 100%. Por razões que ainda têm de ser abordadas algumas células resistir ao processo de diferenciação. Dependendo da eficiência do protocolo utilizado diferenciação e a propensão do CES alinhar um certo número de células pluripotentes residuais são vulgarmente observadas mesmo após a diferenciação em endoderme definitiva. Estas células residuais pode prejudicar diferenciações a jusante ou uma análise mais aprofundada, como tra...

As células estaminais pluripotentes, tais como células estaminais embrionárias (CES) têm a capacidade de se diferenciar em virtualmente qualquer tipo de células do corpo humano. Assim, os protocolos in vitro de diferenciação podem ser usadas para gerar numerosos tipos de células, tais como adultos cardiomiócitos 1, 2 hepatócitos, células beta 3, 4 ou epitelial de pulmão de células neuronais 5. Isso faz com que os CES uma ferramenta valiosa para o tratamento potencial de várias doenças degenerativas 3. A diferenciação in vitro dos CES no sentido de tecidos adultos do pulmão, fígado e pâncreas requer um pseudo-gastrulação em células reminiscentes da endoderme definitivo (DE) 6. Uma vez que a diferenciação em direcção a jusante dos tipos de células somáticas atrás referidos é significativamente menos eficiente, uma endoderme diferenciação óptima é considerada como a taxa de limitação 7. As células que estão comprometidos para com a linhagem endoderme submeter chamudanças racteristic em seu perfil de expressão gênica. Genes reguladores mestre pluripotência são regulados negativamente, enquanto que a expressão de outros factores de transcrição tais como Foxa2, Sox17, HNF1B, membros da família GATA e o receptor da superfície CXCR4 é altamente regulada positivamente 6, 8, 9. CXCR4 é conhecido por ser transactivado por Smad2 / 3, a jusante de sinalização Nodal / TGF-β e Sox17 devido a locais de ligação específicos na sua região promotora 10. Assim, é um marcador muito adequado utilizado num certo número de relatórios de 6, 8, 11-13. Estas mudanças de expressão reflete um evento pseudo-gastrulação, em que os CES primeiro adquirir características de uma população de células streak-like primitivo e posteriormente comprometer na camada germinativa endoderme 6. No entanto, os protocolos de diferenciação são raramente de 100% eficiente como algumas células podem resistir ao processo de diferenciação ou diferenciar em relação a outras linhagens não intencionais 14. Estas células podem Influe negativamentemaior diferenciação nce. Além disso, as células indiferenciadas residuais abrigar grandes riscos para experiências de transplante mais tarde e pode dar origem a teratomas 15-17. Para remover estas células indesejadas cedo-CXCR4 na superfície marcador pode ser utilizado para a purificação de células que estão comprometidos para a DE 18. Aqui, nós descrevemos um método para a selecção positiva de células CXCR4 + a partir de culturas de diferenciação de ED. Para isso, o CXCR4 marcador de superfície está ligada por um anticorpo o qual, em seguida, por sua vez, liga-se a microesferas magnéticas. Ao contrário das condições adversas durante a separação por FACS, as células como DE-magneticamente marcadas podem então ser facilmente purificadas em um formato de bancada utilizando um método de purificação suave. Este protocolo proporciona um método simples para a remoção das populações de células que resistiram ao processo de diferenciação DE.

<table><tbody><tr><td>Linha de células-tronco embrionárias humanas Hues8</td><td>Harvard Departamento de células-tronco e biologia</td><td></td> regenerativa <td>Linha celular adequada para geração de endoderme</td></tr><tr><td>Linha de células-tronco embrionárias humanas Hes3</td><td>ES Cell International</td><td></td><td>Linha celular adequada e robusta para geração de endoderme</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td>ESC meio de cultura</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biowest</td><td>S1860</td><td></td></tr><tr><td>Advanced RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>CD184 (CXCR4)-APC, humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-357</td><td></td></tr><tr><td>anti-APC MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Separador OctoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>campo magnético</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td>inibidor de ROCK</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de Dissociação Celular Suave</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7174</td><td>Sem enzimas solução de passagem, alternativa: Matriz de tripsina / EDTA</td></tr><tr><td>* Matriz</td> de membrana basal <td>de 354277</td> <td>Corning</td><td> * resolver e armazenar em alíquotas a -80 &deg; C conforme descrito no manual do fornecedor. Após o uso, descongele no gelo, dilua em 25 ml de nocaute gelado DMEM/F-12. Adicione 1 ml a cada poço de uma placa de 6 poços e incube por 45 min em temperatura ambiente. Remova o matrigel e use imediatamente. </td></tr><tr><td>Separador MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>30-042-201</td><td></td>da MS</tr><tr><td></td><td>Columns Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt</td><td>Life Tecnologias</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOX17 Ensaio TaqMan</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs00751752_s1</td><td></td></tr><tr><td>Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humano POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humano POU5F1 REV ctgcagtgtgggtgtcgggca</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t </td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17320</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FOXA2</td><td>MerckMillipore</td><td>07-633</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX17</td><td>R& D Systems</td><td>AF1924</td><td></td></tr></tbody></table>

