Name: Um método para a determinação e simulação da permeabilidade e difusão em um modelo 3D do tecido em uma membrana inserir sistema para placas multi bem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprenda a determinar a permeabilidade e difusão em modelos 3D de pele usando um sistema de inserção de membrana em placa de 96 poços. Este método computacional permite medições diretas e simulações otimizadas para aplicações farmacêuticas e cosméticas.

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Este trabalho foi criado com o apoio financeiro da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) sob concessão não. PO413/12-1 e LA 1028/7-1.

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Uwe Marx é o CEO e acionista e Gerd Lindner é uma acionista da TissUse GmbH, uma empresa de fabricação e comercialização da tecnologia MOC. Outros autores não declaram nenhum conflito de interesses sobre a publicação deste artigo.

Este estudo documenta um método desenvolvido para quantificar a permeação através de uma construção de tecido projetada numa membrana. Permeação de substâncias com diferentes tamanhos de moleculares através do gel do agarose analisou-se primeiro para testar e validar o método e a simulação correspondente. É sabido que moléculas menores permeiam mais rápido através de uma malha de matriz (com exceção do efeito em gel filtração por cromatografia de permeabilidade). Observações semelhantes foram feitas com experimentos de tamanho-exclusão de substâncias através da esclera26, membrana epidérmica humano27, pele humana17e de pele de rato28. Uma correlação inversa entre coeficientes de permeabilidade e o correspondente raio de Stokes (o raio de uma esfera dura que se move com a mesma taxa de difusão, como as moléculas descritas, geralmente menores do que o raio eficaz da molécula) tem sido demonstrado 26 , 28e uma relação semelhante foi observada em experimentos com substâncias de diferentes tamanhos moleculares. Plotando-se os coeficientes de permeabilidade ao longo do raio 1/Stokes, verificou-se uma correlação linear sobre os quatro grupos, com o menor tamanho molecular (R2 = 0,93) (Figura 6). Isso indica que coeficientes de permeabilidade simulado com o método sugerido estão em uma escala realista.
O erro de 46.15% nos experimentos é ligeiramente maior do que o relatado por experimentos de permeabilidade com o Franz difusão celular sistema10. Uma explicação possível seria a distribuição de tamanho de fluoresceína-isotiocianato-dextrano, que é discutido mais tarde.
O método descrito tem importantes vantagens em comparação com métodos usando o sistema de célula de difusão de Franz. Em primeiro lugar, a instalação é mais compacta; os experimentos são executados diretamente em um sistema de inserção de membrana, que tem a escala de uma placa bem comercial (∼ 13 x 8,5 cm). Isso permite que várias amostras para serem executados simultaneamente, Considerando que uma célula de difusão de Franz separada é necessária para cada amostra. Em segundo lugar, a permeabilidade de um modelo de pele pode ser medida diretamente na inserção da membrana, onde se realiza o cultivo. Usando células de difusão de Franz, as amostras têm de ser retirado e montado sobre o sistema, que é mais complicado para pequenas amostras e também é mais demorado.
Experimentos de permeação com matrizes de células de colágeno mostraram que esse método pode ser aplicado com sucesso em sistemas celulares-semeado. O modelo apresentado aqui foi verificado para os modelos de pele; no entanto, o método pode ser aplicado a outros tipos de culturas de células orgânicas, por exemplo, renal ou hepática.
Neste estudo, um modelo de colágeno-celular foi usado no qual as células HaCaT coberto completamente a superfície do modelo (ver Figura 5). Isto levou a uma redução do coeficiente de permeabilidade, demonstrando que o método é sensível o suficiente para distinguir o coeficiente de permeabilidade entre um modelo de colágeno-célula com e sem uma camada de HaCaT. Idealmente, um modelo de pele deveria construir uma barreira, que se aproxima da epiderme de uma verdadeira pele de29, e, portanto, é importante verificar a qualidade (e.g., edifício da derme, epiderme) do modelo da pele antes da utilização real. O desenvolvimento de um modelo de pele pode ser visualizado com técnicas de coloração e quantificado de detecção de pele proteína e colágeno30,31,32. O coeficiente de permeabilidade também pode ser um fator importante para avaliar o desenvolvimento do modelo de pele, mas ainda mais experimentos são necessários para confirmar isto. Como mencionado anteriormente, este método permite que várias amostras em execução em paralelo. Também é possível tirar amostras durante o cultivo para medir a permeabilidade e, assim, acompanhar o desenvolvimento deste parâmetro do modelo de pele.
Note-se que a permeabilidade é medida através de um gel/colágeno-celular-modelo e uma membrana simultaneamente. O coeficiente de permeabilidade detectado é específicas do sistema, no qual os resultados de modelos diferentes de pele só podem ser comparados ao usar a mesma inserção de membrana. Além disso, o modelo de pele precisa de cobrir a área de cultivo inteiro para garantir que a substância permeate somente através do modelo e não adjacente a ele, que iria induzir a erros de permeabilidade medida. Outro aspecto que deve ser considerado no futuro experimentos é o ambiente natural em torno da pele. Normalmente, a temperatura da superfície da pele é mais baixa em comparação com a região interna, que pode influenciar as condições de permeação.
A fim de alinhar as experiências de laboratório com simulações de computador, foi apresentado um método que permite a otimização de parâmetro para simulação aplicada. Simulações foram encontradas para coincidir com dados experimentais para substâncias com pequeno tamanho molecular. No entanto, observaram-se desvios entre dados experimentais e de simulação para substâncias com maior tamanho molecular. Polissacarídeo grandes moléculas podem aumentar a fricção e retardar o processo de difusão em um gel. Este efeito provoca difusão anormal, que é uma razão possível para o desvio entre o experimental e simulação os valores de33,34. Outra explicação pode ser a presença de partículas de menores ou maiores em fluoresceína-isotiocianato-dextrano. O fabricante especifica o peso molecular da substância, como o tamanho médio, com um intervalo determinado, que permite que as partículas maiores e menores estar presente. É também incerto dispersos como essas substâncias são, como as partículas menores permeiam mais rápido através do gel e o canal de fluido. É possível estender a simulação para considerar estes difusão e efeitos de atrito.
O experimento de permeabilidade e simulação foram desenvolvidos para uso em um 2-oC. Com a ajuda da simulação, este método experimental pode ser transferido diretamente para as configurações mais sofisticadas de experimentais. Por exemplo, a simulação de sistema de inserção de membrana facilmente pode ser transferida para a geometria de um 2-OC ou outros sistemas com instalações semelhantes. Esta opção de modulação a simulação pode ser usada para apoiar o projeto de experimentos futuros. Além disso, efeitos colaterais, como evaporação, difusão anormal e efeitos de membrana podem ser integrados para reforçar a simulação, melhorando assim a precisão. O programa de simulação dá a oportunidade de alterar ou melhorar a equação de simulação, bem como a integrar outros módulos físicos a fim de investigar outros aspectos do desenvolvimento do modelo de pele. Um exemplo é a simulação da produção de lactato e consumo de glicose em um modelo de células de colágeno.
Um aspecto particularmente interessante no teste de substâncias médicas é como as substâncias são distribuídas em um sistema de órgãos-em-um-microplaqueta. O parâmetro de simulação e permeabilidade minha ajuda para responder a perguntas tais como o quão rápido uma substância permeia o sistema bem como a concentração que estará disponível para outros tecidos em um chip multi-organ. Esse método pode apoiar e reforçar o desenvolvimento e teste de tais sistemas de órgão-em-microplaqueta.

