Name: Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprenda a realizar gravações de patch-clamp de célula inteira em fatias de cérebro frescas. Esta técnica permite estudar o comportamento elétrico de neurônios e avaliar funções neuronais em circuitos cerebrais intactos.

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Esta pesquisa foi apoiada por fundos de inicialização UT Southwestern (SK).

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Nenhum dos autores tem interesses concorrentes ou interesses conflitantes.

Este protocolo descreve o procedimento básico para a realização de experiências de célula inteira de patch-clamp em neurónios em fatias de cérebro. No entanto, a complexidade, o potencial e sensibilidade desta técnica não pode ser totalmente descrito neste artigo. Aqui, tentamos delinear os passos mais básicos e sublinhado parâmetros importantes que devem ser controlados para alcançar gravações de células inteiras de sucesso e rigorosos. Para mais aprendizado teórico, muitos livros e artigos foram publicados em ambas de...

A técnica de patch-clamp, uma técnica eletrofisiológica que tem sido desenvolvido no final de 1970 1,2, é a principal ferramenta para o estudo de funções de canal de iões simples ou múltiplas no tecido vivo. Entre as diferentes configurações de patch que podem ser obtidos, gravações de célula inteira de patch-clamp permitir o estudo do comportamento eléctrico de uma parte substancial do neurónio. Classicamente, esta técnica é realizada in vitro, quer em fatias de cérebro, os neurónios dissociados de fresco, quer em modelos de cultura de células 3. Quando realizada em neurônios em fatias de cérebro, esta técnica apresenta várias vantagens. Em particular: (i) os neurónios são registados nos circuitos do cérebro relativamente conservadas que, em certa medida, e em comparação com as preparações de cultura de células, proporcionam um ambiente que é fisiologicamente relevante 3. Isto permite a captura precoce, ou mesmo de monitoramento em tempo real, eventos celulares e moleculares que são acionados por qualquer tipo de pharmacolog agudamanipulações iCal - uma resolução temporal que não pode ser conseguido usando clássica em condições in vivo; (ii) capacidade de identificar visualmente as regiões do cérebro em fatias de cérebro permite alta especificidade regional 3, tanto para a região do cérebro estudada e para os neurônios específicos quando eles expressam marcadores fluorescentes; (iii) o acesso ao espaço intracelular da célula através da abertura de uma parte significativa da membrana de plasma (em contraste com a perfuração da membrana com uma micropipeta afiado para gravações intracelulares) 4. Por sua vez, isto permite que o conteúdo ou concentração de iões específicos que constituem a solução interna de ser modificado de modo alvos moleculares ou mecanismos celulares pode ser estudada em condições diferentes. Por exemplo, ao estabelecer a configuração de célula inteira, qualquer agente farmacológico específico (por exemplo, antagonistas) que se pode adicionar ao micropipeta de gravação (remendo pipeta) solução difundirá directamente para o citoplasma e agir sobre a sua Putative alvos intracelulares, sem alterar a função alvo em células vizinhas. Além disso, em comparação com a gravação micropipeta afiada, a grande abertura na ponta do eléctrodo de patch clamp proporciona uma resistência mais baixa, menos ruído concorrentes, e, assim, um melhor acesso eléctrico para o interior da célula 4. No entanto, note que o da grande abertura na ponta da pipeta podem levar a célula de diálise, e, assim, a perda da maquinaria molecular intracelular que pode ser crítico para a expressão dos fenómenos biológicos que estão sob 5,6 estudo. Neste caso, as gravações de eléctrodos afiadas pode ser mais adequado. Este tipo de gravações requer micropipetas com uma poro que é muito menor do que os utilizados para as gravações de células inteiras, evitando deste modo a maior parte da permuta iónica entre o espaço intracelular e a solução da pipeta interna. Qualquer forma de experiência (aguda ou crónica), incluindo a aprendizagem 7-10, exposição a drogas de abuso 11,12, o stress 13,14, etc, pode