Name: Detecção de formas modificadas da citosina Utilizando imunohistoquímica Sensível (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprenda a mapear derivados oxidados de 5mC em tecidos cerebrais de camundongos usando imunohistoquímica sensível com amplificação de sinal por tiramida. Este método permite co-detecção com marcadores de linhagem celular.

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Agradecemos à Unidade de Microscopia Avançada (Escola de Ciências da Vida, Universidade de Nottingham) e à equipe de Histologia da Unidade de Ciências Reprodutivas Humanas do MRC (Edimburgo), ao Instituto de Neurociência da ULB e ao FNRS pela ajuda e apoio. Este trabalho foi apoiado pelo MRC (MR / L001047 / 1 a ADJ).

Todos os procedimentos envolvidos em animais foram realizados de acordo com o comitê de ética da Universidade de Nottingham de. 1. Seleção de preparação do tecido apropriado para imunocoloração <ol><li> Gerar secção embebidos em parafina de embriões de tipo selvagem de ratinho CD1 e tecidos do cérebro adulto, conforme descrito anteriormente 25. Usar secções de tecido do cérebro fixadas com formaldeído a 4%, quer (FA) ou paraformaldeído a 4% (PFA) para o método de imunocoloração 25. NOTA: O uso de cortes de tecido embebidos em parafina requer de-depilação antes da marcação de anticorpos. Uma vez que o tratamento com 2-4 M de ácido clorídrico (HCl) empregada no protocolo para a desnaturação do DNA não é compatível com a maioria das estratégias de recuperação antigênica, recomendamos o uso de qualquer seções cryo- ou micrótomo para co-detecção de derivados de oxidação 5mC com proteína marcadores. </li></ol> 2. Desparafinação parafina tecido embebido secções &lt;<html> / P&gt; <ol><li> Em uma cabine de segurança classe running II, lavar a parafina secções de tecido embebidas numa jarra de Coplin cheio com xileno, 2 vezes para 10 minutos cada em temperatura ambiente. NOTA: É importante a utilização de xileno fresco como parafina remoção incompleta pode conduzir a padrões de coloração inconsistentes. </li><li> Depois da-cera, re-hidratar rapidamente as secções de tecido por lavagem consecutivamente em 95, 75, e 50% de etanol durante 10 minutos cada à temperatura ambiente. </li></ol> 3. Fixação e permeabilização de Cryo- e secções do micrótomo <ol><li> Fixar as secções de tecido re-hidratadas, colocando-os em qualquer gelo frio PFA a 4% ou 4% de FA durante 15 min à TA. </li><li> Remover o excesso de fixador por lavagem das secções em PBS (salina tamponada com fosfato) durante 5 min à TA. </li><li> Permeabilizar as secções de tecido, colocando num frasco Coplin preenchido com o PBX (0,5% de Triton X-100 em PBS) durante 30 min à TA. Retire o excesso de PBX por lavagem das secções em breve em PBT (0,01% de Tween 20 em PBS). </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. imunocoloração para oxi-5mC Derivativos <ol><li> Coloque as secções permeabilizadas em HCl 2 N durante 60 min à TA durante despurinação do DNA. Nota: Embora as concentrações mais elevadas de HCl (por exemplo, 4 N) conduz a uma desnaturação do DNA mais eficiente, que não são compatíveis para co-detecção de oxi-MCS com DAPI. </li><li> Coloque as secções em Tris-HCl a 10 (pH 8,5) durante 30 min à temperatura ambiente para neutralizar o HCl. Em alternativa, as secções lavar três vezes durante 5 minutos cada em PBS. Incubam-se as secções em PBT durante 5 min à TA. </li><li> Remova cuidadosamente o líquido da área circundante a secção de tecido, sem deixar que a secção de tecido secar completamente em qualquer etapa agitando suavemente o slide. Use uma caneta barreira hidrofóbica para cercar a seção sem tocar na seção. NOTA: A caneta barreira hidrofóbica reduz o volume de anticorpo necessário para manchar o tecido e pode permitir várias seções de ser marcadas com differenanticorpos t no mesmo slide. </li><li> Incubar secções em 100 ul de solução de bloqueio (albumina de soro bovino a 10% em PBS) durante 1 h à temperatura ambiente numa câmara húmida. NOTA: Ignorar este passo não afetaria a eficiência da coloração das bases de citosina modificadas. </li><li> Incubam-se as secções de tecido em 100 ul de uma diluição 1: 5000 de anticorpo monoclonal anti-5hmC e uma diluição 1: 1000 de anticorpos primários policlonais de coelho anti-5caC na solução durante 1 h à TA, o bloqueio numa câmara húmida. Alternativamente, realizar a incubação durante a noite a 4 ° C, se necessário. NOTA: Secções processados ​​sem anticorpos primários podem servir como controlos negativos adequados para o processo de coloração. As secções de 12,5 dias pós-embrionárias de murídeo enriquecidas em coitum cerebrais 5caC, 5FC e 5hmC 20 pode ser usado como controlo positivo. </li><li> Remover o excesso de anticorpos por lavagem das secções em um frasco Coplin preenchido com PBT três vezes durante 5 min cada em uma bobinajar lin à temperatura ambiente. NOTA: O aumento do volume de soluções de lavagem pode reduzir a coloração de fundo. </li><li> Remover o excesso de PBT e, se necessário, rodear as secções mais uma vez com a caneta barreira hidrofóbica como PBT conter detergente que pode enfraquecer a barreira hidrofóbica. </li><li> Fazer uma diluição 1: 400 de anticorpo conjugado com HRP de cabra anti-coelho e uma diluição 1: 400 de anticorpo-555 conjugado de burro anti-rato em solução de bloqueio. </li><li> Incubam-se as secções de tecido em 100 ul de mistura de anticorpo secundário a partir do passo 4.9 durante 1 hora à temperatura ambiente numa câmara húmida. </li><li> Lavam-se as secções de tecido em um frasco Coplin preenchido com PBT três vezes durante 5 minutos cada à temperatura ambiente. </li><li> Coloque as secções de tecido em 100 ul de uma diluição 1: 200 de tiramida no tampão de amplificação de sinal de tiramida durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Imediatamente, remover a solução de tiramida excesso por lavagem das lâminas três vezes durante 5 min cada em PBT. </li><li> carefully remover o excesso de PBT e cobrir imediatamente as seções com uma gota de um meio de montagem (veja Lista de Materiais). </li><li> Delicadamente, coloque uma lamela sobre os cortes de tecido e selar imediatamente a lamela com unha polonês. </li><li> Armazenar as secções de tecidos a 4 ° C durante várias horas antes do exame microscópico. Examinar sob um microscópio de fluorescência a 405, 488 e / ou 555 nm (10 - ampliação de 40X). </li></ol>