Organo-típico 3D culturas tornaram-se ferramentas poderosas para o desenvolvimento de drogas e substância teste1. Neste aspecto, modelos de pele humana são de especial interesse devido a requisitos regulatórios, tais como aqueles na indústria de cosméticos. Posteriormente, eles levaram ao desenvolvimento de inúmeros modelos 3D da pele, para utilização em suas próprias como culturas de single-órgão em placas multi bem, ou multi-organ-fichas em combinação com modelos de órgão adicional, por exemplo, o fígado2.
Em relação ao cultivo de um equivalente de pele, a interface ar-líquido (ALI) é um elemento essencial para a adequada diferenciação epidérmica3. Inserções de cultura de célula compostas de um navio com uma membrana permeável ao líquido na parte inferior são normalmente usadas para estabelecer um ALI. ALIs são amplamente utilizados em modelos de pele disponível comercialmente como EpiDerm4, Phenion5e Episkin6, para a cultura de modelos de pele com tamanhos de 96 poços (4,26 mm de diâmetro) até placas boas 12 (12,2 milímetros de diâmetro). O método descrito aqui determina a permeação de substâncias em um sistema de inserção de membrana.
O coeficiente de permeabilidade é um parâmetro importante para avaliar a qualidade de qualquer modelo de pele cultivada em comparação com pele nativa5e é usado para avaliar quão rapidamente as substâncias activas migram através da pele. Especialmente se medicamentos ou cosméticos produtos precisam ser aplicado sobre a pele, este parâmetro é essencial para compreender quando precisamente os agentes passam através dela. Uma simulação pode ajudar ainda mais para predizer o comportamento do sistema e posteriormente reduzir o necessário esforço experimental demorado, especialmente quando um grande conjunto de substâncias está envolvido.
A célula de difusão de Franz é o estado-da-arte para permeação experimentos com pele e pele modelos5,6,7,8,9. Este dispositivo consiste de dois compartimentos com uma amostra fixa (barreira de difusão) no meio. A substância a ser testado é aplicada diretamente ao topo da amostra (compartimento doador) e a concentração do composto penetrante pode ser detectada no compartimento do oposto (aceitador). No lado acceptor, temperatura constante e a concentração da substância homogênea são asseguradas através de uma câmara de temperatura e de um agitador magnético. Amostras podem ser recolhidas de um braço de amostragem no lado aceitador da célula de Franz. Com uma faixa de altura entre 19 cm e 179 cm, este sistema é relativamente grande de10,11. Outro método para a determinação dos coeficientes de difusão em substâncias gelatinosa e tecidos é FRAP. Esta técnica usa o princípio de branqueamento fluorescente etiquetado partículas em gel e em seguida determinar o tempo de recuperação da área branqueada para calcular a difusão coeficiente12,13,14.
Além disso, espectroscopia de infravermelho de transformação de Fourier (FTIR) pode ser usada para detectar o movimento de partículas com absorbância de luz infravermelha para determinar o processo de permeação de substâncias na pele15,16. No entanto, estes ou outros métodos de imagem (por exemplo, de espectroscopia de correlação de dois fotões fluorescência17) precisam custar instrumentos intensivos.
Neste artigo, um método é apresentado para medir diretamente a permeabilidade de uma barreira dentro de um sistema de inserção de membrana, onde um modelo de pele pode ser cultivado. Esse método permite experimentos de permeabilidade seja executado com um grande número de pequenas amostras (bem tamanho acima para 4,26 mm) em um sistema compacto. Isto está em contraste com a célula de difusão de Franz, onde um dispositivo separado é necessária para cada teste, o que tem de ser montado no dispositivo e é difícil perceber para amostras pequenas (tamanho de 4,26 mm). Além disso, uma vez que o método não requer grande instrumentação (por exemplo, um microscópio confocal ou do multiphoton), é obter uma redução no tempo e no custo.
Todos os experimentos foram realizados em membrana microporosa inserir sistemas com uma amostra (barreira) consiste em gel de agarose ou um modelo de célula de colágeno estabelecido na membrana. Substâncias fluorescentes (doador) com diferentes tamanhos moleculares foram aplicadas para o topo da amostra e a concentração da substância permeated foi detectada na parte inferior (aceitador) usando um leitor de placa de fluorescência (ver Figura 1). Para validar o método e testar a precisão desta simulação, géis de agarose foram produzidos e utilizados como uma barreira. Hidrogel é geralmente utilizados para a investigação dos processos de difusão e permeação em meio poroso em ciências biológicas13. Então, o método foi testado em um sistema de célula-semeado consiste em uma matriz de colágeno dos fibroblastos primários e adulto baixo cálcio alta temperatura queratinócitos (HaCaT) células humanas (modelo de célula-matriz), que é uma pele simplificado modelo18,19 .
Além disso, o processo de permeação foi simulado através de simulações de fluxo com dinâmica de fluidos computacional. Verificou-se que, por meio da otimização de parâmetro, o coeficiente de difusão poderia ser calculado a partir dos dados experimentais. Em geral, esta simulação oferece diferentes aplicações; por exemplo, é possível prever um processo de permeação com base em experiências curtas e a simulação pode reduzir significativamente o número de experimentos.
Simulação e método experimental foram projetadas para aplicação de um sistema de órgãos-em-um-microplaqueta1,20,21, especificamente o 2-órgão-chip (2-OC) desenvolvido comercialmente1,22, 23,24,25. Em princípio, o processo de permeação de qualquer modelo de órgão com base em sistemas de inserção de membrana pode ser descrito desta forma.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth</td><td>K297.2</td><td>Colágeno em pó de alta resolução</td></tr><tr><td>Serva</td><td></td><td>47256.01</td><td>Solução de colágeno R 0,4%</td></tr> <tr><td>DMEM</td><td>Lonza (Biozym Scientific GmbH)</td> <td>880010-12</td><td>Alta glicose com L-glutamina</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom GmbH</td><td>S0615 0114F</td><td>Soro de bezerro fetal</td></tr><tr><td>Fluoresceína Sal de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46960-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceína Isotiocianato-dextrano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46944-500MG</td><td>4000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluoresceína Isotiocianato-dextrano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S-250MG</td><td>10 000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluoresceína Isotiocianato-dextrano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD20S-250MG</td><td>20 000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluoresceína Isotiocianato-dextrano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD40S-250MG</td><td>40 000 g/mol</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14170120</td><td>sem cálcio, sem magnésio, com vermelho de fenol</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1.06467.9010</td><td>comprimidos granulados</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td>Transwell</td></tr><tr><td>Inserções de Cultura de Células</td><td>Corning</td><td>3391</td><td>96 poços, 0,4 &micro; Tamanho do poro m</td></tr><tr><td>Transwell Cell Culture Inserts</td><td>Corning (VWR)</td><td>734-1563</td><td>12 poços, 0.4 &micro; m tamanho do poro</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Biochrom GmbH</td><td>L2143</td><td>com EDTA</td></tr></tbody></table>