um método rápido e eficiente para a purificação de células da endoderme gerado de células estaminais embrionárias humanas

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

As capacidades de diferenciação de células estaminais pluripotentes, tais como células estaminais embrionárias (CES) permitem uma aplicação terapêutica potencial para terapias de substituição de células. Terminalmente tipos de células diferenciadas pode ser utilizado para o tratamento de várias doenças degenerativas. Diferenciação in vitro destas células no sentido de tecidos do pulmão, fígado e pâncreas requer como um primeiro passo na geração de células da endoderme definitivas. Este passo é para a posterior diferenciação em direcção tipos de células terminalmente maturados tais como células beta produtoras de insulina, hepatócitos, ou outros tipos de células derivadas de endoderme limitante da velocidade. As células que são comprometidas com a linhagem endoderme altamente expressar uma grande variedade de factores de transcrição, tais como Foxa2, Sox17, HNF1B, membros da família GATA, e o receptor da superfície CXCR4. No entanto, os protocolos de diferenciação são raramente de 100% eficiente. Aqui, nós descrevemos um método para a purificação de uma população de células CXCR4 + após a diferenciaçãona DE usando microesferas magnéticas. Esta purificação remove adicionalmente células de linhagens indesejados. O método de purificação suave é rápido e fiável e pode ser usado para melhorar as aplicações a jusante e diferenciações.

Após a diferenciação CES sofrer alterações drásticas no gene e a expressão da proteína. A Figura 1 representa genes marcadores típicos que podem ser utilizados para verificar uma diferenciação endoderme bem sucedida. Alvos principais para a análise de expressão gênica são GSC, Foxa2 e Sox17. Em uma análise de expressão gênica relativa especialmente Foxa2 e Sox17 são aumentados em&gt; 2.000 vezes quando compa...

Aqui, descrevemos um método para a purificação de células-tronco embrionárias humanas diferenciadas que estão comprometidos para a endoderme definitiva para a melhoria das aplicações a jusante e outras diferenciações.

Um método rápido e eficiente para a purificação de células da endoderme Gerado de células estaminais embrionárias humanas

