Engenharia tridimensionais tecidos epiteliais incorporado dentro Matriz Extracelular

O objetivo deste procedimento é projetar um aumento de tecidos tridimensionais idênticos que são incorporados em um gel de colágeno para uso em muitos contextos experimentais, como determinar a influência do estresse mecânico na morfogênese ramificada. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na morfogênese do tecido, como determinar os mecanismos subjacentes do comportamento celular coletivo. A principal vantagem dessa técnica é que a geometria dos tecidos projetados é controlada e reprodutível, permitindo a manipulação e medição precisas de fatores físicos e bioquímicos.

Assim, o tamanho da amostra é grande o suficiente para que as conclusões possam ser feitas com alta confiança estatística. Comece preparando um mestre de silício fotopadronizado com a matriz desejada usando técnicas de fotolitografia padrão. O padrão usado neste vídeo consiste em estruturas retangulares espaçadas de 200 mícrons.

Em seguida, misture 50 gramas de PDMS combinando o pré-polímero e um agente de cura em um prato descartável na proporção de 10:1. Em seguida, coloque a mistura sob vácuo por 15 a 30 minutos para remover quaisquer bolhas de ar que foram introduzidas durante o processo de mistura. Coloque o lado texturizado mestre de silício para cima no barco de pesagem de plástico e despeje a solução PDMS desgaseificada em cima do molde.

Em seguida, coloque o prato no forno e catalise o PDMS a 60 graus Celsius por 12 horas. Depois de curado, remova o PDMS e o mestre do recipiente de plástico. Separe cuidadosamente o PDMS do wafer de silício.

Em seguida, use uma lâmina de barbear limpa para remover qualquer excesso de PDMS ao redor dos recursos impressos. Agora, use uma lâmina de barbear para cortar o PDMS padronizado em selos retangulares individuais. Armazene esses carimbos com o lado voltado para cima em uma placa de Petri limpa de 100 milímetros de diâmetro.

Em seguida, prepare um novo lote de solução PDMS desgaseificada usando a mesma proporção de 10:1 de pré-polímero para agente de cura. Gire a camada de dois a três gramas desta solução em uma placa de Petri de 100 milímetros de diâmetro e, em seguida, cure o PDMS por 12 horas a 60 graus Celsius. Em seguida, use uma lâmina de barbear para cortar a fina camada de PDMS em retângulos para serem usados como suporte para os carimbos.

São necessários dois suportes para cada selo. Depois que todos os suportes estiverem cortados, esterilize os carimbos e suportes PDMS mergulhando-os em etanol a 70% e secando-os com um aspirador em uma cabine de biossegurança. Em um gabinete de biossegurança, adicione 50 microlitros de 1% BSA em PBS ao topo de cada selo.

Coloque os selos cobertos de gotículas a quatro graus Celsius por um período mínimo de quatro horas para garantir que o BSA seja absorvido pela superfície do selo. Em seguida, devolva os carimbos ao gabinete de biossegurança e aspire a solução BSA dos carimbos PDMS. Em seguida, lave as superfícies dos carimbos duas vezes com 50 microlitros de meio de cultura de células.

Aspire o meio após cada lavagem. Disponha uma placa de cultura de tecidos de 35 milímetros de diâmetro para cada carimbo PDMS. Em cada prato, coloque dois suportes PDMS separados por uma distância ligeiramente menor que o comprimento dos carimbos PDMS.

Em seguida, use uma pinça para pegar lamínulas de vidro de 15 milímetros de diâmetro e esterilize-as com etanol a 70%. Aspire o excesso de líquido das lamínulas enquanto as segura com a pinça e guarde-as em uma placa de Petri separada. Em seguida, dispense 50 microlitros de uma mistura de colágeno de quatro miligramas por mililitro diretamente em cada carimbo para revestir uniformemente a superfície dos selos PDMS.

Usando a pinça, pegue cada um dos selos PDMS revestidos de colágeno e inverta-os suavemente. Abaixe o lado do colágeno dos selos invertidos para baixo em cima dos suportes PDMS nas placas de cultura de tecidos. Em seguida, incube os pratos a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Em seguida, dispense 50 microlitros da mistura de colágeno restante em cada uma das lamínulas circulares e incube-as a 37 graus Celsius por 30 minutos. Neste ponto, colha o tipo de célula de seu interesse. Aqui, temos células epiteliais de mamute de camundongo EpH4 que suspendemos em uma concentração entre um e 10 milhões de células por mililitro.

Agora, remova as amostras de colágeno gelificado da incubadora. Usando a pinça, levante suavemente os carimbos PDMS para cima para separá-los do colágeno moldado e descarte-os. É importante levantar o carimbo para cima para não distorcer as características do gel de colágeno.

Dispense 30 microlitros da suspensão celular concentrada na superfície de cada gel de colágeno contendo cavidades moldadas da geometria desejada. Observe as células sob um microscópio de campo claro enquanto agita suavemente os pratos de um lado para o outro para promover o assentamento celular dentro das cavidades. As cavidades devem ser preenchidas em cinco minutos.

Para remover o excesso de células ao redor das cavidades, incline cada placa de cultura de tecidos de lado e dispense suavemente 400 microlitros de meio de cultura de células sobre a superfície do gel de colágeno. É importante lavar suavemente dispensando lentamente o meio de cultura sobre o gel enquanto inclina o prato para que o excesso de células na superfície do gel seja removido e as células nas cavidades do gel não sejam deslocadas. Aspire o líquido e repita a lavagem mais duas vezes.

Verifique os géis de colágeno ao microscópio entre cada lavagem para observar quando o excesso de células foi enxaguado. Depois que o excesso de células for eliminado ao redor das cavidades cheias de células, coloque as placas de cultura de tecidos em uma incubadora a 37 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, usando a pinça, inverta suavemente as lamínulas de vidro revestidas de colágeno e coloque-as em cima dos moldes de colágeno preenchidos com células para que o colágeno da lamínula forme uma tampa sobre as cavidades preenchidas com células.

Incube as amostras a 37 graus Celsius por 15 minutos. Uma vez que as tampas de colágeno tenham aderido aos moldes de colágeno preenchidos com células, dispense de dois a 2 1/2 mililitros de meio de cultura de células lentamente sobre as lamínulas de cobertura de vidro em cima dos géis e cultive as amostras a 37 graus Celsius por um a três dias. Essas imagens são de visualizações de baixa e alta ampliação das matrizes moldadas em um gel de colágeno tipo I antes da semeadura celular.

A forma dos poços é determinada pela forma das características no mestre de silício. Aqui, os poços retangulares foram preenchidos com células epiteliais gigantescas. Neste exemplo, cada poço retangular de 200 por 50 mícrons contém aproximadamente 80 a 100 células.

24 horas após a semeadura celular, as células foram observadas aderindo umas às outras dentro dos poços para formar um tecido. 24 horas após a adição de um fator de crescimento HGF ao meio de cultura, os tecidos são vistos passando por morfogênese ramificada. Uma das proteínas envolvidas na migração celular é a quinase de adesão focal, que, como você pode ver nesta imagem composta, aumenta nas extremidades dos poços onde normalmente ocorre a ramificação.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em duas horas se executada corretamente. Após este procedimento, outros métodos como microscopia de força de tração, RT-PCR em tempo real e Western Blotting, podem ser realizados para determinar as forças exercidas pelas células à medida que migram e as mudanças nos níveis de transcrição e proteína dos genes de interesse. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar este modelo de cultura de células 3D no qual tecidos de geometria inicial definida são incorporados em um gel de colágeno.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.