um método para a determinação e simulação da permeabilidade e difusão em um modelo 3d do tecido em uma membrana inserir sistema para placas multi bem

A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

Em vitro cultivada pele modelos tornaram-se cada vez mais relevantes para aplicações farmacêuticas e cosméticas e também são usados no desenvolvimento de drogas, bem como a substância de teste. Estes modelos são cultivados principalmente em sistemas de membrana-inserção, sua permeabilidade em direção a diferentes substâncias, sendo um factor essencial. Normalmente, os métodos aplicados para a determinação desses parâmetros geralmente exigem tamanhos de amostra grande (por exemplo, célula de difusão de Franz) ou laborioso equipamento (por exemplo, recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP)). Este estudo apresenta um método para a determinação de coeficientes de permeabilidade diretamente nos sistemas de membrana-inserção com tamanhos de diâmetro de 4,26 e 12,2 mm (área de cultivo). O método foi validado com agarose e gel de colágeno, bem como um modelo de célula de colágeno que representa modelos de pele. Os processos de permeação de substâncias com diferentes tamanhos moleculares e permeação através de modelos de célula diferente (composto de gel de colágeno, fibroblastos e HaCaT) foram descritos com precisão.
Além disso, para apoiar o método experimental acima, estabeleceu-se uma simulação. A simulação se encaixa os dados experimentais bem para substâncias com pequeno tamanho molecular, até 14 x 10-10 m de raio de Stokes (4.000 MW), e, portanto, uma ferramenta promissora para descrever o sistema. Além disso, a simulação pode reduzir consideravelmente os esforços experimentais e é robusta o suficiente para ser estendido ou adaptado para instalações mais complexas.

