Um método para a determinação e simulação da permeabilidade e difusão em um modelo 3D do tecido em uma membrana inserir sistema para placas multi bem

O objetivo geral deste protocolo é determinar a permeabilidade e os coeficientes de difusão de modelos de pele 3D em um pequeno sistema de inserção de membrana. Essas questões podem ajudar a responder a perguntas-chave sobre a engenharia de tecidos de pele 3D para aplicações farmacêuticas e cosméticas, nas quais a permeabilidade e o coeficiente de difusão são fatores de qualidade essenciais. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a medição direta desses coeficientes dentro de um pequeno inserto de vários poços.

O pequeno sistema de inserção de membrana na simulação pode ser modificado para uso em órgãos nos dispositivos do navio e outras aplicações que usam sistemas de inserção de membrana. Para preparar um gel de agarose, comece aplicando 28,6 microlitros de gel de agarose líquido a 80 graus Celsius recém-preparado em cada membrana de um sistema de inserção de membrana de 96 poços. Após 10 minutos, o gel terá solidificado e poderá ser usado para um ensaio de permeabilidade.

Para preparar um modelo de célula de colágeno, primeiro misture 125 microlitros de HBSS e um mililitro de solução de colágeno R em gelo, seguido de neutralização com hidróxido de sódio. Em seguida, adicione 125 microlitros de fibroblastos primários suspensos em meio completo à mistura. E adicione 28,6 microlitros da solução celular resultante a cada poço de um novo sistema de inserção de membrana de 96 poços.

Após 30 minutos em uma incubadora de cultura de células, adicione 75 microlitros de meio completo à superfície do gel e 300 microlitros de meio completo ao fundo de cada poço para uma incubação noturna na incubadora de cultura de células. No dia seguinte, substitua o meio por 75 microlitros de queratinócitos humanos adultos com baixo teor de cálcio e alta temperatura para cada modelo de célula de colágeno e devolva a placa à incubadora de cultura de células por mais três dias. No quarto dia, aspirar o meio da superfície do modelo celular e retornar a placa à incubadora por mais sete dias.

Para realizar um ensaio de permeabilidade, dispense 75 microlitros de substância doadora em um sistema de modelo de inserção de poço pequeno de interesse e adicione 300 microlitros de substância aceptora no fundo de cada poço. Coloque a placa em um agitador a 37 graus Celsius, 95% de umidade e aproximadamente 480 RPM por cinco horas, transferindo o sistema de inserção de membrana uma vez por hora para uma placa vazia de 96 poços e medindo a fluorescência difusa dentro dos poços inferiores da placa experimental em um leitor de placas. No final do experimento de permeabilidade, abra o software de modelagem apropriado e inicie um novo modelo.

Selecione Assistente de modelo e modelo 3D. Adicione Transporte de Espécies Diluídas e clique em estudo. Em seguida, selecione Dependente do tempo e clique em concluído.

Em Definições globais, clique com o botão direito do mouse para adicionar parâmetros e inserir os parâmetros geométricos e físicos na grade. Configure a geometria do sistema de inserção de membrana a partir dos experimentos e clique com o botão direito do mouse em Definições para adicionar duas sondas de domínio, selecionando uma sonda como o domínio aceitador e a outra como o domínio doador. Defina ambos os domínios como média com uma expressão C e uma unidade de mols por metro cúbico.

E defina o coeficiente de difusão nas propriedades de transporte um e transporte de espécies diluídas. Clique com o botão direito do mouse em transporte de espécies diluídas para adicionar uma segunda propriedade de transporte dois e selecione a segunda barreira na seleção de domínio. No transporte de espécies diluídas, para os valores iniciais um, defina a concentração como zero.

Clique com o botão direito do mouse em transporte de espécies diluídas para adicionar um segundo valor inicial dois e selecione o doador como o terceiro domínio. Defina a concentração como a concentração inicial da substância doadora fluorescente. Clique com o botão direito do mouse no transporte de espécies diluídas para adicionar simetria um e selecione todas as superfícies da seleção de limite que espelham toda a geometria.