<ol><li>Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+patterns+and+epigenetic+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">DNA methylation patterns and epigenetic memory.</a> Genes Dev. 16, 6-21 (2002).</li>
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<li>Almeida, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-quantitative+immunohistochemical+detection+of+5-hydroxymethyl-cytosine+reveals+conservation+of+its+tissue+distribution+between+amphibians+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Semi-quantitative immunohistochemical detection of 5-hydroxymethyl-cytosine reveals conservation of its tissue distribution between amphibians and mammals.</a> Epigenetics. 7, 137-140 (2012).</li>
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</ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Embora a baixa abundância relatado de derivados de oxidação 5mC, 5FC e 5caC em alguns tecidos iria apresentar limitações significativas para um protocolo imunoquímica standard, a incorporação de anticorpos secundários conjugados com peroxidase permitiu a detecção dessas modificações citosina em tecidos e células fixas (Figura 2) . No entanto, o tempo de incubação óptimo com a solução tiramida devem ser optimizadas experimentalmente para cada lote individual de tiramida kit de amplificação de sinal em que uma relação linear entre a intensidade do sinal e a duração de amplificação de sinal com base tiramida é observada, para indicações referem-se Almeida et ai 2012 26. . Além disso, a relação sinal / fundo pode ser significativamente aumentada através da realização das lavagens em um frasco Coplin para permitir a remoção eficiente do excesso de anticorpos. Após a incubação com uma solução de tiramida, é importante para parar imediatamente a reacção por lavagem em solução de d PBTfundo ecrease coloração. É crítico para não permitir que as secções para secar a qualquer momento durante o procedimento. A eficiência de despurinação de ADN pode ser melhorada por se realizar a reacção a depurinação a 37 ° C. Enquanto utilizando HCl 4 N em vez de 2 N melhora a coloração das formas modificadas de 5mC utilizando HCl 4 N para a despurinação do DNA não iria permitir a co-coloração com DAPI, à medida que interage exclusivamente com o ADN de cadeia dupla. Embora esta técnica pode fornecer uma avaliação semi-quantitativa robusta das formas modificadas de bases de citosina onde detectável, ele não pode ser usado para avaliar os níveis absolutos de seus derivados de oxidação ou 5mC. Portanto, recomendamos a utilização de outros complementares, mas quantitativa aproxima 16, 19 -24. Desde a descoberta de derivados de oxidação 5mC em genomas de mamíferos, várias abordagens têm sido desenvolvidas para estudar os seus papéis biológicos 16, 19-24. Embora estes approaches pode ser valiosa na determinação dos níveis absolutos de derivados de oxidação 5mC, eles não fornecem informações relativas à sua distribuição espacial 20, 26. Temos utilizado com sucesso o método descrito aqui para mapear a distribuição espacial e localização de derivados de oxidação 5mC em diferentes tipos de células do desenvolvimento e cérebro adulto 20 Ao revelar sua distribuição espacial 20, esta técnica pode ser crucial para compreender as implicações biológicas e o destino de derivados oxidados de 5mC em vários contextos biológicos onde estes derivados modificados de 5mC podem ser detectados incluindo diferenciação celular, desenvolvimento e doença. Além disso, o método aqui descrito pode dar avaliação semi-quantitativa dos derivados oxidados de 5mC em diferentes tecidos, avaliando a cinética de reacção de peroxidase (que é proporcional à intensidade de coloração) em diferentes tempos de incubação com tyramide 26.