Experimentos de permeabilidade de uma membrana de 96 poços inserir sistema com gel de agarose 2% como uma barreira foram realizados para avaliar a precisão de uma simulação. Sal de sódio de fluoresceína (pregarias) e isotiocianato de fluoresceína-dextranos (FD) foram usados para verificar o impacto do tamanho molecular da substância difusor de 5 x 10-10 m acima de 45 x 10-10 m de raio Stokes (376.27-40.000 mol wt). Otimização de parâmetro nativo da simulação utilizou-se para caber a simulação de dados experimentais.
Para esse fim, encostas das partes apenas lineares da permeabilidade simulada foram comparadas com os resultados experimentais. Para pequenos tamanhos moleculares, simulação e dados experimentais foram em bom acordo com 99,2% para pregarias e 80,2% para FD 4.000 (ver figura 4a e figura 4b). Tamanho molecular maior gerado desvios superiores mostrando correlações de 50,5% para 10.000 FD, 79,7% para 20.000 FD e 53,6% para 40.000 FD. Curva de progressão nas simulações mostrou um atraso no início e um aumento mais forte no curso mais dos gráficos (ver Figura 4 c–4e).
Coeficientes de permeabilidade e coeficientes de difusão simulado são mostrados em tabela 4. O coeficiente de permeação diminui com o aumento de tamanho molecular. Desvio padrão foi entre 0,08 x 10-8 m/s e 0,47 x 10-8 m/s (N = 7), que correspondeu a um erro absoluto de entre 4,18% e 46.15%. Experimentos com moléculas maiores mostraram um maior erro absoluto. Os coeficientes de difusão simulado comportou-se muito similarmente aos coeficientes de permeabilidade experimental. Substâncias com raios maiores de Stokes mostraram diminuição coeficientes de difusão e o erro absoluto variou entre 9,09% e 18.46% (N = 3).
Em experimentos adicionais de permeação, quatro tipos de modelo de células de colágeno diferentes foram usados como barreiras em uma membrana de 12-bem inserir sistema. Estes modelos incluem um modelo de célula livre e um modelo de celular com diferentes combinações de fibroblastos primários no gel de colágeno e HaCaT na superfície. Foram utilizadas as seguintes combinações: colágeno (col) como um modelo sem célula, colágeno + fibroblastos (Col. + F.), colágeno + HaCaT (Col. + H.) e colágeno, fibroblastos + HaCaT (Col. + f + H.). Sal de sódio de fluoresceína com DMEM + 10% FCS foi utilizado como substância de doador. Para imagem utilizou-se a análise do modelo de células de colágeno, coloração com hematoxilina e eosina (HE). Esta coloração foi feito usando o protocolo do fabricante. Na Figura 5, é mostrada uma mancha com um modelo Col + f + h... O HE manchas ligeiramente a estrutura da matriz de colágeno do tecido. Os fibroblastos estão localizados na matriz, e os núcleos dos fibroblastos e células HaCaT são corados em violeta escura. Sobre a matriz de colagénio, há uma camada que contém muitos núcleos, que devem ser os núcleos de HaCaTs, construindo uma delimitador camada na parte superior do modelo.
Na tabela 5, coeficientes de permeação experimental e coeficientes de difusão simulado são listados. Uma tendência pode ser vista para a maioria dos modelos com HaCaT, que têm coeficientes de permeação/difusão inferiores em comparação com os modelos sem HaCaT. O erro absoluto dos coeficientes de permeação é 10,9-24,4% e para a difusão coeficientes 5.2-12,9%.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig1.jpg"> Figura 1: vista lateral do experimento em uma membrana de permeabilidade inserir sistema. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig2.jpg"> Figura 2: gráfico exemplar de um experimento de permeabilidade. A concentração do aceitador é plotada ao longo do tempo. Duas linhas tracejadas suporte a parte quase linear do gráfico. A inclinação da parte linear é usada para determinar o coeficiente de permeabilidade. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig3.jpg"> Figura 3: geometria e malha da membrana inserir sistema na simulação. (a) geometria da membrana 96 poços sistema de inserção. (b), geometria da membrana 12-poços sistema de inserção. sistema de inserção (c), malha da membrana de 96 poços. (d) malha da membrana 12-poços sistema de inserção. (e) seção transversal e parâmetros da membrana inserem sistema. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig4.jpg"> Figura 4: comparação dos dados experimentais de uma experiência de permeação para a simulação otimizada. (um) fluoresceína sal de sódio, (b) de fluoresceína isotiocianato-dextrano 4.000 mol peso, peso de mol (c) 10.000, (d) 20.000 mol de peso e peso de mol (e) 40.000 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig5.jpg"> Figura 5: representante HE coloração de um modelo de célula de colágeno (fibroblastos, colágeno + HaCaT). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig6.jpg"> Figura 6: coeficiente de permeabilidade em função do raio 1/Stokes, usando o sal de sódio de fluoresceína e isotiocianato de fluoresceína-dextran em uma membrana de 96 poços inserir sistema. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome</td>