alterar diversos aspectos da função neuronal em regiões específicas do cérebro. Porque estas alterações, muitas vezes exigem tempo para se desenvolver (horas ou dias), gravações de célula inteira em fatias de cérebro de animais que tenham sido submetidos a uma experiência específica permitir aos pesquisadores identificar essas mudanças. Basicamente, muitos (se não todos) os componentes que participam de funções neuronais (por exemplo, canais iónicos activados por ligandos, canais de iões dependentes da voltagem, transportadores de neurotransmissores), e assim a actividade circuito cerebral e comportamento, pode ser alterada por experiência (experiência-dependente plasticidade) 10,15-17. A nivel neuronal, a actividade circuito cerebral surge a partir de interacções constantes entre sináptica (por exemplo, glutamato) de transmissão e os factores de excitabilidade celular intrínseco (por exemplo, canais iónicos axosomato-dendrítica: de sódio, Na +, potássio, K +, e de cálcio, Ca 2+ ). Sob condições específicas, utilizando whole de células de patch-clamp técnicas electrofisiológicas, alterações de sinal específica das alterações na excitabilidade sináptica vs intrínseca pode ser isolado. Na maioria dos casos, a excitabilidade sináptica é avaliada utilizando a técnica de tensão-grampo de célula inteira. Este modo de gravação permite a medição de correntes de iões [por exemplo, mediados por receptores do ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico ( os receptores de AMPA) e receptores de N-metil-D-aspártico (NMDA)] receptores através da membrana plasmática neuronal, enquanto que prendem o potencial de membrana a uma voltagem conjunto. Aqui, os experimentadores usar soluções internas micropipeta que contêm césio (Cs +), um bloqueador ampla de canais de K + (principais fatores de excitabilidade intrínsecas). Após o estabelecimento da configuração de célula inteira, a difusão de Cs + no espaço intracelular irá bloquear os canais de K +, e, assim, vai permitir que ambos um espaço relativamente eficiente e pré-braçadeiradesabafar influência de fatores intrínsecos excitabilidade sobre outras medidas. Questões de espaço-clamp, ou seja, a dificuldade de tensão-clamp toda a célula, surgem quando a gravação de células irregular em forma (por exemplo, neurônios), e particularmente neurônios com um dendrítica vasto e complexo Arbor 18,19. Por causa da braçadeira de tensão somática controles mal tensão na árvore dendrítica de neurônios, vários aspectos de sinais elétricos dendríticas em estudo são distorcidos de uma forma dendrítica dependente da distância. Combinado com ferramentas farmacológicas tais como picrotoxina (ácido gama-aminobutírico, o GABA Um antagonista do receptor) ou ácido quinurï¿½ico (largo bloqueador de receptores de glutamato) dissolvido na solução extracelular (fluido cérebro-espinal artificial, ACSF), esta técnica permite a medição de glutamato receptor- e correntes de GABA A R-mediada, respectivamente. Em contraste, a excitabilidade intrínseca é normalmente avaliado em modo de gravação actual-clamp.Ao contrário de gravação voltagem-grampo, este modo de gravação permite a medição de variações no potencial de membrana induzidas por correntes de iões que fluem através da membrana plasmática neuronal. Normalmente, a alteração na excitabilidade intrínseca é avaliado através de alterações na capacidade de neurônios para gerar potenciais de ação, o que requer Na + e canais de K +. Portanto, quando se realiza gravações de corrente-clamp, micropipetas são preenchidos com uma solução interna que contém K + em vez de Cs +. Combinados com agentes farmacológicos que bloqueiam a glutamato e GABA A correntes mediadas pelo receptor dissolvidos em ACSF, este delineamento experimental permite a medição da contribuição de factores intrínsecos (por exemplo, canais de K +) para o disparo neuronal sem serem contaminados por potenciais alterações na excitabilidade sináptica factores. Este artigo irá descrever as etapas básicas necessárias processuais to (i) preparar fatias cerebrais saudáveis; (Ii) obter uma configuração de célula inteira, e (iii) monitorar os parâmetros básicos para avaliar sináptica e excitabilidade intrínseca.