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

O objetivo geral deste método é purificar células endodérmicas geradas a partir de células-tronco embrionárias humanas ou células ES. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de células-tronco sobre a diferenciação endodérmica. A principal vantagem desta técnica é que uma população pura de células endodérmicas pode ser obtida após a remoção das células indiferenciadas.Antes de iniciar o procedimento, recubra placas de cultura celular de seis poços com um mililitro de matriz da membrana basal por poço. Deixe por pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, para colher as células ES humanas, aspire o meio de um cultivo de células-tronco embrionárias humanas com 80 a 90% de confluência utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro estéril.E lave as células com dois mililitros de PBS por poço. Agite a placa e aspire o líquido salino para remover as células mortas e os detritos. Em seguida, dissocie suavemente os agregados celulares com um mililitro do reagente de passagem livre de enzimas, a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, até que as células apresentem sinais claros de desagregação em agregados menores.Após cerca de sete minutos, adicione um mililitro de meio DMMF12 aos poços. E pipete para cima e para baixo algumas vezes com uma ponteira de pipeta de um mililitro para destacar os agregados celulares remanescentes, obtendo uma suspensão de células simples. Usando a mesma pipeta, transfira as células para um tubo de centrífuga e enxágue os poços com um mililitro de meio DMMF12 fresco, reunindo as lavagens no tubo.Após centrifugar as células, re-suspenda o pellet em cinco mililitros de meio de cultura de células ES suplementado com inibidor de ROCK. Conte as células e plaque 1,5:4 vezes 10 à quinta células por poço em placas revestidas com matriz de membrana basal, em meio de cultura suplementado com inibidor de ROCK para prevenir apoptose. Incube as células por aproximadamente 24 horas.Em seguida, utilize uma pipeta de Pasteur estéril de vidro para substituir o meio em cada poço por 2 mililitros de meio de indução da estria primitiva. Após mais 24 horas de cultivo, substitua o meio por meio de indução de endoderme para uma incubação de 48 horas com trocas diárias do meio. No último dia de cultivo e pelo menos uma hora antes da coleta das células, adicione inibidor de ROCK fresco ao meio de cultura.Em seguida, utilize uma pipeta de Pasteur estéril de vidro para aspirar o meio de cada um dos poços e dissociar as células com a solução enzimática para passagem, conforme acabou de ser demonstrado. Quando for obtida uma suspensão de células isoladas, conte as células e as centrifugue. Certifique-se de que, a partir deste ponto, todo o meio e tampões contenham o inibidor de ROCK para impedir que as células morram.Do contrário, eles não serão fixados corretamente após o recuo. Re-suspenda o pellet em 100 microlitros de tampão PEB, suplementado com inibidor de ROCK por 1 vez 10 à sétima células. Em seguida, adicione o anticorpo CXCR4 APC às células.Agite suavemente o tubo para homogeneizar. Após 15 minutos a 4 graus Celsius, lave as células em um a dois mililitros de tampão PEB e use uma pipeta de Pasteur de vidro estéril para aspirar o sobrenadante. Re-suspenda o pellet em 80 microlitros de tampão PEB por 1 × 10⁷ células e adicione 20 microlitros de microesferas anti-APC ao conjunto celular.Misture a amostra com movimentos suaves. Em seguida, incube as células a quatro graus Celsius por 15 minutos. Ao final da incubação, lave as células com um a dois mililitros de tampão PEB suplementado com inibidor de ROCK.E ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão PEB fresco mais inibidor. Para isolar as células CXCR4+ por separação com microesferas magnéticas, coloque uma coluna magnética de tamanho médio em um ímã de tamanho apropriado e pré-lave a coluna com 500 microlitros de tampão PEB mais inibidor de ROCK. Quando toda a solução de lavagem tiver drenado do topo da coluna, aplique todo o volume celular marcado com microesferas magnéticas à coluna, coletando o fluxo que passa em um tubo cônico.Lave a coluna com três aplicações de 500 microlitros de tampão PEB mais inibidor ROCK. Em seguida, transfira a coluna do ímã para um tubo de coleta apropriado. E empurre um mililitro de tampão PEB mais inibidor ROCK através da coluna para coletar as células CXCR4+.Opcionalmente, todas as amostras do fluxo passante podem ser coletadas separadamente e alíquotas de 20 microlitros de cada amostra podem ser usadas para determinar a porcentagem de células CXCR4+ em cada alíquota por citometria de fluxo. Este procedimento pode ser repetido com o primeiro fluxo passante para coletar células que não se ligaram à coluna. Em seguida, reúna todas as amostras aliquotadas de CXCR4+ e centrifugue-as.Por fim, re-suspenda o pellet em um mililitro de meio de indução de endoderme suplementado com inibidor de ROCK e semeie as células na densidade apropriada em um recipiente de cultura celular revestido com matriz de membrana basal. Antes de sua diferenciação, as células-tronco embrionárias humanas expressam altos níveis do marcador de pluripotência SOX2. Por outro lado, o marcador de endoderme definitivo, FOXA2, não é detectado.Após a diferenciação, as células ES sofrem mudanças drásticas na expressão de seus genes e proteínas. De fato, após quatro dias em meio de diferenciação, SOX17 e FOXA2 são coexpressos uniformemente dentro dos núcleos de muitas das células ES anteriores, uma característica marcante do comprometimento com o endoderma definitivo. Algumas células resistem ao processo de diferenciação, não expressando nenhuma das duas proteínas marcadoras.E, de fato, mantêm a expressão do marcador de pluripotência SOX2. Neste experimento representativo, no terceiro dia de diferenciação, cerca de 60% das células-tronco embrionárias colhidas expressavam CXCR4, cuja pureza foi enriquecida para mais de 85% após o isolamento por microesferas magnéticas das células pluripotentes e de outras linhagens indesejadas. Após o cultivo das células CXCR4+ purificadas, apenas algumas células SOX2+ são detectadas, sendo que a maioria das células semeadas expressa FOXA2.Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em até duas horas, se realizada corretamente. Após este procedimento, outras técnicas semelhantes, como imunohistoquímica ou QPCR, podem ser realizadas para responder perguntas adicionais sobre o processo de diferenciação. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como purificar células de endoderme por meio de separação magnética com microesferas.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

A capacidade de células estaminais embrionárias humanas para a auto-renovar e diferenciar em todos os tipos de células do corpo sugere que eles são uma grande promessa para aplicações médicas e como ferramenta de pesquisa para abordar questões fundamentais no desenvolvimento e na doença. Aqui, fornecemos uma concisa, protocolo passo a passo para a derivação de células estaminais embrionárias humanas a partir de embriões pelo isolamento immunosurgical da massa celular interna.