Clique com o botão direito do mouse na malha para adicionar dois tetraédricos livres e definir a segunda barreira como o domínio. Clique com o botão direito do mouse no tetraédrico livre para adicionar o tamanho da malha predefinida ao extrafino. No segundo tetraédrico livre, defina o aceitador e o doador como domínios e a malha predefinida como mais fina.

Em seguida, no estudo um, clique em computar para iniciar a simulação. Para ajustar o coeficiente de difusão aos dados gerados pela simulação de difusão, abra o menu adicionar psíquico e selecione matemática. Localize a otimização e a sensibilidade.

Selecione otimização e clique em adicionar ao componente. Em seguida, clique com o botão direito do mouse nas definições para adicionar variáveis e insira manualmente as variáveis da tabela três. Em seguida, no menu de acoplamento de componentes, clique com o botão direito do mouse em definições, adicione a média seguida pela adição manual do aceitador como o nome do operador e selecione o domínio um.

Exporte os dados experimentais para um novo documento de texto. Use um ponto-e-vírgula para separar os dados em colunas e uma quebra de linha para separar os dados em linhas. Clique com o botão direito do mouse em otimização para adicionar o objetivo global de mínimos quadrados e anexe o documento de texto aos dados experimentais.

Clique no objetivo global de mínimos quadrados para definir a primeira coluna como a coluna de tempo um e a segunda coluna como a coluna de valor um. Na coluna de expressão do valor, insira a variável C.Clique com o botão direito do mouse em otimização para adicionar uma variável de controle global. E declare D sublinhado pesquisa como uma variável com um valor inicial de um, um limite inferior de zero e um limite superior de 1.000.

Clique com o botão direito do mouse no estudo um para adicionar otimização. E selecione SNOPT como um método de resolução de otimização. Defina a tolerância de otimização para um elevado a menos oito.

Em seguida, defina o coeficiente de difusão na barreira para D.Defina o tempo de simulação na configuração de estudo de zero segundos a 22.000 segundos com um intervalo de 100 segundos e clique em calcular para iniciar a otimização do parâmetro. A análise histológica de um modelo de célula de colágeno revela uma leve coloração dos fibroblastos dentro da matriz central. No topo da matriz de colágeno, pode ser observada uma camada contendo muitos núcleos, provavelmente consistindo de queratinócitos humanos adultos com baixo teor de cálcio e alta temperatura.

Usando sal de sódio de fluoresceína e isotiocianato de fluoresceína dextrano verificar o impacto do tamanho molecular da substância difusora revela que, para pequenos tamanhos moleculares, a simulação e os dados experimentais estão em boa concordância para ambas as moléculas. Tamanhos moleculares maiores, no entanto, geram desvios mais altos nas progressões das curvas nas simulações, demonstrando um atraso no início e um aumento mais forte no curso posterior dos gráficos. De fato, o coeficiente de permeação diminui à medida que o tamanho molecular aumenta com os coeficientes simulados se comportando de forma semelhante aos coeficientes de permeabilidade experimentais.

É importante observar que a maioria dos modelos que usam queratinócitos humanos adultos com baixo teor de cálcio e alta temperatura têm coeficientes de permeação e difusão mais baixos em comparação com modelos sem queratinócitos humanos adultos com baixo teor de cálcio e alta temperatura. O modelo de sim colágeno pode ser estabelecido em 11 a 12 dias e a medição da permeação pode ser concluída em seis horas se for realizada corretamente. Ao realizar o procedimento, é importante manter constantes as condições de contorno como temperatura, volume de enchimento, concentração da substância aplicada, umidade e processo de membrana para reduzir a variação do coeficiente de permeação.

Com a ajuda desta simulação de módulo, o esforço experimental pode ser reduzido e o desempenho de longo prazo pode ser previsto. Também pode ser adaptado a outros dispositivos de permeação ou sistemas de propriedade de órgãos. Esta técnica abre caminho para pesquisadores no campo de aplicações farmacêuticas e cosméticas, bem como para o desenvolvimento interativo em engenharia de tecidos, para explorar os processos de permeação por difusão em tecidos artificiais.