Como Estudar Basement Membrane Rigidez como um gatilho Biofísica no cancro da próstata e outras patologias relacionadas com a idade ou Doenças Metabólicas

O objetivo geral deste modelo é investigar como a rigidez e a espessura da membrana basal, devido à glicação avançada e à exposição ao produto, podem modular o comportamento celular invasivo correspondente aos estágios inicial e avançado do câncer de próstata metastático. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das patologias relacionadas com a idade. Por exemplo, o aumento da rigidez e espessura da membrana basal contribui para a progressão do câncer e também distúrbios metabólicos como diabetes.

A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um método simples para imitar o nível de rigidez medido em tumores de próstata humanos no ambiente clínico. A implicação dessa técnica se estende à nossa terapia e diagnóstico de câncer de próstata, melhorando nossa compreensão de como a rigidez da membrana basal promove alterações moleculares e celulares. Indivíduos novos neste método podem ter dificuldades, porque o modelo é multidisciplinar.

Combinando técnicas das áreas de química, física e biologia. Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando hipotetizamos que a rigidez da membrana basal na próstata pode promover um comportamento invasivo de novo em células epiteliais transformadas conhecidas. A demonstração em vídeo desse método é crítica, porque as etapas interdisciplinares precisam ser descritas.

Incluindo reticulação da membrana basal, seguida de cultura de células 3D. Comece preparando uma superfície uniforme de gelo e usando-a para resfriar uma lâmina de vidro de oito poços a quatro graus Celsius. Em seguida, corte a ponta de uma ponta de pipeta de 200 microlitros e resfrie a ponta a quatro graus Celsius também.

Depois de resfriado, coloque a ponta em um auxiliar de pipetagem com capacidade de 200 microlitros. E use-o para transferir 40 microlitros de solução de matriz BM gelada para cada poço da lâmina de vidro gelada de oito poços. Em seguida, coloque a lâmina da câmara a 37 graus Celsius por 30 minutos para promover a polimerização da membrana basal.

Feche a porta da incubadora com muito cuidado para evitar perturbar a membrana basal reconstituída líquida. Após exatamente 30 minutos, adicione 250 microlitros de uma solução de glicolaldeído preparada para cobrir a membrana basal polimerizada e reconstituída. Em seguida, prepare um controle negativo adicionando 250 microlitros de PDS estéril a um gel de membrana basal nativo e reconstituído.

Além disso, prepare dois controles adicionais adicionando 50 milimolares de cianoborohidreto de sódio ou 250 milimolares de aminoguanidina à solução de glicolaldeído antes de adicioná-la ao gel da membrana basal. Em seguida, incube os géis a 37 graus Celsius por seis horas para produzir um gel semi-rígido. Ou por 14 horas para produzir um gel rígido.

Após a incubação, remova cuidadosamente as soluções dos géis e adicione 250 microlitros de um éster etílico de glicina molar a cada gel. E incube-os a 37 graus Celsius por uma hora. Lave cada gel 10 vezes em 500 mircolitros de PBS para remover todos os vestígios da solução de glicolaldeído e do éster etílico de glicina.

Em seguida, adicione 400 microlitros de PBS para evitar a desidratação e incube os géis de membrana basal reconstituídos durante a noite a 37 graus Celsius. Quando estiver pronto para continuar, remova o PBS dos géis de membrana basal reconstituídos e adicione 250 microlitros de água gelada e bidestilada a cada poço. Incube os géis a quatro graus Celsius por 16 a 24 horas para garantir que a matriz esteja completamente liquefeita.

Em seguida, transfira a membrana basal liquefeita para um tubo de 1,5 mililitro e meça a emissão fluorescente da solução usando um espectrofotômetro. Em seguida, centrifugue a solução e remova o sobrenadante resultante. Ressuspenda o pellet em 500 microlitros de uma solução contendo 20 miligramas por mililitro de brometo de cianogênio e 70% de ácido fórmico.

Incubar as amostras durante a noite à temperatura ambiente. Em seguida, use uma seringa descartável de um mililitro para transferir o gel de membrana basal ressuspenso para um de diálise com um corte de peso molecular de 3,5 quilodaltons. Mergulhe o em um copo de vidro de 500 mililitros contendo 500 mililitros de água bidestilada

E mexa a água com uma barra de agitação magnética. Coloque esta configuração durante a noite a quatro graus Celsius para remover todos os vestígios de brometo de cianogênio e ácido fórmico. Use uma seringa descartável de um mililitro para transferir a solução diada do para um tubo de 1,5 mililitro.