Metilação de bases de citosina no DNA (5mC) representa uma importante marca epigenética encontrado em vertebrados genomas associadas a transcrição silenciamento 1. 5mC está a ser introduzido e mantido pela ADN metiltransferases 2-5, e tem sido demonstrado que desempenham papéis importantes numa série de processos biológicos incluindo imprinting genômico, inactivação do cromossoma X, a diferenciação celular, e desenvolvimento de 3, 6. Em consequência, a interrupção de padrões de 5mC genómicas está associada com um número de doenças 7, 8-11. Apesar dos progressos na compreensão papel 5mC no desenvolvimento e na doença, ainda é permanecem largamente desconhecidos como esta marca está sendo removido no desenvolvimento e tecidos adultos. Vários mecanismos potenciais de desmetilação de ADN foram recentemente propostas incluindo mecanismos ativos e passivos desmetilação 12, 13, 14, 15. Descoberta dos produtos de 5mC oxidação sequencial mediadas por 1011 translocação enzymES (tet1 / 2/3), tais como 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC), e 5-carboxylcytosine (5caC) em eucariótica de ADN 16, 17, 18, ​​19 solicitado especulações se eles podem servir como intermediários de processos desmetilação de ADN ou marcas epigenéticas agir como estáveis ​​em seu próprio direito 13. Enquanto a demonstração de que o componente de base de reparo de excisão, glicosilase-DNA timina (TDG) pode ligar e remover tanto 5FC e 5caC de DNA 19, 20 sugere um papel para os derivados 5mC modificados numa desmetilação DNA ativo. Evidências recentes mostram que 5FC / 5caC pode modular a taxa de pontos de processabilidade RNA II para o potencial envolvimento destas marcas na regulação da transcrição 29. Devido a este potencial importância biológica das formas oxidadas de 5mC, uma variedade de técnicas bioquímicas e de anticorpos com base têm sido utilizados para estudar a sua distribuição genómico e conteúdo global 16, 19-24. Dado que a maioria de Tele vertebrado órgãos consistem em diferentes tipos de células e que a distribuição das bases de citosina modificadas é o tecido e tipo celular específico 16-18, 20, 23, 25-27, determinar a distribuição espacial dos derivados oxidados 5mC em diferentes tecidos torna-se um importante experimental tarefa necessária para revelar as suas funções biológicas. A maioria das abordagens bioquímicas e de anticorpos com base não fornecem qualquer informação espacial em relação à distribuição das formas modificadas de 5mC no tecido diferente e tipos de células. Em contraste, técnicas de imunoquímica base pode proporcionar uma ferramenta para a avaliação rápida da distribuição espacial e localização nuclear de 5mC 28 e os seus derivados oxidados 20. O que é dito, o relatado muito baixa abundância de 5FC (20 em cada 10 6 citosina) e 5caC (3 em cada 10 6 citosina) no genoma do rato 18 representa um desafio significativo para imunoquímica padrão. Aqui,descrevemos um método imunoquímico altamente sensível que proporciona robusta e uma rápida detecção da forma oxidada de citosina no tecido cerebral de mamífero. Com a incorporação de anticorpos secundários conjugados com peroxidase acoplada com um passo de amplificação de sinal, este método evita os desafios de detectar a quantidades muito baixas de 5FC e 5caC. Além disso, esta técnica pode ser utilizada para co-detectar as formas modificadas de citosina com marcadores específicos de linhagem, que complementa eficazmente outras abordagens em elucidar as funções biológicas destas marcas epigenética.

