Name: Como Estudar Basement Membrane Rigidez como um gatilho Biofísica no cancro da próstata e outras patologias relacionadas com a idade ou Doenças Metabólicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Aprenda a modelar a rigidez da membrana basal usando AGEs para estudar comportamento invasivo em câncer de próstata metastático. Este método integra química, física e biologia para replicar condições tumorais clínicas.

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Agradecemos a Simon Hayward (Vanderbilt University Medical Center) pelas células BPH-1; e Thomas Cox e Janine Erler (Biotech Research & Innovation Centre, University of Copenhagen) por sua assistência com medições reológicas. O MR-T foi financiado pela Worldwide Cancer Research, anteriormente The Association of International Cancer Research (Grant 08-0803 to JS), The British Embassy Montevideo e Agencia Nacional de Investigacion e Innovacion (UK_RH_2015_1_2 to MR-T). O MC foi apoiado pela Prostate Cancer UK (Grant S14-017 para JS e GS). KW foi financiado pelo Conselho de Bolsas de Estudo da China. O MAM foi financiado pelo Departamento Cultural da Arábia Saudita.

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Os autores não têm nada a divulgar.

Um protocolo para a geração de ácinos glandular 3D a partir de CME em géis RBM puros 6 foi modificada em um estudo anterior pela adição de 4 mg / ml tipo I colágeno para matriz RBM. A adição de colagénio resultou no módulo de elasticidade do gel RBM aumento de 175 ± 37-1589 ± 380 Pascais. Este aumento de 9,1 vezes na rigidez modulado o crescimento, sobrevivência, migração e diferenciação das CMEs 21. O protocolo foi modificado de novo através da inclusão de um passo de tratamento com D - (-) - ribose para promover a reticulação não enzimática do colagénio do tipo I, que tinha sido adicionado ao gel RBM. O resultante aumento de 15 vezes na rigidez foi encontrado para cooperar com a transformação oncogénica de MECs para promover o seu comportamento invasivo 22. A abordagem experimental do tipo adicionando I colágeno para géis RBM facilita a interação direta do CME com fibras de colágeno, o que só ocorre no tecido humano após a barreira física entre o estromae epitélio fornecida pela BM sofre degradação proteolítica. Ao gerar ácinos glandular 3D a partir de PECs em géis RBM puros pré-tratados com GLA, o protocolo atual abre o caminho para estudar como BM rigidez per se pode acionar o seu comportamento invasivo (Figura 3). Os níveis de BM rigidez induzidas neste protocolo tem relevância fisiológica. A incubação com GLA 50 mM durante 6 h e 14 h, respectivamente, aumentou os módulos elásticos do gel RBM pura para 175 ± 90 e 322 ± 160 em comparação com 122 ± 55 Pascais em géis RBM tratados com PBS (Tabela 1). Este aumento de 1,7 a 3,2 vezes em RBM rigidez recapitula a 2,5 a 3,4 vezes aumento na rigidez observada em comparação com maligno da próstata normal ou o tecido de BPH 23-26. Conforme descrito em uma publicação recente 13 as alterações morfológicas induzidas pela acumulação de AGE e RBM rigidez no PEC ácinos pode ser quantificada para uma mudança estatisticamente significante de arundada de forma poligonal, diminuição luminal / área total acinar, e as células salientes migram do acina no-AGE rica RBM (Figura 3). Imunotransferência também pode ser usado para avaliar os marcadores de EMT (por exemplo, perda de E-caderina 13) e o comportamento contráctil (por exemplo leve da miosina de cadeia fosforilada-2, pMLC2 13) em PEC cultivadas em normais versus RBM rígida (Figura 3). A avaliação subsequente por meio da coloração de imunofluorescência e microscopia confocal podem ser aplicadas para visualizar o BM (por exemplo, a laminina, colagénio IV e acumulação de AGE 13), a polaridade apical-para-basal celular (por exemplo, localização apical EEA1: antigénio endossomal precoce 1; e GM130: 130 kDa cis-Golgi marcador 13) e padrões de moléculas de adesão celular (por exemplo, a e-caderina de localização para junções célula-célula 13) (Figura 3). <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54230 / 54230fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3:. Visão geral dos diferentes protocolos aqui apresentados O diagrama mostra como preparar e endurecer a membrana basal reconstituída (RBM) com glicoaldeído (reação de Maillard), como propagar células para a RBM rígida, como analisar o RBM rígido ( extensão da reacção de Maillard) e procedimentos que podem ser utilizados para analisar as alterações celulares e moleculares induzidos por RBM rica em produtos FGA. AGE, produtos finais da glicação avançada; BM, membrana basal; DAPI, 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol; EEA1, cedo antigénio endossomal 1; GAPDH, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; GLA, glicoaldeído; GEE, éster etílico de glicina; GM130, 130 kDa marcadores cis-Golgi; p-MLC2 (Thr18 / Ser19), miosina de cadeia leve 2 fosforilada em locais treonina 18 e serina 19; RBM, membrana basal reconstituída; SDS-PAGE, electroforese em dodecil sulfato de gel de poliacrilamida de sódio. Para bar RWPE1 ácinos Escala = 10 mm; para células de tumor PC3barra de escala = esferóides 100 um. Esta figura foi modificado a partir da referência 