Engenharia tridimensionais tecidos epiteliais incorporado dentro Matriz Extracelular

O objetivo deste procedimento é criar um aumento de tecidos tridimensionais idênticos, embutidos em um gel de colágeno, para uso em diversos contextos experimentais, como a determinação da influência do estresse mecânico na morfogênese ramificada. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na morfogênese tecidual, como identificar os mecanismos subjacentes ao comportamento coletivo das células. A principal vantagem desta técnica é que a geometria dos tecidos projetados é controlada e reprodutível, permitindo manipulação precisa e medição de fatores físicos e bioquímicos.

Assim, o tamanho da amostra é grande o suficiente para que conclusões possam ser feitas com alta confiança estatística. Comece preparando um molde de silício fotopadronizado com o seu arranjo desejado, utilizando técnicas padrão de fotolitografia. O padrão utilizado neste vídeo consiste em estruturas retangulares espaçadas a 200 micrômetros de distância.

Em seguida, misture 50 gramas de PDMS combinando o prepoliímero e um agente de cura em um recipiente descartável na proporção de 10:1. Depois, coloque a mistura sob vácuo por 15 a 30 minutos para remover quaisquer bolhas de ar introduzidas durante o processo de mistura. Coloque o molde de silício com o lado texturizado voltado para cima em um barquinho plástico para pesagem e despeje a solução de PDMS dessareada por cima do molde.

Em seguida, coloque a placa em uma estufa e cure o PDMS a 60 graus Celsius por 12 horas. Após a cura, remova o PDMS e o molde da embalagem plástica. Separe cuidadosamente o PDMS da bolacha de silício.

Em seguida, utilize uma lâmina de barbear limpa para remover qualquer excesso de PDMS ao redor das características impressas. Agora, use uma lâmina de barbear para cortar o PDMS padronizado em carimbos retangulares individuais. Armazene esses carimbos com o lado das características voltado para cima em uma placa de Petri limpa de 100 milímetros de diâmetro.

Em seguida, prepare um novo lote de solução de PDMS dessalgada usando a mesma proporção de 10:1 de pré-polímero para agente de cura. Aplique por centrifugação dois a três gramas dessa solução sobre uma placa de petri com diâmetro de 100 milímetros e, em seguida, cure o PDMS por 12 horas a 60 graus Celsius. Depois, use uma lâmina de barbear para cortar a fina camada de PDMS em retângulos que serão utilizados como suportes para os carimbos.

São necessários dois suportes para cada carimbo. Depois que todos os suportes forem cortados, esterilize os carimbos de PDMS e os suportes imergindo-os em etanol 70% e secando-os com um aspirador em uma cabine de segurança biológica. Em uma cabine de segurança biológica, adicione 50 microlitros de BSA 1% em PBS sobre cada carimbo.

Coloque os carimbos cobertos com a gota a quatro graus Celsius por um mínimo de quatro horas para garantir que a BSA seja absorvida na superfície do carimbo. Em seguida, retorne os carimbos para a cabine de segurança biológica e aspire a solução de BSA dos carimbos de PDMS. A seguir, lave as superfícies dos carimbos duas vezes com 50 microlitros de meio de cultura celular.

Aspire o meio após cada lavagem. Prepare um prato de cultura de tecidos de 35 milímetros de diâmetro para cada carimbo de PDMS. Em cada prato, posicione dois suportes de PDMS separados por uma distância ligeiramente menor que o comprimento dos carimbos de PDMS.

Em seguida, utilize um par de pinças para pegar lamínulas de vidro com diâmetro de 15 milímetros e esterilize-as usando álcool 70%. Aspire o líquido em excesso das lamínulas enquanto as segura com as pinças e, em seguida, armazene-as em uma placa de petri separada. A seguir, distribua 50 microlitros de uma mistura de colágeno a 4 miligramas por mililitro diretamente sobre cada carimbo, cobrindo uniformemente a superfície dos carimbos de PDMS.