<table><tbody><tr><td>Frasco Coplin</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-48585-30</td><td>Feito de vidro</td></tr><tr><td>Xileno</td><td></td><td></td><td>Use apenas em cabine de segurança Classe II</td></tr><tr><td>Tampão fosfato salino (PBS)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>12821680</td><td>pH 7.5, filtrado antes</td></tr><tr><td>do uso 4% de paraformaldeído (PFA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Uma vez feito pode ser armazenado a -20 &deg; C em aliquotes por vários meses 4</td></tr><tr><td>% formaldeído&nbsp; (FA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td>Uma vez feito pode ser armazenado a -20 &deg; C em aliquotes por vários meses</td></tr><tr><td>Etanol, anidro desnaturado, grau histológico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64-17-5</td><td>95, 75, 50% em PBS</td></tr><tr><td>0,01% Tween 20 em PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>PBT</td></tr><tr><td>0,5% Triton X-100 em PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>PBX</td></tr><tr><td>2 N HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71826</td><td>cuidado extremamente tóxico</td></tr><tr><td>100 mM Tris-HCl&nbsp;</td><td>Promega</td><td>H5121</td><td>pH ajustado a 8,5</td></tr><tr><td>caneta de barreira hidrofóbica</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td>para imuno-histoquímica</td></tr><tr><td>Câmara de umidade deslizante</td><td>Laboratório de dispositivos científicos</td><td>197-BL</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo de camundongo anti-5mC</td><td>Diagenode</td><td>C15200081</td><td>anticorpo primário monoclonal</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-5hmC</td><td>Motivo ativo</td><td>39791</td><td>coelho policlonal anticorpo primário</td></tr><tr><td>Anti-5caC Anticorpo</td><td>ativo Motivo ativo</td><td>61225</td><td>anticorpo primário policlonal de coelho</td></tr><tr><td>Anti-coelho conjugado com peroxidase Anticorpo secundário</td><td>Dako</td><td>K1497</td><td></td></tr><tr><td>555-congjuado anticorpo anti-camundongo de cabra</td><td>Sondas moleculares</td><td>A-11005</td><td>&nbsp; anticorpo secundário</td></tr><tr><td>10% BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>Solução de bloqueio</td></tr><tr><td>22 x 32 mm Lamínulas de cobertura de vidro</td><td>BDH</td><td>406/0188/24</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de amplificação de sinal de tiramida</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL741001KT</td><td>Outros anticorpos secundários conjugados com fluorochome podem ser usados para co-detecção de oxi-5mC&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; Meio de montagem com DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte</td><td></td><td></td><td></td>incolor</tr><tr><td>frango policlonal anti-GFAP anticorpo policlonal</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA5-18598</td> 1<td>:400 diluição</td></tr><tr><td>anti-NeuN anticorpo monoclonal de camundongo</td><td>Merck milipore</td><td>MAB377B</td><td>diluição 1:400</td></tr></tbody></table>

detecção de formas modificadas da citosina utilizando imunohistoquímica sensível

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

A metilação de bases de citosina (5-metilcitosina, 5mC) que ocorre em genomas de vertebrados é geralmente associada ao silenciamento transcricional. 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formilcitosina (5fC) e 5-carboxilcitosina (5caC) são as bases de citosina modificadas recentemente descobertas produzidas pela oxidação enzimática de 5mC, cujas funções biológicas permanecem relativamente obscuras. Várias abordagens, desde técnicas bioquímicas até técnicas baseadas em anticorpos, foram empregadas para estudar a distribuição genômica e o conteúdo global dessas modificações em vários sistemas biológicos. Embora algumas dessas abordagens possam ser úteis para a avaliação quantitativa dessas formas modificadas de 5mC, a maioria desses métodos não fornece nenhuma informação espacial sobre a distribuição dessas modificações de DNA em diferentes tipos de células, necessárias para a correta compreensão de seus papéis funcionais. Aqui apresentamos um método altamente sensível para detecção imunoquímica das formas modificadas de citosina. Este método permite a co-detecção dessas marcas epigenéticas com marcadores de linhagem de proteínas e pode ser empregado para estudar sua localização nuclear, contribuindo assim para decifrar seus potenciais papéis biológicos em diferentes contextos experimentais.