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> solução de problemas etapas será necessário se D - (-) - ribose é escolhido como o agente de ligação cruzada para RBM. Durante o desenvolvimento do protocolo, verificou-se que o tratamento com 1 M D - (-) - ribose durante 72 horas, como descrito anteriormente para géis RBM / colágeno 22, resultou na desidratação e encolhimento dos géis RBM. A avaliação de concentrações mais baixas de D - (-) - ribose e tempos de tratamento mais curtos pode ajudar a ultrapassar esta limitação. Uma limitação potencial em futuras aplicações do protocolo pode ser encontrado em níveis mais elevados de RBM rigidez são desejados. Se os tempos de incubação mais longos e maiores concentrações de GLA são utilizados para induzir níveis mais elevados de rigidez de gel RBM será necessário<html> avaliar se estas condições de tratamento ter um impacto sobre a sobrevivência e proliferação celular, tal como previamente descrito 13. Deve também notar-se que a incubação de células RWPE-1 com soro induz uma transição EMT-fenotípica e como a exposição a soro ou materiais contendo soro deve ser evitada. Por exemplo, se experiências envolvem a transfecção de ARN interferente curto oligonucleótidos (siARN), o procedimento deve ser optimizada utilizando células RWPE-1 cultivadas em KSFM, sem mudar as células para meio de transfecção baixo soro. Este inconveniente pode comprometer o nível de silenciamento de genes obtidos quando utilizando siRNA transiente abordagens no modelo. Para algumas proteínas alvo, seria aconselhável empregar vectores shRNA induzíveis para o silenciamento do gene ajustável ea redução desejada em níveis de proteína. Adaptações que incorporam reticulação enzimática por células do estroma ou células de tumor associado lisil-oxidase (LOX) 17 também poderia ser incorporada modelos futuros. jove_content &quot;&gt; Este protocolo facilitará o futuro estudo de mecanismos pró-invasivos desencadeadas por idade-dependente BM rigidez nas PECs (RWPE-1, BPH-1) e avaliação de metas anti-metastáticos em PTCs invasivos (PC3). Dado que BPH é considerado como sendo uma desordem metabólica 27, este protocolo também abre o caminho para a melhor compreensão da relação entre distúrbios metabólicos e aumento do risco de cancro da próstata. Dado que a BM rigidez induzida por sua exposição a produtos FGA pode ser um gatilho para a invasividade noutros cancro tipos, que será de interesse para usar o protocolo de criar modelos similares que incorporam células epiteliais normais e células tumorais de outros órgãos (por exemplo, mama, cólon, ovário, pâncreas). As etapas críticas no âmbito do protocolo, juntamente com os seus horários, estão resumidos na Figura 4. Durante o passo inicial é essencial para manter a solução estoque de RBM a 4 ° C, enquanto que derrete para evitar a sua polymerization. Pontas de pipeta não deve ser colocado na solução estoque rM até que tenham sido arrefecida a 4 ° C. Para o próximo passo, é também importante para garantir que as lâminas de câmaras foram equilibrados a 4 ° C antes de serem revestidos com a solução RBM. Assim que a temperatura da solução é aumentada RBM acima de 4 ° C, ele irá sofrer polimerização irreversível para formar um gel. É essencial que o RBM não é perturbada durante a fase de polimerização para garantir que ela forma uma superfície plana apropriada para a cultura de células e análise microscópica. A duração da incubação com GLA com ou sem inibidores da reacção de Maillard (cianoboro-hidreto de sódio e amingoguanidine) irá determinar qual a rigidez do gel torna-se RBM. Recomenda-se a utilização de uma incubação de 6 h com GLA se forem necessárias condições semi-rígidas, e 14 h de incubação, se as condições rígidas são necessárias (Tabela 1). tempos de incubação alternativo ou concentrações de GLA pode ser usado se diferentes níveisde rigidez são desejados. Neste caso análise reológica dos géis RBM precisa de ser incorporado como um passo essencial. A seguir ao passo de têmpera da reacção de Maillard, por incubação com Gee e os passos de lavagem subsequentes com PBS, os géis RBM podem ser utilizadas imediatamente ou armazenadas a 4 ° C durante até 48 h antes de seu uso para cultura de células. Uma vez que as culturas de células são configurados é importante mudar o meio de cultura (incluindo quaisquer tratamentos) a cada dois dias. Recomenda-se a manter as culturas de células 3D durante 3-12 dias de acordo com os parâmetros sob investigação. Para 3D PEC ácinos, recomenda-se analisar as culturas após 6 dias, e para a análise 3D PTC esferóides é recomendado após 3 dias de cultura na primeira instância. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig4.jpg" /> Figura 4:. Vista geral simples do protocolo com a passos críticos e sincronismos indicou a flodiagrama w descreve como preparar e endurecer a membrana basal reconstituída (RBM) com glicoaldeído (reação de Maillard) com passos críticos e horários indicados. Os pontos em que o protocolo pode ser parado, e géis RBM armazenados, são também indicados. RBM, membrana basal reconstituída; GLA, glicoaldeído; GEE, éster etílico de glicina; ON, durante a noite; PBS, solução salina tamponada com fosfato; RT, temperatura ambiente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