			<td>Experession para 96 sistema bem em mm</td>
			<td>Experssion para o sistema de 12-poços em mm</td>
			<td>Descrição</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_tran</td>
			<td>5.65 [mm]</td>
			<td>14,7 [mm]</td>
			<td>Diâmetro do poço</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_a</td>
			<td>4.26 [mm]</td>
			<td>12.1 [mm]</td>
			<td>Diâmetro da membrana</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_w</td>
			<td>8.79 [mm]</td>
			<td>21.97 [mm]</td>
			<td>Diâmetro do aceitador</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_b</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>Heigh da barreira</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_sp</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>Distância entre o bem e de fundo</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_a</td>
			<td>4.73 [mm]</td>
			<td>5.24 [mm]</td>
			<td>Alta do aceitador</td>
		</tr>
<tr>
<td>b</td>
			<td>h_b/2</td>
			<td>-</td>
			<td>Profundidade de imersão</td>
		</tr>
<tr>
<td>r</td>
			<td>((d_a)^2+4*b^2)/(8*b)</td>
			<td>-</td>
			<td>Raio de bola de imersão+
</td>
		</tr>
<tr>
<td>r_z</td>
			<td>r + h_b</td>
			<td>-</td>
			<td>z-posição da bola de imersão+
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: parâmetros de geometria para simulação de "Transporte de espécies químicas". + Apenas para ser usado para a simulação de agarose gel em 96 membrana bem inserir sistema.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome</td>
			<td>Expressão</td>
			<td>Valor</td>
			<td>Descrição</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_fl</td>
			<td>0.1 [mg/ml]/376.28 [g/mol]</td>
			<td>0.26576 mol/m2
</td>
			<td>Concentração de Fl.So.</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_4</td>
			<td>2 [mg/ml] / 4000 [g/mol]</td>
			<td>0,5 mol/m2</td>
			<td>Concentração de FD 4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_10</td>
			<td>2 [mg/ml] / 10000 [g/mol]</td>
			<td>0,2 mol/m2</td>
			<td>Concentração de FD 10.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_20</td>
			<td>2 [mg/ml] / 20000 [g/mol]</td>
			<td>0,1 mol/m2</td>
			<td>Concentração de FD 20.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_40</td>
			<td>2 [mg/ml] / 40000 [g/mol]</td>
			<td>0,05 mol/m2</td>
			<td>Concentração de FD 40.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dif_w</td>
			<td>1e-9 [m ^ 2/s]</td>
			<td>1e - 9m2/s</td>
			<td>Coeficiente de difusão da água de amassadura</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Parâmetros físicos para simulação de "Transporte de espécies químicas".
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome</td>
			<td>Expressão</td>
			<td>Descrição</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>Acceptor(c)</td>
			<td>Definição da concentração aceitador</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>D_search * 1e-10</td>
			<td>Mudança de fator para D</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3: Parâmetros para simulação de "Otimização".
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Permeiam</td>
			<td>Coeficiente de permeabilidade (m/s) x 10-8</td>
			<td>Coeficiente de difusão (m/s2) x 10-10</td>
			<td>Raio de Stokes de permeado (m) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fl.So.</td>
			<td>4,79 ± 0,20</td>
			<td>1,94 ± 0,34</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 4.000</td>
			<td>2.37 ± 0,31</td>
			<td>0,65 ± 0,12</td>
			<td>14</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD10, 000</td>
			<td>1,67 ± 0,47</td>
			<td>0,22 ± 0,02</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 20.000</td>
			<td>0,65 ± 0,30</td>
			<td>0,29 ± 0,04</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 40.000</td>
			<td>0,27 ± 0,08</td>
			<td>0,14 ± 0,02</td>
			<td>45</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 4: coeficiente de permeabilidade e a difusão de substâncias com raio de Stokes diferente através do gel de Agarose 2% + membrana em uma membrana de 96 poços inserir sistema. (sal de sódio de fluoresceína = FL. So., fitc dextrano = FD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Modelo</td>
			<td>Coeficiente de permeabilidade (m/s) x 10-8</td>
			<td>Coeficiente de difusão (m/s2) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Col.</td>
			<td>2.18 ± 0,29</td>
			<td>1.22 ± 0,06</td>
		</tr>
<tr>
<td>Col. + F.</td>
			<td>1,77 ± 0,38</td>
			<td>0,93 ± 0,12</td>
		</tr>
<tr>
<td>Col. + H.</td>
			<td>1,64 ± 0,40</td>
			<td>0,96 ± 0,05</td>
		</tr>
<tr>
<td>Col. + f + H.</td>
			<td>1,65 ± 0,18</td>
			<td>0,88 ± 0,11</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 5: coeficiente de permeabilidade e a difusão do sal de sódio de fluoresceína através de um modelo de célula de colágeno em um 12-membrana bem inserir sistema (Col. = colágeno, F. = fibroblasto, H. = HaCaT).