Em seguida, analise a solução executando-a em um gel de poliacrilamida a 12%. Manchar o gel com coloração de prata para visualizar o padrão eletroforético dos peptídeos da matriz de brometo de cianogênio. Começando com os géis de membrana basal cobertos com PBS, enxágue os géis mais duas vezes, com 300 microlitros de PBS contendo 0,1 milimoles de cloreto de cálcio.

E 0,5 milimoles de cloreto de magnésio. Por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, remova o PBS e adicione 300 microlitros de paraformaldeído a 4% para cobrir cada gel de membrana basal reconstituído.

Incube os géis por 30 minutos em temperatura ambiente para fixar os componentes reconstituídos da membrana basal. Em seguida, remova o fixador e adicione 300 microlitros de uma solução de têmpera contendo 75 milimoles de cloreto de amônio e 0,5 milimoles de cloreto de magnésio. Incube a solução por cinco minutos em temperatura ambiente e, em seguida, remova a solução e repita o enxágue mais quatro vezes.

Após o enxágue final, adicione 300 microlitros de tampão de imunofluorescência aos géis de membrana basal reconstituídos para evitar reações inespecíficas. Incube os géis na solução por duas horas em temperatura ambiente em uma plataforma agitável. Em seguida, remova o tampão bloqueador de imunofluorescência.

E adicione 300 microlitros de anticorpo primário que é diluído no tampão de bloqueio. Incube os géis de membrana basal reconstituídos a quatro graus Celsius por 16 horas. No dia seguinte, remova o anticorpo primário e lave os géis três vezes com 300 microlitros de tampão de imunofluorescência.

Agite os géis à temperatura ambiente em uma plataforma agitada por 10 minutos após cada adição de tampão. Em seguida, remova o tampão e adicione 300 microlitros do anticorpo secundário marcado com fluorescência, diluído no tampão de bloqueio. Coloque as amostras em uma plataforma agitável e incube os géis por duas horas em temperatura ambiente.

Remova o anticorpo secundário. Enxágue a amostra em um tampão de imunofluorescência, seguido de PBS e, em seguida, fixe e resfrie as amostras uma segunda vez. Por fim, monte os géis e use um microscópio para analisar a formação de feixes densos.

Para formar ácinos da próstata, diluir 5.000 células RWPE-1 em 300 microlitros de KSFM completo, suplementado com 2% da solução de membrana basal. Para agregados de células tumorais da próstata, diluir 2.500 células PC3 em 300 microlitros de meio de cultura RPMI-1640, suplementado com 2% da solução de membrana basal. Após a incubação noturna dos géis de membrana basal reconstituídos em PBS, enxágue-os duas vezes com 500 microlitros de meio de cultura.

Antes de semear as células. Semeie suavemente as células nas membranas basais reconstituídas reconstituídas com produto final de glicação nativa e avançada. E coloque cuidadosamente as culturas em uma incubadora para garantir uma distribuição uniforme de ácinos e esferóides em crescimento.

Para as células formadoras de ácinos, troque o meio a cada dois dias por meio de cultura fresco, contendo 2% da solução da membrana basal. Para garantir que as células tenham os fatores de crescimento necessários para a homeostase normal dos ácinos. Após seis dias em cultura, as células epiteliais da próstata formam ácinos na membrana basal nativa reconstituída.

E são organizados em esferóides uniformizados de células epiteliais. Esses ácinos também têm as características de PECs altamente organizados com polaridade apical a basal e um espaço luminal visível. Quando cultivadas por seis dias na membrana endurecida, as células têm uma arquitetura interrompida.

E mude de forma esferoidal para poligonal. Além disso, esses ácinos são altamente desorganizados. E perderam sua polaridade apical para basal, com um espaço luminal pequeno ou inexistente.

Isso também é verdade para as células derivadas de uma próstata afetada por hiperplasia prostática benigna. Quando as células tumorais da próstata foram medidas, descobriu-se que as células eram mais longas na membrana basal rígida e reconstituída, e também migraram mais rápido e aumentaram a persistência celular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como modelar os efeitos da rigidez da membrana basal no comportamento das células epiteliais e tumorais.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o nível desejado de rigidez da membrana basal é induzido e os ácinos ou esferoides s individuais são formados adequadamente. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da oncologia explorarem a indução da invasão de células cancerígenas pela rigidez da membrana basal na próstata. Seguindo este protocolo, outro método, como immunoblotting de lisado celular, pode ser realizado para responder a perguntas adicionais relacionadas à via de sinalização, modulada pela rigidez da membrana basal.

Não se esqueça de que trabalhar com cianoborohidreto de sódio, brometo de cianogênio e ácido fórmico pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar jaleco, luvas, protetor facial e respirador ao trabalhar na capela devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.