A membrana basal (MO) é uma folha de matriz extracelular (MEC) especializada que mantém as bordas estáveis do tecido separando camadas de células epiteliais do estroma1. A reticulação covalente entre as triplas hélices adjacentes de colágeno IV no MO estabiliza sua associação lateral, estabelecendo uma rede irregular de hélices supertorcidas2. Essas redes de colágeno IV atuam como um suporte para sua interação com a laminina e outros componentes da MO1. O arranjo estrutural da MO lhe confere a resistência mecânica e a rigidez necessárias para o desenvolvimento normal do epitélio glandular3. 
Durante o envelhecimento e a doença, a MO progressivamente engrossa e enrijece3,4. Por exemplo, um aumento de 3 vezes no módulo de elasticidade (E) da MO ocular ocorre entre as idades de 50 e 80 anos na população normal, e esse enrijecimento é ainda mais exacerbado em distúrbios metabólicos como diabetes5. As mudanças estruturais e biomecânicas na MO que resultam em sua rigidez aumentada ocorrem quando seus componentes da MEC, colágeno IV e laminina, tornam-se reticulados não enzimaticamente após sua exposição a produtos finais de glicação avançada (AGEs).
O objetivo do método descrito aqui foi estabelecer um modelo para a investigação de como a rigidez da MO, devido à exposição ao AGE, promove a invasividade das células epiteliais da próstata (PEC) e das células tumorais da próstata (PTC) no contexto da mudança para o câncer de próstata metastático (CaP). Para fazer isso, um método anterior usado para gerar ácinos glandulares 3D a partir de células epiteliais mamárias (MECs) em géis rBM reconstituídos6 foi adaptado para incluir uma etapa adicional em que os géis rBM são pré-tratados com glicolaldeído (GLA). Várias técnicas para avaliar a reticulação induzida por GLA e o enrijecimento de géis rBM pré-tratados são descritas, incluindo análise fotométrica, eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS PAGE), microscopia confocal e análise reométrica. Os tipos de células da próstata selecionados para cultura no rBM pré-endurecido incluem: RWPE-1, PECs derivadas de uma próstata normal7; BPH-1, PECs derivadas de uma próstata afetada pela BPH8; e PC3, PTCs metastáticos derivados de um tumor secundário localizado no osso vertebral de um paciente com câncer de próstata (CaP)9. 
Além de avançar no estudo da patologia da próstata, o protocolo de enrijecimento de géis de rBM por seu tratamento com GLA pode ser adaptado para investigar como a rigidez da BM contribui para outras patologias relacionadas à idade e distúrbios metabólicos. Por exemplo, o modelo pode ser aplicado diretamente para investigar como o câncer metastático é induzido pela rigidez da MO em órgãos como mama, cólon, ovário e pâncreas pela incorporação de tipos de células apropriados. Além disso, o protocolo pode ser adaptado para investigar como a MO rígida promove mecanismos biomecânicos de progressão da doença em doenças microvasculares relacionadas ao diabetes, retinopatia, nefropatia e neuropatia.