<table><tbody><tr><td>Gerador de estímulo de pulso isolado</td><td>A.M.P.I</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de isolamento (ISO-Flex)</td><td>A.M.P.I</td><td>ISO-Flex</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador controlado por computador&nbsp;</td><td>Sistema</td> de Aquisição Digital <td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr> da <tr><td></td><td>Molecular Devices Microscópio</td><td>Digidata 1500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>BX-51</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>Câmara e Aquecedor em Linha</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Slicer</td><td>Leica&nbsp;</td>Extrator de micropipeta <td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Câmera de imagem</td><td>Q Imaging</td><td>QIClick-F-M-12</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de pipeta Narishige PC-10</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro</td><td>WPI</td><td>TW150F-3</td><td></td></tr><tr><td>Fixação de fatia (harpa)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0255</td><td></td></tr><tr><td>Fatia Chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Seringa não metálica agulha</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de seringa</td><td>Nalgene</td><td>176-0045</td><td></td></tr><tr><td>Pistola de cola</td><td>Home Depot</td><td>vários</td><td></td></tr><tr><td>tubos de dispersão de gás</td><td>Ace Glass Inc.</td><td>várias</td><td></td></tr><tr><td>tesouras de decapitação</td> Cabo de bisturi <td>100649198</td><td></td><td>Home Depot</td></tr><tr><td>#3</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura pequena de pontas retas e afiadas</td><td>World Precision Instruments</td><td>14218</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de canulação de vasos&nbsp;</td><td>Pinça</td><td></td> hemostática curva 500453 <td></td></tr><tr><td>World</td><td>Precision Instruments</td> Pinças <td>econômicas 501288</td><td></td></tr> World <tr>Precision Instruments<td>#3</td><td>World Precision Instruments</td><td>501976-6</td><td></td></tr><tr><td>Espátula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14357Q</td><td></td></tr><tr><td>Espátula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Fisher Papel</td> de filtro Scientific <td>08-747B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Lab Depot</td><td>CFP1-110</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Solutions</td></tr><tr><td colspan="4">Cs-Gluconato solução interna (pH 7.2&ndash; 7.3, 280&ndash; 290 mOsm)</forte></td></tr><tr><td>ácido D-glucônico 50%&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich/vários</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>Césio-OH (CsOH) 50%&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich/vários</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 2,8 mM</td><td>Sigma Aldrich/vários</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 20</td><td>mM Sigma Aldrich/vários</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA, 0,4 mM</td><td>Sigma Aldrich/vários</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>tetraetilamônio-Cl, 5 mM</td><td>Sigma Aldrich/vários</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>Na2GTP, 0,3 mM</td><td>Sigma Aldrich/vários</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>MgATP, 2 mM</td><td>Sigma Aldrich/vários</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">K-Gluconate solução interna (pH 7.2&ndash; 7.3, 280&ndash; 290 mOsm) < / forte ></td></tr> <tr><td>K D-gluconato, 120</td><td>mM Sigma Aldrich / vários</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>KCl, 20</td><td>mM Sigma Aldrich / vários</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 10 mM</td><td>Sigma Aldrich / vários</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA, 0,2 mM</td><td>Sigma Aldrich / vários</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 2</td><td>Sigma Aldrich / vários</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Na2GTP, 0,3 mM</td><td>Sigma Aldrich/vários</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>MgATP, 2</td><td>mM Sigma Aldrich/vários</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><forte>Líquido cefalorraquidiano artificial padrão (ACSF, osmolaridade e assínp; 300-310 mOsm)</forte></td></tr><tr><td>KCl, 2,5 mM</td><td>Sigma Aldrich/vários</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 119 mM</td><td>Sigma Aldrich/ vários</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&#8226; H2O, 1</td><td>mM Sigma Aldrich/vários</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3, 26,2 mM</td><td>Sigma Aldrich/vários</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>Glucose, 11 mM</td><td>Sigma Aldrich/vários</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7H2O, 1,3 mM</td><td>Sigma Aldrich/vários</td><td></td> 230391 <td></td></tr><tr><td>CaCl2- 2H2O, 2,5 mM</td><td>Sigma Aldrich/vários</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Compostos adicionais usados para preparação de soluções</td></tr><tr><td>KOH</td><td>vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ácido quinurênico</td><td>Sigma Aldrich/vários</td><td>K3375</td><td></td></tr></tbody></table>