Um método para determinação da permeabilidade de uma membrana inserir sistema para placas multi bem e em silico otimização de parâmetro para o cálculo dos coeficientes de difusão usando simulação são apresentados.

Um método para a determinação e simulação da permeabilidade e difusão em um modelo 3D do tecido em uma membrana inserir sistema para placas multi bem

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

O objetivo geral deste protocolo é determinar a permeabilidade e os coeficientes de difusão de modelos de pele 3D em um pequeno sistema de inserção de membrana. Essas questões podem ajudar a responder a perguntas-chave sobre a engenharia de tecidos de pele 3D para aplicações farmacêuticas e cosméticas, nas quais a permeabilidade e o coeficiente de difusão são fatores de qualidade essenciais. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a medição direta desses coeficientes dentro de um pequeno inserto de vários poços.O pequeno sistema de inserção de membrana na simulação pode ser modificado para uso em órgãos nos dispositivos do navio e outras aplicações que usam sistemas de inserção de membrana. Para preparar um gel de agarose, comece aplicando 28,6 microlitros de gel de agarose líquido a 80 graus Celsius recém-preparado em cada membrana de um sistema de inserção de membrana de 96 poços. Após 10 minutos, o gel terá solidificado e poderá ser usado para um ensaio de permeabilidade.Para preparar um modelo de célula de colágeno, primeiro misture 125 microlitros de HBSS e um mililitro de solução de colágeno R em gelo, seguido de neutralização com hidróxido de sódio. Em seguida, adicione 125 microlitros de fibroblastos primários suspensos em meio completo à mistura. E adicione 28,6 microlitros da solução celular resultante a cada poço de um novo sistema de inserção de membrana de 96 poços.Após 30 minutos em uma incubadora de cultura de células, adicione 75 microlitros de meio completo à superfície do gel e 300 microlitros de meio completo ao fundo de cada poço para uma incubação noturna na incubadora de cultura de células. No dia seguinte, substitua o meio por 75 microlitros de queratinócitos humanos adultos com baixo teor de cálcio e alta temperatura para cada modelo de célula de colágeno e devolva a placa à incubadora de cultura de células por mais três dias. No quarto dia, aspirar o meio da superfície do modelo celular e retornar a placa à incubadora por mais sete dias.Para realizar um ensaio de permeabilidade, dispense 75 microlitros de substância doadora em um sistema de modelo de inserção de poço pequeno de interesse e adicione 300 microlitros de substância aceptora no fundo de cada poço. Coloque a placa em um agitador a 37 graus Celsius, 95% de umidade e aproximadamente 480 RPM por cinco horas, transferindo o sistema de inserção de membrana uma vez por hora para uma placa vazia de 96 poços e medindo a fluorescência difusa dentro dos poços inferiores da placa experimental em um leitor de placas. No final do experimento de permeabilidade, abra o software de modelagem apropriado e inicie um novo modelo.Selecione Assistente de modelo e modelo 3D. Adicione Transporte de Espécies Diluídas e clique em estudo. Em seguida, selecione Dependente do tempo e clique em concluído.Em Definições globais, clique com o botão direito do mouse para adicionar parâmetros e inserir os parâmetros geométricos e físicos na grade. Configure a geometria do sistema de inserção de membrana a partir dos experimentos e clique com o botão direito do mouse em Definições para adicionar duas sondas de domínio, selecionando uma sonda como o domínio aceitador e a outra como o domínio doador. Defina ambos os domínios como média com uma expressão C e uma unidade de mols por metro cúbico.E defina o coeficiente de difusão nas propriedades de transporte um e transporte de espécies diluídas. Clique com o botão direito do mouse em transporte de espécies diluídas para adicionar uma segunda propriedade de transporte dois e selecione a segunda barreira na seleção de domínio. No transporte de espécies diluídas, para os valores iniciais um, defina a concentração como zero.Clique com o botão direito do mouse em transporte de espécies diluídas para adicionar um segundo valor inicial dois e selecione o doador como o terceiro domínio. Defina a concentração como a concentração inicial da substância doadora fluorescente. Clique com o botão direito do mouse no transporte de espécies diluídas para adicionar simetria