Derivação de células estaminais embrionárias humanas por Immunosurgery

Este artigo incidirá sobre a geração de endoderme hepática humana de populações humanas de células-tronco embrionárias.

Geração robusto de Hepatócito-like Células de populações humanas células-tronco embrionárias

Apesar dos esforços em curso para as culturas de transição para a alimentação livres de condições, a derivação ea cultura de células estaminais embrionárias humanas (CTEh) permanecem em grande parte dependente de co-culturas com alimentadores embrionárias (MEFs). Aqui, mostramos uma nova metodologia para a rápida remoção de alimentadores de culturas CTEh antes da experimentação.

A remoção rápida de fibroblastos de Alta Densidade Humanos culturas de células estaminais embrionárias

Descrevemos o uso dos anticorpos monoclonais TG30 (CD9) e GCTM-2 para a detecção combinada de antígenos da superfície celular via fluorescência ativada de classificação celular (FACS) para a identificação e enriquecimento de células-tronco embrionárias humanas vivas (hESC) utilizando seleção positiva e também o uso de seleção negativa para expurgar hESCs de uma população de células mistas.

Enriquecimento e purgação de células-tronco embrionárias humanas pela detecção de antígenos da superfície celular usando os anticorpos monoclonais TG30 e GCTM-2

Este protocolo eficiente dirige rato estaminais embrionárias endoderme definitivo de células-derivadas para amadurecer as células epiteliais das vias respiratórias. Esta técnica utiliza a diferenciação 3-dimensionais andaimes pulmonares descelularizados para dirigir especificação das linhagens celulares de pulmão, em, uma configuração de cultura isento de soro definido.

Geração de células de camundongo Airway epiteliais derivados de ESC Usando descelularizado Lung Scaffolds

células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) tem a capacidade intrínseca de se diferenciar e se auto-organizam em padrões de tecidos distintos; embora isso exige a apresentação de gradientes ambientais espaciais. Apresentamos stencil micropatterning como um método simples e robusto para gerar gradientes bioquímicas e mecânicas para controlar os padrões de diferenciação HPSC.

Stencil micropatterning de células-tronco pluripotentes humana para sondar organização espacial de diferenciação Fates

Apresentado aqui é um protocolo para a geração de uma cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas e sua diferenciação subseqüente em células progenitoras neurais. O protocolo é simples, robusto, escalável e adequado para rastreamento de medicamentos e aplicações de medicina regenerativa.

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em células funcionais semelhantes a hepatócitos (HLCs) complementando continuamente a Activina A e CHIR99021 durante a diferenciação do HESC em endóderme definitivo (DE).

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Para evitar as limitações associadas à passagem enzimática ou mecânica de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) cultivadas em células alimentadoras, estabelecemos um método rápido, eficaz, econômico e de alto rendimento para a colheita de colônias hESC ou hiPSC mantidas em uma camada de células alimentadoras de fibroblastos de prepúcio humano usando desadesão mediada por EDTA.

Passagem rápida, econômica e livre de enzimas de células-tronco pluripotentes humanas em células alimentadoras por adesão mediada pelo ácido etilenodiaminotetracético

O presente protocolo mostra como diferenciar células CD3−/CD45+CD56+ com citotoxicidade leve de células-tronco potenciais expandidas humanas (hEPSCs) em condições de cultura 3D e 2D. Isso permite a validação fenotípica de rotina sem a destruição do microambiente complexo.

Geração de células assassinas naturais a partir de células-tronco de potencial expandido humano

Este protocolo descreve a geração de organoides hepáticos endodérmicos rápidos e reprodutíveis (eHEPOs). Com este protocolo, os eHEPOs podem ser produzidos em 2 semanas e expandir a longo prazo (mais de 1 ano) sem perder sua diferenciação e funcionalidade.

Geração de Organoides Hepáticos Endodérmicos Funcionais

Aprenda a purificar células da endoderme a partir de células estaminais embrionárias humanas usando separação por imã. Este método remove células não diferenciadas para obter populações puras.

Um método rápido e eficiente para a purificação de células da endoderme Gerado de células estaminais embrionárias humanas

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