gravações de células inteiras de patch-clamp em brain slices

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp de gravação é uma técnica electrofisiológico que permite o estudo das propriedades eléctricas de uma parte substancial do neurónio. Nesta configuração, a micropipeta está em contacto apertado com a membrana celular, o que evita a fuga de corrente e, assim, fornece medições mais precisas corrente iónica do que o método de gravação eléctrodo afiado intracelular previamente utilizado. Classicamente, a gravação de células inteiras pode ser realizada sobre os neurónios em vários tipos de preparações, incluindo modelos de cultura celular, os neurónios dissociados, neurónios em fatias de cérebro e em animais anestesiados intactos ou acordado. Em resumo, esta técnica tem imensamente contribuído para a compreensão das propriedades biofísicas passivas e activas das células excitáveis. Uma importante vantagem desta técnica é que ele proporciona informação sobre a forma específica manipulações (por exemplo, farmacológico, plasticidade induzida pelo experimentador) podem alterar ou C funções neuronais específicashannels em tempo real. Além disso, a abertura significativa da membrana plasmática permite que a solução da pipeta interna para difundir livremente no citoplasma, proporcionando meios para a introdução de medicamentos, por exemplo, agonistas ou antagonistas de proteínas intracelulares específicos, e manipular esses alvos, sem alterar as suas funções em células vizinhas. Este artigo incidirá sobre gravação de célula inteira executada em neurónios em fatias de cérebro, uma preparação que tem a vantagem de gravação de neurónios no cérebro circuitos relativamente bem conservados, isto é, num contexto fisiologicamente relevante. Em particular, quando combinado com farmacologia disso, esta técnica é uma ferramenta poderosa que permite a identificação de neuroadaptações específicas que ocorreram na sequência de qualquer tipo de experiências, como a aprendizagem, a exposição a drogas de abuso, e stress. Em resumo, as gravações de células inteiras de patch-clamp em fatias de cérebro fornecer meios para medir em ex vivo de preparação de mudanças de longa duraçãoem funções neuronais que se desenvolveram em animais acordados intactas.

Temperatura, um fator que é facilmente controlada pelo experimentador, influencia as propriedades biofísicas de canais iônicos e receptores, e, assim, a forma de onda de correntes pós-sinápticas (PSCs) (EPSC e iPSCs) e a capacidade dos neurônios para provocam picos. Figura 3 e a Figura 4 mostram o efeito da temperatura sobre o disparo neuronal e a inclinação da EPSCS evocados (eEPSCs), respectivamente. O padrão de disparo (Figura 3) ...

Este protocolo descreve passos processuais básicas para a realização de célula inteira gravações de patch-clamp. Esta técnica permite o estudo do comportamento eléctrico de neurónios, e quando realizados em fatias do cérebro, permite a avaliação de várias funções neuronais a partir de neurónios que ainda estão integrados nos circuitos do cérebro relativamente bem conservadas.

Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

O objetivo geral deste procedimento é descrever como realizar gravações de patch-clamp em células inteiras em fatias cerebrais recém-dissecadas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neurociência, como a forma como manipulações de controle experimental alteram a atividade de neurônios específicos em regiões cerebrais específicas. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece o meio para identificar alterações de longa duração em funções neuronais em preparações ex vivo, que se desenvolveram em animais acordados intactos.Embora este método possa fornecer informações sobre as funções neuronais em fatias cerebrais, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como células em cultura e neurônios in vivo. Quem demonstrará o procedimento será Francisco Garcia-Oscos, um aluno do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, utilizando uma pipeta de transferência de ponta plástica com corte côncavo, aspire suavemente uma fatia cerebral da câmara de recuperação.Coloque a pipeta de transferência na câmara de registro e, delicadamente, pressione para fora da pipeta o fragmento sobre o revestimento de lamínula localizado no fundo da câmara. Em segui

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra a técnica de patch clamp de célula inteira em uma fatia de cérebro de camundongo. Essa técnica estabelece uma conexão estável entre a micropipeta e a membrana do neurônio, que é ainda mais interrompida para estabelecer uma configuração de célula inteira para estudar a saúde e as respostas fisiológicas do neurônio.

Estabelecendo uma configuração de célula inteira por meio do método Patch Clamp

Este vídeo demonstra uma técnica para gravação de patch-clamp da superfície da membrana dendrítica. Isso ajuda a examinar diretamente as propriedades elétricas dos dendritos e dos canais iônicos dependentes de voltagem subjacentes em neurônios dopaminérgicos.

