Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

Este protocolo descreve passos processuais básicas para a realização de célula inteira gravações de patch-clamp. Esta técnica permite o estudo do comportamento eléctrico de neurónios, e quando realizados em fatias do cérebro, permite a avaliação de várias funções neuronais a partir de neurónios que ainda estão integrados nos circuitos do cérebro relativamente bem conservadas.

O objetivo geral deste procedimento é descrever como realizar gravações de patch-clamp de células inteiras em fatias de cérebro recém-dissecadas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como como as manipulações de controle experimental alteram a atividade de neurônios específicos em regiões específicas do cérebro. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece o meio para identificar uma preparação X vivo mudanças duradouras nas funções dos neurônios que se desenvolveram em animais acordados intactos.

Embora esse método possa fornecer informações sobre as funções neuronais em fatias cerebrais, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como células em cultura e neurônios in vivo. Demonstrando o procedimento estará Francisco Garcia-Oscos, um aluno do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, usando uma pipeta de transferência de plástico com ponta de corte, retire suavemente uma fatia de cérebro da câmara de recuperação.

Coloque a pipeta de transferência na câmara de registro e aperte suavemente a fatia da pipeta no revestimento da lamínula na parte inferior da câmara. Em seguida, usando a objetiva 4x do microscópio, posicione a fatia de forma que a área desejada seja colocada exatamente no centro da câmara de registro. Depois que a posição desejada for alcançada, prenda a posição da fatia do cérebro com a fatia pressionada, também conhecida como harpa.

Depois disso, mude para a objetiva de 40x e abaixe a lente suavemente até que ela entre em contato com o ACSF na câmara. Em seguida, use a roda de ajuste fino para colocar o tecido em foco. Quando o foco estiver no nível do tecido, observe as células na região alvo.

Agora, procure uma célula de destino. Marque-o na tela do computador para ajudar a guiar a micropipeta de gravação. Levante a lente objetiva para permitir espaço suficiente para a colocação da micropipeta de registro.

Nesta etapa, usando uma seringa de um mililitro, uma agulha de microsseringa não metálica e um filtro dedicado, encha uma micropipeta com a solução interna preparada previamente. Certifique-se de que não haja bolhas de ar na micropipeta. Em seguida, coloque a micropipeta em um porta-eletrodo, para que a solução entre em contato com o eletrodo de fio revestido com cloreto de prata.

Aperte a tampa da pipeta, de modo que a arruela cônica forme uma vedação ao redor da micropipeta. Em seguida, aplique pressão positiva com a seringa cheia de ar conectada ao porta-pipetas antes de imergir a micropipeta no ACSF para evitar a entrada de detritos. Usando o micromanipulador, guie a pipeta até a câmara de modo que fique aproximadamente abaixo do centro da objetiva imersa.

Ao mover a micropipeta com o micromanipulador em velocidade média a alta, localize a micropipeta na tela do computador e guie a micropipeta em direção à localização da célula no eixo XY. Nesse ínterim, meça a resistência da micropipeta aplicando um passo de tensão. Aplique pressão positiva para remover quaisquer bolhas de ar ou outros objetos estranhos que bloqueiem a micropipeta.

Depois de limpar a micropipeta, execute um voltage deslocamento para reduzir a corrente da pipeta a zero. Usando a roda de foco fino do microscópio, comece a focar enquanto abaixa a micropipeta gradualmente. Sempre foque primeiro e depois abaixe a micropipeta até o plano de foco para garantir que a ponta da micropipeta não penetre abruptamente na fatia.

Quando a micropipeta entrar em contato com a superfície da fatia, diminua a velocidade do micromanipulador para o modo médio baixo. Aplique suavemente uma leve pressão positiva para limpar quaisquer detritos no caminho. Em seguida, aproxime-se da célula, alternando com os botões de controle XYZ ou aproximando-se diagonalmente onde ambos os eixos XZ são alterados com a rotação do botão do eixo Z.

Quando a micropipeta estiver perto o suficiente da célula, uma covinha aparecerá na superfície da célula. Agora aplique uma sucção fraca e breve através do tubo que está conectado ao tubo de sucção do porta-pipetas para criar uma vedação. Enquanto um giga-selo está se formando, use o comandante do amplificador controlado por computador para trazer as células que mantêm o potencial para o potencial fisiológico de repouso, a fim de evitar mudanças repentinas, uma vez que a membrana é rompida.

Após a formação do giga-selo, compense os capasitons rápidos ou lentos. Aqui é muito importante que a sucção aplicada não seja muito forte. Caso contrário, a membrana pode se romper antes de estabelecer a vedação.

Se a vedação permanecer estável e acima de um gigaom, aplique uma sucção breve e forte para romper a membrana plasmática. A sucção deve ser breve e mais forte do que a pressão aplicada ao estabelecer uma vedação. A fim de romper adequadamente a membrana e obter uma configuração estável de toda a célula.

Alternando para o modo de célula no teste de membrana, visualize diferentes parâmetros da célula, como resistência de entrada, resistência em série e capacitons de membrana. Depois de atingir a configuração de célula inteira, continue monitorando esses parâmetros durante a gravação. Aqui é mostrado um exemplo da inclinação das EPSCs evocadas a partir de uma única camada accumbens de núcleo MSN.

Aumentar a temperatura de 24 para 28 e para 32 graus Celsius aumenta a inclinação das EPSCs evocadas. Aqui, a amplitude das EPSCs evocadas é avaliada no modo de pinça de tensão em menos 80 milivolts. Quando a resistência em série aumenta, a amplitude das EPSCS evocadas diminui.

E aqui está um exemplo dos traços de dois neurônios mostrando o efeito da resistência de entrada na capacidade do neurônio de gerar picos. Os neurônios são fixados em corrente e mantidos em menos 80 milivolts. Quando a resistência de entrada aumenta, o número de potenciais de ação também aumenta.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que gerar fatias cerebrais saudáveis é fundamental. Também é importante monitorar os parâmetros que podem influenciar a forma de onda do sinal elétrico, como a resistência em série, a resistência de entrada e a temperatura. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão do aspecto básico da técnica de gravação de células inteiras em fatias de cérebro.