<table><tbody><tr><td>I - Material para cultura monocamada</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BPH-1</td><td>CaP Base de dados de linhagens celulares</td><td>PCaCL-132</td><td>Contato: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu</td></tr><tr><td>Meio completo sem soro de queratinócitos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-075</td><td>Não aqueça a 37 &ordm; C antes de usar</td></tr><tr><td>Soro fetal para bezerros&nbsp;</td><td>First Link UK Ltd</td><td>02-00-850</td><td>Loja em -20 &ordm; C em alíquotas</td></tr><tr><td>PC3&nbsp;</td><td>Coleção de Cultura American Type</td><td>CRL-1435</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de fosfato Salino (Dulbecco A) comprimidos</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 médio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5886</td><td>quente em 37 &ordm; C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>RWPE-1&nbsp;</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-11609</td><td></td></tr><tr><td>Solução de tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>II - Material para cultura 3D</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Aminoguanidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>396494</td><td>Irritante para os olhos, sistema respiratório e pele</td></tr><tr><td>Lâminas de câmara, 8 poços&nbsp;</td><td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek</td><td>TKT-210-816M</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de Cultura reconstituída membrana basal (rBM) extrato de fator de crescimento reduzido&nbsp;</td><td>AMS Biotechnology</td><td>3445-005-01</td><td>Loja Membrana do porão (BM) a -80 &ordm; C em alíquotas Brometo de</td></tr><tr><td>cianogênio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C91492</td><td>Tóxico por contato com a pele e inalação</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695076</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de éster etílico de glicina (GEE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50060</td><td>Irritante para os olhos</td></tr><tr><td>Dímero de glicolaldeído (GLA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6805</td><td></td></tr><tr><td>Cianoborohidreto de sódio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71435</td><td>Altamente inflamável; Tóxico por contato com a pele e inalação</td></tr><tr><td>Filtro de seringa 0,22 mícrons</td><td>Appleton Woods</td><td>BC680</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>III - Material para quantificar a reação de Maillard</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>D3571</td><td>sensível à luz e armazenado a -20 &ordm; C em alíquotas Cilindros</td></tr><tr><td>de clonagem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1059</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-rato IgG (H + L) Alexa Fluor 488 conjugado</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>A-11001</td> Cabra <td>sensível à luz</td></tr><tr><td>anti-coelho IgG (H + L) Alexa Fluor 488 conjugado</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>A-11034</td> soro <td>de cabra sensível à luz</td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td>Armazenar em -20 &ordm; C em alíquotas</td></tr><tr><td>Mídia de montagem Vectashield&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Clone anti-pentosidina de camundongo PEN-12 mAb</td><td>TransGenic Inc</td><td>KH012</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Armazenar em -20 &ordm; C em alíquotas</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonal anti-colágeno humano IV de coelho&nbsp; &nbsp;</td><td>Anticorpos Acris</td><td>R1041</td><td>Armazene em -20 &ordm; C em alíquotas</td></tr><tr><td>Coelho anti-laminina A / C pAb</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc</td><td>sc-7292</td><td>Loja em -20 &ordm; C em alíquotas Éter</td></tr><tr><td>terc-octilfenílico de polietilenoglicol (Triton-X100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Monolaurato de sorbitano de polietilenoglicol (Tween-20)</td><td>de diálise Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>66333</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>IV - Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Reômetro rotacional de tensão controlada ARG2</td><td>T.A. Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert S100 (ampliação de 20X) microscópio</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 câmara de incubação umidificada controlada para microscópio Zeiss Axio S100</td>Microscópio Confocal Axiovert 200M (ampliação de 40X, 63X) <td>da Solent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microscópio Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus LH50A equipado com uma câmera digital usando contraste de fase&nbsp;</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro leitor de placas PHERAstar Plus</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>V - Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imagem J 1.47v</td><td>Instituto Nacional de Saúde, Dispositivos moleculares MetaXpress dos EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

como estudar basement membrane rigidez como um gatilho biofísica no cancro da próstata e outras patologias relacionadas com a idade ou doenças metabólicas

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Descrevemos aqui um protocolo que pode ser utilizado para estudar o microambiente biofísico relacionadas ao aumento da espessura e rigidez da membrana basal (BM) durante patologias relacionadas com a idade e distúrbios metabólicos (por exemplo, cancro, diabetes, doença microvascular, retinopatia, nefropatia e neuropatia) . A premissa de que o modelo é de ligação cruzada não enzimática de BM matriz reconstituído (RBM), por tratamento com glicolaldeído (GLA) para promover a glicação avançada produto final geração (FGA), através da reacção de Maillard. Exemplos de técnicas laboratoriais que podem ser utilizados para confirmar a geração de AGE, a reticulação não enzimática e aumento da rigidez em GLA tratada RBM são descritas. Estes incluem a preparação de MAE nativa (tratados com solução salina tamponada com fosfato, PBS) e rígida RBM (tratadas com GLA) para a determinação de: o seu conteúdo de AGE por análise fotométrica e de microscopia de imunofluorescência, a sua ligação cruzada não enzimática de poliacrilamida de sulfato de dodecilo de sódioelectroforese em gel (SDS-PAGE), bem como microscopia confocal, e a sua rigidez aumentada utilizando reometria. O processo descrito aqui pode ser utilizado para aumentar a rigidez (módulos elásticos, E) de MAE-se para 3,2 vezes, consistente com as medições efectuadas em saudável contra o tecido da próstata humano doente. Para recriar o microambiente biofísico associado ao envelhecimento e próstata doente glândula três tipos de células da próstata foram introduzidas para RBM nativa e dura RBM: RWPE-1, células epiteliais da próstata (PECs) derivada de uma próstata normal; HBP-1, PEC derivadas de uma próstata afectados por hiperplasia prostática benigna (BPH); e PC3, células metastáticas derivado de um tumor ósseo secundário proveniente de cancro da próstata. Vários parâmetros podem ser medidos, incluindo o tamanho, forma e características invasoras do acini glandular 3D formado por RWPE-1 e BPH-1 no nativa contra RBM duro, e duração média de células, a velocidade de migração e persistência de circulação de células de spher 3Doids formados por células PC3 sob as mesmas condições. Vias celular e a localização subcelular de proteínas de sinalização pode igualmente ser avaliada.

