Detecção de formas modificadas da citosina Utilizando imunohistoquímica Sensível

O objetivo geral deste protocolo imunoquímico é avaliar a distribuição espacial de formas modificadas de citosina em diversos contextos teciduais e celulares, com base no uso de anticorpos secundários conjugados à peroxidase e na amplificação do sinal por tiramida. Este método supera a limitação de outras técnicas que não fornecem as informações espaciais necessárias para compreender a função biológica das formas modificadas de citosina. Além disso, este método permite a detecção simultânea de formas modificadas de citosina com marcadores de linhagem proteica e pode ser empregado para estudar sua localização nuclear.

Para iniciar este procedimento, fixe cortes de tecido reidratados de embriões de camundongos CD1 selvagem e tecidos cerebrais adultos colocando-os em PFA a 4% ou FA a 4%, gelados, por 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, remova o fixador em excesso lavando os cortes em PBS por cinco minutos à temperatura ambiente. A seguir, permeabilize os cortes de tecido colocando-os em um frasco de Coplin contendo PBX por 30 minutos à temperatura ambiente.

Posteriormente, remova o PBX em excesso lavando brevemente as seções em PBT. Agora, coloque as seções permeabilizadas em HCl 2 N durante 60 minutos à temperatura ambiente para despurinação do DNA. Em seguida, transfira as seções para Tris-HCl 10 milimolar durante 30 minutos à temperatura ambiente para neutralizar o HCl.

Alternativamente, lave as seções três vezes por cinco minutos cada em PBS. Incube as seções em PBT por cinco minutos à temperatura ambiente. Após isso, remova cuidadosamente o líquido da área ao redor das seções de tecido.

Enquanto isso, mantenha as seções de tecido úmidas. Use uma caneta de barreira hidrofóbica para cercar as seções sem tocá-las. Em seguida, incube as seções em 100 microlitros de solução bloqueadora por uma hora à temperatura ambiente em uma câmara úmida.

Em seguida, incubar os cortes de tecido em 100 microlitros de uma diluição 1:5000 de um anticorpo primário monoclonal de camundongo anti-5hmC e uma diluição 1:1000 de um anticorpo primário policlonal de coelho anti-5caC em solução bloqueadora por uma hora à temperatura ambiente. Alternativamente, realizar a incubação durante a noite a quatro graus Celsius. A seguir, remover o excesso de anticorpos lavando os cortes em um frasco de Coplin contendo PBT, três vezes por cinco minutos cada, à temperatura ambiente.

Em seguida, remova o PBT em excesso e, se necessário, circule novamente as seções com uma caneta de barreira hidrofóbica, pois o PBT contém detergente que pode enfraquecer a barreira hidrofóbica. A seguir, prepare uma diluição 1:400 de anticorpo secundário conjugado à HRP de cabra anti-coelho e uma diluição 1:400 de anticorpo secundário conjugado ao 555 de burro anti-murino na solução bloqueadora. Incube então as seções de tecido em 100 microlitros da mistura de anticorpos secundários por uma hora à temperatura ambiente em uma câmara úmida.

Em seguida, lave os cortes de tecido em um frasco de Coplin contendo PBT por três vezes, cinco minutos cada, à temperatura ambiente. Em seguida, transfira os cortes de tecido para 100 microlitros de tiramida em uma diluição de 1:200 no tampão de amplificação de sinal por tiramida durante dois minutos à temperatura ambiente. O tempo de incubação na solução de tiramida deve ser otimizado experimentalmente para cada lote individual do kit de amplificação de sinal por tiramida, em que se observa uma relação linear entre a intensidade do sinal e a duração da amplificação de sinal baseada em tiramida.

Imediatamente após, remova o excesso de solução de tiramida lavando as lâminas três vezes, por cinco minutos cada, em PBT. Remova cuidadosamente o excesso de PBT e cubra imediatamente as seções com uma gota de meio de montagem. Coloque suavemente uma lamínula sobre as seções teciduais e fixe a lamínula com esmalte de unha.

Em seguida, mantenha as seções de tecido a quatro graus Celsius por várias horas antes da análise microscópica. Para determinar a distribuição de 5hmC em seções de tecido cerebral, realizou-se a co-detecção dessa modificação epigenética com um marcador para neurônios pós-mitóticos, NeuN. A análise imunohistoquímica revelou que, embora a marcação acentuada de 5hmC colocalizasse com células positivas para NeuN, as células gliais negativas para NeuN possuíam níveis mais baixos de 5hmC genômico.

Para determinar a distribuição de 5caC em células-tronco neurais em diferenciação, foi realizada a coloração simultânea desse marcador com um marcador astrocitário, GFAP, em culturas fixadas de células-tronco neurais três dias após a indução da diferenciação glial. Diferentemente do observado em células-tronco neurais ou em astrócitos maduros, um forte sinal de 5caC foi observado em uma grande proporção de células que expressavam GFAP. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente oito horas, se realizada corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ter todos os reagentes e materiais prontos junto com suas amostras. Após este procedimento, pode-se realizar a imagem confocal para responder perguntas adicionais sobre a distribuição nuclear de formas modificadas da citosina. Isso pode contribuir para decifrar sua possível função biológica.

Não se esqueça de que trabalhar com HCl 2 N pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de cabine de segurança e equipamentos de proteção devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.