Usando a pinça, pegue cada carimbo de PDMS revestido com colágeno e inverta-os suavemente. Posicione os carimbos invertidos com o lado do colágeno voltado para baixo sobre os suportes de PDMS nas placas de cultura celular. Em seguida, incube as placas a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Em seguida, distribua 50 microlitros da mistura restante de colágeno sobre cada uma das lamínulas circulares e incube-as a 37 graus Celsius por 30 minutos. Neste ponto, colete o tipo celular de interesse. Aqui, utilizamos células epiteliais mamárias de camundongo EpH4 que suspendermos numa concentração entre um e 10 milhões de células por mililitro.

Agora, remova as amostras de colágeno gelificadas do incubador. Usando a pinça, levante cuidadosamente os carimbos de PDMS verticalmente para desprendê-los do colágeno moldado e descarte-os. É importante levantar o carimbo verticalmente para não distorcer as características no gel de colágeno.

Dispense 30 microlitros da suspensão concentrada de células sobre a superfície de cada gel de colágeno contendo cavidades moldadas com a geometria desejada. Observe as células ao microscópio de campo claro enquanto agita suavemente as placas de um lado para o outro para promover a sedimentação das células dentro das cavidades. As cavidades devem ser preenchidas em até cinco minutos.

Para remover as células em excesso ao redor das cavidades, incline cada placa de cultura de tecidos sobre a lateral e dispense suavemente 400 microlitros de meio de cultura celular sobre a superfície do gel de colágeno. É importante lavar suavemente, dispensando lentamente o meio de cultura sobre o gel enquanto inclina a placa, de modo que as células em excesso na superfície do gel sejam removidas sem deslocar as células nas cavidades do gel. Aspire o líquido e repita a lavagem mais duas vezes.

Verifique os géis de colágeno ao microscópio entre cada lavagem para observar quando as células em excesso tiverem sido removidas. Após a remoção das células em excesso ao redor das cavidades preenchidas com células, coloque as placas de cultura de tecidos em um incubador a 37 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, usando a pinça, inverta suavemente as lamínulas de vidro revestidas com colágeno e coloque-as sobre os moldes de colágeno preenchidos com células, de modo que o colágeno da lamínula forme uma tampa sobre as cavidades preenchidas com células.

Incube as amostras a 37 graus Celsius por 15 minutos. Após as tampas de colágeno aderirem aos moldes de colágeno preenchidos com células, adicione lentamente de dois a 2 1/2 mililitros de meio de cultura celular sobre as lamínulas de vidro localizadas na parte superior dos géis e cultive as amostras a 37 graus Celsius por um a três dias. Essas imagens são de vistas com baixa e alta ampliação das matrizes moldadas em um gel de colágeno tipo I antes da semeadura celular.

A forma dos poços é determinada pela forma das estruturas no molde de silício. Aqui, os poços retangulares foram preenchidos com células epiteliais mamárias. Neste exemplo, cada poço retangular de 200 por 50 mícrons contém aproximadamente 80 a 100 células.

24 horas após o semeadura das células, observou-se que as células aderiam umas às outras dentro dos poços, formando um tecido. 24 horas após a adição do fator de crescimento HGF ao meio de cultura, observa-se que os tecidos estão passando por morfogênese ramificada. Uma das proteínas envolvidas na migração celular é a quinase de adesão focal, que, como pode ser visto nesta imagem composta, aumenta nas extremidades dos poços onde normalmente ocorre a ramificação.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em até duas horas, se realizada corretamente. Após este procedimento, outros métodos como microscopia de força de tração, RT-PCR em tempo real e Western blotting podem ser realizados para determinar as forças exercidas pelas células durante sua migração, bem como as alterações nos níveis de transcritos e proteínas dos genes de interesse. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar este modelo de cultura celular tridimensional no qual tecidos de geometria inicial definida são incorporados em um gel de colágeno.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.