3D próstata Acini cultivadas em RBM Stiff Após 6 dias de cultura, os PEC derivada de tecido de próstata normal (RWPE-1) (Figura 1A) e no tecido HBP (BPH-1) (Figura 1B) forma ácinos no nativo (tratados com PBS) RBM que estão organizados em esferóides uniformes de epitelial células. Estes ácinos também têm as características de PECs altamente organizadas com espaço apical-para-basal polaridade e um luminal visível 13,20. O ácinos formado por PEC derivadas a partir de tecido de próstata normal (RWPE-1) (Figura 1A) e no tecido HBP (BPH-1) (Figura 1B) em endureceu RBM (rico em AGE) (tratado com GLA) têm uma arquitectura interrompido (deslocando de esferoidal de forma poligonal e células salientes / migração do ácinos no RBM rico-AGE) (Figura 1A). Estes<html> ácinos são também caracterizados por PEC altamente desorganizada que perderam a sua polaridade para-apical-basal com uma pequena ou inexistente espaço luminal 13. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig1.jpg" /> Figura 1:. Células da próstata epiteliais cultivadas como 3D glandular Acini em Native e Stiff membrana basal reconstituída (RBM) (A) imagens de campo claro de células RWPE-1 cultivadas durante 12 h até 6 dias em géis RBM tratados com PBS (nativo) ou glicoaldeído 50 mM durante 14 h (-AGE rica; rígida); Barra de escala = 50 mm. (B) as células BPH-1, crescidas como descrito no painel A; Barras de escala = 50 um; dados são representativos de 3 experiências independentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <html> Tabela 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54230 / 54230table1.jpg &quot;/&gt; Tabela 1:. Características da próstata epitelial RWPE-1 ácinos cultivadas em Native, Semi-Stiff e Stiff basal reconstituída Membrane (RBM) RWPE-1 ácinos foram cultivadas em RBM pré-tratados com PBS, durante 14 horas (nativo), glicoaldeído (GLA ) durante 6 horas (semi-rígidos) ou GLA, durante 14 horas (dura). Por forma acinar, o percentual (%) ± desvio padrão (SD) da rodada, acini semi-poligonal e poligonais foram calculados a partir de 5 experiências independentes (50 ácinos quantificados por condição). tamanho acinar relativo foi calculado (nativo RBM = 100%) a partir de 3 experiências independentes. Para invasividade,% ± SD ácinos com uma ou mais células protuberantes foram calculadas a partir de 3 experiências independentes. mudança da dobra é calculado dividindo o valor médio obtido em condições semi-rígidas ou rígidas por o valor correspondente para condições nativas. Valores de p calculados utilizando o teste t de Student (α = 0,05). onteúdo &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; AGE dependente aumento da rigidez RBM promove a migração de células tumorais PC3 próstata Células PC3 cultivadas em RBM nativa migrar mantendo contato célula-célula contínua, enquanto que as células PC3 cultivadas em rich-AGE (dura) RBM movimento independentemente um do outro (Figura 2A). Depois de 72 horas em células PC3 cultura formar focos (esferóides) sobre nativa (tratado PBS) RBM, enquanto que as células PC3 sobre dura RBM (rico em AGE) não fazer a partir de esferóides e migrar de forma independente (Figura 2B). Células PC3 sobre dura RBM (rico em AGE) são mais alongado do que as células PC3 cultivadas em RBM nativa (Figura 2C). Células PC3 sobre RBM dura migrar mais rapidamente do que células PC3 cultivadas em RBM nativa (Figura 2D). Células PC3 sobre RBM dura exibir uma diminuição na persistência em comparação com células PC3 cultivadas em RBM nativa (Figura 2E). <img alt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54230 / 54230fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2:. A migração do tumor de células da próstata em Native e Stiff membrana basal reconstituída (RBM) (A) imagens de campo claro de células PC3 cultivados em géis RBM tratados com PBS (nativo) ou glicoaldeído 50 mM durante 14 h (rico em AGE, duro) . As células foram fotografadas utilizando um microscópio de campo claro (objetiva de 10X) e uma taxa de aquisição de uma imagem por hora durante 12 horas seguido de células de rastreamento para gerar trajetórias. As imagens mostradas correspondem aos pontos de tempo após 0, 3, 6, 9 e 12 horas. Trajetórias de células individuais são mostrados para o ponto de tempo de 12 horas. Barra de escala = 100 pm. Células (B) PC3 cultivadas em RBM nativa ou rígida, durante 72 h, e visualizada como se descreveu no painel (A). Barra de escala = 100 pm. Detalhe mostra a área selecionada a 2X ampliação. (C) Média ± SD comprimento célula (um); diferença significativa entre RBM nativa e RBM rígida (p = 1,2 x 10 -23). ( <strong&gt; D) Média ± SD velocidade (pM / hr) calculado a partir de trajectórias de células; diferença significativa entre RBM nativa e RBM rígida (p = 0,004). (E) Média ± SD persistência do movimento celular (razão D / T, em que D = distância do início ao fim da trajectória de célula, T = comprimento total da trajectória de célula); diferença significativa entre RBM nativa e RBM rígida (p = 0,0007). Para os painéis CE&gt; 10 células foram analisados, os dados são representativos de 3 experiências independentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui nós explicar um protocolo para modelar o microambiente biofísico onde reticulação e o aumento da rigidez da membrana basal (BM) induzida por produtos finais de glicação avançada (AGEs) tem relevância patológica.