Gravações de Patch-Clamp do Dendrito de um Neurônio Dopaminérgico em uma Fatia de Cérebro

Este vídeo demonstra o posicionamento de uma pipeta pontiaguda perto de fatias de cérebro, formando um selo com uma célula neuronal. A sucção quebra a membrana celular, criando assim um grampo de remendo de célula inteira que permite medições de corrente para experimentos de eletrofisiologia.

Estabelecendo uma configuração de grampo de voltagem de célula inteira para registros eletrofisiológicos em fatias cerebrais

Este vídeo demonstra o procedimento para realizar registros eletrofisiológicos em neurônios da substância gelatinosa (SG) de fatias da medula espinhal, usando técnicas de patch-clamp de células inteiras para analisar os padrões de disparo dos neurônios. Este método permite o estudo das respostas neurais a estímulos em neurônios SG da medula espinhal.

Registro de grampo de remendo de célula inteira em um neurônio da substância gelatinosa de uma fatia da medula espinhal

Este vídeo demonstra o procedimento para mapear conexões sinápticas protegendo uma fatia de cérebro, posicionando pipetas para obter configurações de células inteiras e estimulando neurônios pré-sinápticos a registrar respostas pós-sinápticas, elucidando assim a conectividade neuronal.

Registro de grampo de patch emparelhado das conexões neuronais em fatias cerebrais agudas

Registros de patch-clamp e preenchimento simultâneo de biocitina intracelular de neurônios sinapticamente acoplados em fatias cerebrais agudas permitem uma análise correlacionada de suas propriedades estruturais e funcionais. O objetivo deste protocolo é descrever as etapas técnicas essenciais do registro eletrofisiológico a partir de microcircuitos neuronais e sua posterior análise morfológica.

Eletrofisiológica e Caracterização Morfológica de Neuronal Microcircuits em aguda fatias do cérebro do Usando Emparelhados patch-clamp Recordings

Este protocolo demonstra a implementação de um otimizado N-metil-D-glucamine (NMDG) método de recuperação protetora de preparação de fatia do cérebro. Uma formulação única mídia é usada para obter confiavelmente fatias de cérebro saudável de animais de qualquer idade e para diversas aplicações experimentais.

Preparação de fatias de cérebro aguda usando um otimizado N-metil-D-método de proteção de recuperação glucamine

As gravações de patch-clamp subcelulares oferecem a possibilidade de investigar as propriedades funcionais dos dendritos. No entanto, essas estruturas finas não são facilmente acessíveis devido ao seu pequeno diâmetro. O protocolo aqui descrito visa facilitar a coleta de gravações estáveis e confiáveis dos dendritos dos neurônios dopaminérgicos em fatias in vitro.

Subcelulares Gravações patch-clamp do domínio somatodendrítico da substância negra dopamina Neurônios

A técnica de braçadeira do remendo de fatia é um método eficaz para a análise de aprendizagem induzido por alterações nas propriedades intrínsecas e plasticidade de sinapses excitatórias ou inibitórias.

Fatia Patch Clamp técnica para análise de plasticidade induzida pela aprendizagem

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a multiplicidade sináptica funcional usando eletrofisiologia de braçadeira do remendo de células inteiras em fatias cerebral aguda.

Avaliação da multiplicidade sináptica usando células inteiras Patch-clamp eletrofisiologia

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar um patch-clamp de células inteiras em fatias cerebrais contendo neurônios de kisspeptina, o principal modulador das células do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH). Ao agregar conhecimento sobre a atividade neuronal da kisspeptina, essa ferramenta eletrofisiológica tem servido de base para avanços significativos no campo da neuroendocrinologia nos últimos 20 anos.

Neurônios Kisspeptin Hipotalâmicos como Alvo para Gravações de Patch-Clamp de Células Inteiras

Aprenda a realizar gravações de patch-clamp de célula inteira em fatias de cérebro frescas. Esta técnica permite estudar o comportamento elétrico de neurônios e avaliar funções neuronais em circuitos cerebrais intactos.

Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

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