um e selecione todas as superfícies da seleção de limite que espelham toda a geometria.Clique com o botão direito do mouse na malha para adicionar dois tetraédricos livres e definir a segunda barreira como o domínio. Clique com o botão direito do mouse no tetraédrico livre para adicionar o tamanho da malha predefinida ao extrafino. No segundo tetraédrico livre, defina o aceitador e o doador como domínios e a malha predefinida como mais fina.Em seguida, no estudo um, clique em computar para iniciar a simulação. Para ajustar o coeficiente de difusão aos dados gerados pela simulação de difusão, abra o menu adicionar psíquico e selecione matemática. Localize a otimização e a sensibilidade.Selecione otimização e clique em adicionar ao componente. Em seguida, clique com o botão direito do mouse nas definições para adicionar variáveis e insira manualmente as variáveis da tabela três. Em seguida, no menu de acoplamento de componentes, clique com o botão direito do mouse em definições, adicione a média seguida pela adição manual do aceitador como o nome do operador e selecione o domínio um.Exporte os dados experimentais para um novo documento de texto. Use um ponto-e-vírgula para separar os dados em colunas e uma quebra de linha para separar os dados em linhas. Clique com o botão direito do mouse em otimização para adicionar o objetivo global de mínimos quadrados e anexe o documento de texto aos dados experimentais.Clique no objetivo global de mínimos quadrados para definir a primeira coluna como a coluna de tempo um e a segunda coluna como a coluna de valor um. Na coluna de expressão do valor, insira a variável C.Clique com o botão direito do mouse em otimização para adicionar uma variável de controle global. E declare D sublinhado pesquisa como uma variável com um valor inicial de um, um limite inferior de zero e um limite superior de 1.000.Clique com o botão direito do mouse no estudo um para adicionar otimização. E selecione SNOPT como um método de resolução de otimização. Defina a tolerância de otimização para um elevado a menos oito.Em seguida, defina o coeficiente de difusão na barreira para D.Defina o tempo de simulação na configuração de estudo de zero segundos a 22.000 segundos com um intervalo de 100 segundos e clique em calcular para iniciar a otimização do parâmetro. A análise histológica de um modelo de célula de colágeno revela uma leve coloração dos fibroblastos dentro da matriz central. No topo da matriz de colágeno, pode ser observada uma camada contendo muitos núcleos, provavelmente consistindo de queratinócitos humanos adultos com baixo teor de cálcio e alta temperatura.Usando sal de sódio de fluoresceína e isotiocianato de fluoresceína dextrano verificar o impacto do tamanho molecular da substância difusora revela que, para pequenos tamanhos moleculares, a simulação e os dados experimentais estão em boa concordância para ambas as moléculas. Tamanhos moleculares maiores, no entanto, geram desvios mais altos nas progressões das curvas nas simulações, demonstrando um atraso no início e um aumento mais forte no curso posterior dos gráficos. De fato, o coeficiente de permeação diminui à medida que o tamanho molecular aumenta com os coeficientes simulados se comportando de forma semelhante aos coeficientes de permeabilidade experimentais.É importante observar que a maioria dos modelos que usam queratinócitos humanos adultos com baixo teor de cálcio e alta temperatura têm coeficientes de permeação e difusão mais baixos em comparação com modelos sem queratinócitos humanos adultos com baixo teor de cálcio e alta temperatura. O modelo de sim colágeno pode ser estabelecido em 11 a 12 dias e a medição da permeação pode ser concluída em seis horas se for realizada corretamente. Ao realizar o procedimento, é importante manter constantes as condições de contorno como temperatura, volume de enchimento, concentração da substância aplicada, umidade e processo de membrana para reduzir a variação do coeficiente de permeação.Com a ajuda desta simulação de módulo, o esforço experimental pode ser reduzido e o desempenho de longo prazo pode ser previsto. Também pode ser adaptado a outros dispositivos de permeação ou sistemas de propriedade de órgãos. Esta técnica abre caminho para pesquisadores no campo de aplicações farmacêuticas e cosméticas, bem como para o desenvolvimento interativo em engenharia de tecidos, para explorar os processos de permeação por difusão em tecidos artificiais.