Como Estudar Basement Membrane Rigidez como um gatilho Biofísica no cancro da próstata e outras patologias relacionadas com a idade ou Doenças Metabólicas

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

O objetivo geral deste modelo é investigar como a rigidez e a espessura da membrana basal, decorrentes da glicosilação avançada e da exposição a produtos, podem modular o comportamento invasivo de células correspondentes às fases iniciais e avançadas do câncer de próstata metastático. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de patologias relacionadas à idade, como a forma pela qual o aumento da rigidez e da espessura da membrana basal contribui para a progressão do câncer e também para distúrbios metabólicos como o diabetes.A principal vantagem desta técnica é que ela fornece um método simples para imitar o nível de rigidez medido em tumores de próstata humanos no contexto clínico. A implicação desta técnica se estende ao nosso tratamento e diagnóstico do câncer de próstata, melhorando nossa compreensão de como a rigidez da membrana basal promove alterações moleculares e celulares. Indivíduos novos neste método podem ter dificuldades, porque o modelo é multidisciplinar.Combinando técnicas das áreas de química, física e biologia. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando formulamos a hipótese de que a rigidez da membrana basal na glândula prostática pode promover comportamento invasivo de novo em células epiteliais transformadas conhecidas. A demonstração em vídeo deste método é fundamental, porque os passos interdisciplinares precisam ser descritos.Incluindo a reticulação da membrana basal, seguida de cultura celular tridimensional. Comece preparando uma superfície uniforme de gelo e utilize-a para resfriar uma lâmina de vidro com oito poços a quatro graus Celsius. Em seguida, corte a extremidade de uma ponteira de pipeta de 200 microlitros e resfrie a ponteira também a quatro graus Celsius.Uma vez resfriado, coloque a ponteira em um auxiliar de pipetagem com capacidade de 200 microlitros. E utilize-o para transferir 40 microlitros de solução de matriz BM gelada para cada poço da lâmina de câmara de oito poços resfriada. Em seguida, coloque a lâmina de câmara a 37 graus Celsius por 30 minutos para promover a polimerização da membrana basal.Feche a porta do incubador com muito cuidado para evitar perturbar a membrana basal reconstituída líquida. Após exatamente 30 minutos, adicione 250 microlitros de uma solução preparada de glicolaldeído para cobrir a membrana basal reconstituída polimerizada. Em seguida, prepare um controle negativo adicionando 250 microlitros de PDS estéril a um gel de membrana basal reconstituída nativa.Além disso, prepare dois controles adicionais adicionando, separadamente, 50 milimolares de cianoborohidreto de sódio ou 250 milimolares de aminoguanidina à solução de glicolaldeído antes de adicioná-la ao gel da membrana basal. Em seguida, incube os géis a 37 graus Celsius por seis horas para produzir um gel semi-rígido. Ou por 14 horas para produzir um gel rígido.Após a incubação, remova cuidadosamente as soluções dos géis e adicione 250 microlitros de glicina etil éster 1 molar a cada gel. Incube-os a 37 graus Celsius por uma hora. Lave cada gel 10 vezes com 500 microlitros de PBS para remover todos os vestígios da solução de glicolaldeído e do glicina etil éster.Em seguida, adicione 400 microlitros de PBS para evitar desidratação e incubar os géis de membrana basal reconstituídos durante a noite a 37 graus Celsius. Quando estiver pronto para continuar, remova o PBS dos géis de membrana basal reconstituídos e adicione 250 microlitros de água gelada, duplamente destilada, a cada poço. Incube os géis a quatro graus Celsius por 16 a 24 horas para garantir que a matriz esteja completamente liquefeita.Em seguida, transfira a membrana basal liquefeita para um tubo de 1,5 mililitro e meça a emissão fluorescente da solução utilizando um espectrofotômetro. Em seguida, centrifugue a solução e remova o sobrenadante resultante. Re-suspenda o pellet em 500 microlitros de uma solução contendo 20 miligramas por mililitro de brometo de cianogênio e ácido fórmico 70%.Incube as amostras durante a noite à temperatura ambiente. Em seguida, utilize uma seringa descartável de um mililitro para transferir o gel da membrana basal re-suspenso para uma cassete de diálise com corte de peso molecular de 3,5 kilodaltons. Mergulhe a cassete em um béquer de vidro de 500 mililitros contendo 500 mililitros de água bidestilada.E agite a água com uma barra magnética de agitação. Deixe esse conjunto durante a noite a quatro graus Celsius para remover todos os vestígios de brometo de cianogênio e ácido fórmico. Utilize uma seringa descartável de um mililitro para transferir a solução dialisada da cassete para um tubo de 1,5 mililitro.Em seguida, analise a solução submetendo-a a eletroforese em gel de poliacrilamida a 12%. Manche o gel com nitrato de prata para visualizar o padrão eletroforético dos peptídeos