Detecção de formas modificadas da citosina Utilizando imunohistoquímica Sensível

O objetivo geral deste protocolo imunoquímico é avaliar a distribuição espacial de formas modificadas de citosina em vários contextos teciduais e celulares com base no uso de anticorpos secundários conjugados com peroxidase e amplificação do sinal de tiramida. Este método supera a limitação de outras técnicas que não fornecem informações espaciais necessárias para a compreensão da função biológica das formas modificadas de citosina. Além disso, este método permite a co-detecção de formas modificadas de citosina com marcadores de linhagem de proteínas e pode ser empregado para estudar sua localização nuclear.

Para iniciar este procedimento, fixe seções de tecido reidratado de embriões de camundongos CD1 do tipo selvagem e tecidos cerebrais adultos, colocando-os em 4% de PFA ou 4% de FA gelados por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, remova o excesso de fixador lavando as seções em PBS por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, permeabilize as seções de tecido colocando-as em um frasco de Coplin cheio de PBX por 30 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, remova o excesso de PBX lavando as seções brevemente em PBT. Agora, coloque as seções permeabilizadas em HCl 2 N por 60 minutos em temperatura ambiente para depurinação do DNA. Em seguida, transfira as seções para Tris-Hcl 10 milimolares por 30 minutos em temperatura ambiente para neutralizar o HCl.

Como alternativa, lave as seções três vezes por cinco minutos cada em PBS. Incube as seções em PBT por cinco minutos em temperatura ambiente. Depois disso, remova cuidadosamente o líquido da área ao redor das seções de tecido.

Enquanto isso, mantenha as seções de tecido úmidas. Use uma caneta de barreira hidrofóbica para circundar as seções sem tocá-las. Em seguida, incube as seções em 100 microlitros de solução de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente em uma câmara úmida.

Em seguida, incubar as seções de tecido em 100 microlitros de uma diluição de 1:5000 de um anticorpo primário monoclonal anti-5hmC de camundongo e diluição de 1:1000 de um anticorpo primário policlonal anti-5caC de coelho em solução de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente. Como alternativa, realize a incubação durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, remova o excesso de anticorpos lavando as seções em um frasco Coplin cheio de PBT três vezes por cinco minutos cada em temperatura ambiente.

Em seguida, remova o excesso de PBT e, se necessário, circunde as seções novamente com uma caneta de barreira hidrofóbica, pois o PBT contém detergente que pode enfraquecer a barreira hidrofóbica. Em seguida, faça uma diluição de 1:400 de anticorpo conjugado com HRP de cabra anti-coelho e uma diluição de 1:400 de anticorpo conjugado com 555 de burro em solução de bloqueio. Em seguida, incubar as seções de tecido em 100 microlitros da mistura de anticorpos secundários por uma hora em temperatura ambiente em uma câmara úmida.

Depois, lave as seções de tecido em um frasco de Coplin cheio de PBT três vezes por cinco minutos cada em temperatura ambiente. Em seguida, transfira as seções de tecido para 100 microlitros de tiramida em uma diluição de 1:200 no tampão de amplificação de sinal de tiramida por dois minutos em temperatura ambiente. O tempo de incubação foi a solução de tiramida deve ser otimizada experimentalmente para cada lote individual de kit de amplificação de sinal de tiramida, onde é observada uma relação linear entre a intensidade do sinal e a duração da amplificação de sinal baseada em tiramida.

Imediatamente após, remova o excesso de solução de tiramida lavando as lâminas três vezes por cinco minutos cada em PBT. Remova cuidadosamente o excesso de PBT e cubra imediatamente as seções com uma gota de meio de montagem. Coloque delicadamente uma lamínula nas seções de tecido e sele a lamínula com esmalte.

Em seguida, mantenha as seções de tecido a quatro graus Celsius por várias horas antes do exame microscópico. Para determinar a distribuição de 5hmC em seções de tecido cerebral, a co-detecção dessa modificação epigenética foi realizada com um marcador para neurônios pós-mitóticos, NeuN. A análise imuno-histoquímica revelou que, enquanto a coloração proeminente de 5hmC colocalizada com células NeuN-positivas, as células gliais NeuN-negativas possuíam níveis mais baixos de 5hmC genômico.

Para determinar a distribuição de 5caC na diferenciação de células-tronco neurais, a coloração desse marcador foi realizada com um marcador glial, GFAP, nas culturas fixas de células-tronco neurais três dias após a indução da diferenciação glial. Ao contrário das células-tronco neurais ou astrócitos maduros, foi observado um forte sinal de 5caC em uma grande proporção de células que expressam GFAP. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de oito horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ter todos os reagentes e materiais junto com suas amostras prontas. Após este procedimento, a imagem confocal pode ser realizada para responder a perguntas adicionais sobre a distribuição nuclear de formas modificadas de citosina. Isso pode contribuir para decifrar sua potencial função biológica.

Não se esqueça de que trabalhar com 2 N Hcl pode ser extremamente perigoso e precauções como cabine de segurança e roupas de proteção devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.