a-method-for-determination-simulation-permeability-diffusion-3d

Research

JoVE Journal

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Este relatório fornece protocolos para montagem, cultura de células e ensaios na plataforma μSiM para a construção de modelos de barreira hematoencefálica.

Uso da Plataforma de Tecido de Barreira MicroSiM (μSiM) para Modelagem da Barreira Hematoencefálica

Apresentamos um protocolo para produção de alto rendimento de canais vasculares com tamanhos flexíveis e padrões desejados em uma placa padrão de seis poços usando a tecnologia de bioimpressão 3D, conhecida como vasos em uma placa (VOP). Esta plataforma tem o potencial de avançar no desenvolvimento de terapêuticas para os distúrbios associados ao endotélio comprometido.

Método de bioimpressão de alto rendimento para modelagem da permeabilidade vascular em placas padrão de seis poços com flexibilidade de tamanho e padrão

Aprenda a determinar a permeabilidade e difusão em modelos 3D de pele usando um sistema de inserção de membrana em placa de 96 poços. Este método computacional permite medições diretas e simulações otimizadas para aplicações farmacêuticas e cosméticas.

Um método para a determinação e simulação da permeabilidade e difusão em um modelo 3D do tecido em uma membrana inserir sistema para placas multi bem (Vídeo) | JoVE Journal

Um método para a determinação e simulação da permeabilidade e difusão em um modelo 3D do tecido em uma membrana inserir sistema para placas multi bem

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