matriciais de brometo de cianogênio. A partir dos géis de membrana basal cobertos com PBS, lave os géis duas vezes adicionalmente com 300 microlitros de PBS contendo 0,1 milimol de cloreto de cálcio.E 0,5 milimol de cloreto de magnésio. Por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, remova o PBS e adicione 300 microlitros de paraformaldeído 4% para cobrir cada gel de membrana basal reconstituída.Incube os géis por 30 minutos à temperatura ambiente para fixar os componentes da membrana basal reconstituída. Em seguida, remova o fixador e adicione 300 microlitros de uma solução de bloqueio contendo 75 milimoles de cloreto de amônio e 0,5 milimoles de cloreto de magnésio. Incube a solução por cinco minutos à temperatura ambiente e, em seguida, remova a solução e repita a lavagem mais quatro vezes.Após a lavagem final, adicione 300 microlitros de tampão de imunofluorescência aos géis de membrana basal reconstituídos para prevenir reações inespecíficas. Incube os géis na solução por duas horas à temperatura ambiente em uma plataforma agitadora. Em seguida, remova o tampão bloqueador de imunofluorescência.E adicione 300 microlitros do anticorpo primário diluído no tampão de bloqueio. Incube os géis de membrana basal reconstituídos a quatro graus Celsius por 16 horas. No dia seguinte, remova o anticorpo primário e lave os géis três vezes com 300 microlitros de tampão de imunofluorescência.Agite os géis à temperatura ambiente em uma plataforma agitadora por 10 minutos após cada adição de tampão. Em seguida, remova o tampão e adicione 300 microlitros do anticorpo secundário marcado com fluoróforo, diluído no tampão bloqueador. Coloque as amostras em uma plataforma agitadora e incube os géis por duas horas à temperatura ambiente.Remova o anticorpo secundário. Lave a amostra em um tampão de imunofluorescência, seguido por PBS, e então fixe e quenche as amostras uma segunda vez. Por fim, monte os géis e use um microscópio para analisar a formação de feixes densos.Para formar acínios da glândula prostática, dilua 5.000 células RWPE-1 em 300 microlitros de KSFM completo, suplementado com 2% da solução de membrana basal. Para agregados de células tumorais da próstata, dilua 2.500 células PC3 em 300 microlitros de meio de cultura RPMI-1640, suplementado com 2% da solução de membrana basal. Após a incubação noturna dos géis de membrana basal reconstituídos em PBS, lave-os duas vezes com 500 microlitros de meio de cultura.Antes de semear as células. Semee suavemente as células sobre as membranas basais reconstituídas nativas e endurecidas por produtos finais de glicação avançada. E coloque cuidadosamente os cultivos em uma incubadora para garantir uma distribuição uniforme de acínios e esferoides em crescimento.Para as células formadoras de acínios, troque o meio a cada dois dias por meio de cultura fresco, contendo 2% da solução de membrana basal. Para garantir que as células tenham os fatores de crescimento necessários para a homeostase normal dos acínios. Após seis dias em cultura, as células epiteliais da próstata formam acínios sobre a membrana basal reconstituída nativa.E são organizados em esferoides uniformes de células epiteliais. Esses acínos também possuem as características de células epiteliais polarizadas altamente organizadas, com polaridade apical para basal, e um espaço luminar visível. Quando cultivadas por seis dias sobre a membrana endurecida, as células apresentam uma arquitetura desorganizada.E mudam de forma esferoidal para poligonal. Além disso, esses ácinos são altamente desorganizados e perderam sua polaridade apicobasal, com um espaço luminar pequeno ou inexistente.Isso também é válido para as células derivadas de uma glândula prostática afetada por hiperplasia prostática benigna. Quando as células tumorais da próstata foram analisadas, observou-se que eram mais alongadas sobre a membrana basal reconstituída rígida, além de migrarem mais rapidamente e apresentarem maior persistência celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como modelar os efeitos da rigidez da membrana basal no comportamento de células epiteliais e tumorais.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que o nível desejado de rigidez da membrana basal é induzido e que acínios individuais ou s-esferoides são adequadamente formados. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de oncologia explorarem a indução da invasão de células cancerígenas pela rigidez da membrana basal na glândula prostática. Após este protocolo, outros métodos, como o immunoblotting de lisado celular, podem ser realizados para responder perguntas adicionais relacionadas à via de sinalização modulada pela rigidez da membrana basal.Não se esqueça de que trabalhar com cianoborohidreto de sódio, brometo de cianogênio e ácido fórmico pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de jaleco de laboratório, luvas, protetor facial e respirador enquanto se trabalha na capela de exaustão, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

O efeito da rigidez substratos em função celular podem ser...

Estudando os efeitos da rigidez Matrix em função celular usando acrilamida baseado Hidrogéis

Aqui nós descrevemos um método rápido e simples para medir a rigidez da célula. O princípio geral da presente abordagem é a de medir a deformação da membrana em resposta ao bem definido de pressão negativa aplicada por meio de uma micropipeta para a superfície celular. Este método fornece uma ferramenta poderosa para estudar as propriedades biomecânicas do substrato anexados células.

Aspiração micropipeta de Células-substrato anexados para Estimar Rigidez celular

-Tracking microrheology partícula pode ser usada para quantificar de forma não destrutiva e espacialmente mapear as alterações nas propriedades mecânicas da matriz extracelular em modelos de tumor em 3D.

Medição Longitudinal de Matriz Extracelular Rigidez em 3D tumorais modelos com o uso de rastreamento de partículas Microrheology

Apresentamos protocolos detalhados para isolamento de aortas de camundongos e medição de seu módulo de elasticidade usando microscopia de força atômica.

Medindo a rigidez<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aortas Usando Microscopia de Força Atômica

Nós desenvolvemos um ensaio de poliacrilamida-baseado multi bem formato para sondar o efeito da rigidez da matriz extracelular em infecção bacteriana das células aderentes. Este ensaio é compatível com citometria de fluxo, imunocoloração e microscopia de força de tração, permitindo medições quantitativas das interações biomecânicas entre células, matriz extracelular e bactérias patogênicas.

Um ensaio de poliacrilamida-baseado formato multi bem para estudar o efeito da rigidez da matriz extracelular sobre a infecção bacteriana das células aderentes

As forças mecânicas são importantes para controlar a migração celular. Este protocolo demonstra o uso de hidrogéis elásticos que podem ser deformados usando uma micropipeta de vidro e um micromanipulador para estimular as células com um gradiente de rigidez local para provocar mudanças na estrutura celular e migração.

Ensaio de Durotaxis de célula única para avaliar o controle mecânico do movimento celular e eventos de sinalização relacionados

Apresentado aqui é o protocolo da técnica Conpokal, que combina microscopia de força confocal e atômica em uma única plataforma de instrumentos. Conpokal fornece a mesma célula, mesma região, imagens confocal simultâneas e caracterização mecânica de amostras biológicas vivas.

Microscopia confocal e força atômica (Conpokal) em células vivas

Recentemente, identificamos o enrijecimento capilar da retina como um novo paradigma para a disfunção retiniana associada ao diabetes. Este protocolo elabora as etapas para o isolamento dos capilares retinianos de camundongos e da matriz subendotelial das culturas endoteliais da retina, seguidas de uma descrição da técnica de medição da rigidez usando microscopia de força atômica.

Isolamento de capilares retinianos de camundongos e matriz subendotelial para medição de rigidez usando microscopia de força atômica

Este protocolo visualiza como preparar criossecções de tecido pulmonar murino, realizar experimentos de mapa de força de microscopia de força atômica e analisar os dados para determinar o módulo de Young da membrana basal pulmonar murina nativa.

Extraindo o módulo de Young de membranas basais pulmonares murinas nativas de mapas de força derivados de microscopia de força atômica

Este protocolo demonstra como gerar tumores clonais fluorescente marcada, geneticamente definidas no Drosophila olho / discos imaginais antenares (DAE). Ele descreve como dissecar o EAD e do cérebro a partir do terceiro larvas e como processá-los para visualizar e quantificar as mudanças de expressão gênica e invasão tumoral.

o<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

Aprenda a modelar a rigidez da membrana basal usando AGEs para estudar comportamento invasivo em câncer de próstata metastático. Este método integra química, física e biologia para replicar condições tumorais clínicas.

Como Estudar Basement Membrane Rigidez como um gatilho Biofísica no cancro da próstata e outras patologias relacionadas com a idade ou Doenças Metabólicas (Vídeo) | JoVE Journal

Como Estudar Basement Membrane Rigidez como um gatilho Biofísica no cancro da próstata e outras patologias relacionadas com a idade ou Doenças Metabólicas

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