Para determinar a distribuição de 5hmC em secções de tecido cerebral, foi realizado co-detecção desta modificação epigenética com um marcador para neurónios pós-mitóticos, NeuN, empregando anticorpo-5hmC anti comercial que interage especificamente com esta marca, mas não com outras formas de modificação citosina 20, 25. a análise imuno-histoquímica de distribuições 5hmC e 5caC no cérebro adulto revelou que, enquanto a coloração proeminente 5hmC co-localiza com as células positivas NeuN, células gliais NeuN-negativas possuem níveis mais baixos de 5hmC genómico (Figura 1) 20. Recentemente, mostrou que a oxidação 5mC Tet-dependente é operatório durante a especificação das linhagens de células-tronco neurais (NCCC) 20. Apesar de ser imunoquimicamente indetectável no NSC, 5FC e 5caC exibem imuno proeminente nas primeiras fases de diferenciação NSC no sentido neuronal uma<html> nd linhagens gliais. Ambas as marcas transitoriamente acumular concorrentemente com a aparência de marcadores de diferenciação neuronal e glial precoce 20. Para determinar a distribuição de 5caC na diferenciação NSC nós realizadas co-coloração deste traço com um marcador glial GFAP sobre as culturas fixadas de NSC aos 3 dias de indução da diferenciação glial. Ao contrário de NSC ou astrócitos maduros (dados não apresentados), observou-se sinal forte em 5caC relativamente grande proporção das células que expressam GFAP nestas culturas (Figura 2) 20. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54416/54416fig1.jpg" /> Figura 1. Co-imunocoramento 5hmC (verde) com NeuN (vermelho) no tecido adulto Cérebro contrastadas com DAPI (azul). Os canais individuais ea exibição mesclada são mostrados. As barras de escala são de 25 uM.blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54416/54416fig2.jpg" /> Figura 2. Co-imunocoramento 5caC com GFAP na cultura do NSC no dia 3 de glial diferenciação. Os canais individuais ea exibição mesclada são mostrados. Barras de escala são 20 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54416/54416fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui descrevemos um método imunoquímico sensível para mapear a distribuição espacial de derivados de oxidação de 5mC com base no uso de anticorpos secundários conjugados com peroxidase e amplificação de sinal de tiramida.

Detecção de formas modificadas da citosina Utilizando imunohistoquímica Sensível

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

O objetivo geral deste protocolo imunoquímico é avaliar a distribuição espacial de formas modificadas de citosina em diversos contextos teciduais e celulares, com base no uso de anticorpos secundários conjugados à peroxidase e na amplificação do sinal por tiramida. Este método supera a limitação de outras técnicas que não fornecem as informações espaciais necessárias para compreender a função biológica das formas modificadas de citosina. Além disso, este método permite a detecção simultânea de formas modificadas de citosina com marcadores de linhagem proteica e pode ser empregado para estudar sua localização nuclear.Para iniciar este procedimento, fixe cortes de tecido reidratados de embriões de camundongos CD1 selvagem e tecidos cerebrais adultos colocando-os em PFA a 4% ou FA a 4%, gelados, por 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, remova o fixador em excesso lavando os cortes em PBS por cinco minutos à temperatura ambiente. A seguir, permeabilize os cortes de tecido colocando-os em um frasco de Coplin contendo PBX por 30 minutos à temperatura ambiente.Posteriormente, remova o PBX em excesso lavando brevemente as seções em PBT. Agora, coloque as seções permeabilizadas em HCl 2 N durante 60 minutos à temperatura ambiente para despurinação do DNA. Em seguida, transfira as seções para Tris-HCl 10 milimolar durante 30 minutos à temperatura ambiente para neutralizar o HCl.Alternativamente, lave as seções três vezes por cinco minutos cada em PBS. Incube as seções em PBT por cinco minutos à temperatura ambiente. Após isso, remova cuidadosamente o líquido da área ao redor das seções de tecido.Enquanto isso, mantenha as seções de tecido úmidas. Use uma caneta de barreira hidrofóbica para cercar as seções sem tocá-las. Em seguida, incube as seções em 100 microlitros de solução bloqueadora por uma hora à temperatura ambiente em uma câmara úmida.Em seguida, incubar os cortes de tecido em 100 microlitros de uma diluição 1:5000 de um anticorpo primário monoclonal de camundongo anti-5hmC e uma diluição 1:1000 de um anticorpo primário policlonal de coelho anti-5caC em solução bloqueadora por uma hora à temperatura ambiente. Alternativamente, realizar a incubação durante a noite a quatro graus Celsius. A seguir, remover o excesso de anticorpos lavando os cortes em um frasco de Coplin contendo PBT, três vezes por cinco minutos cada, à temperatura ambiente.Em seguida, remova o PBT em excesso e, se necessário, circule novamente as seções com uma caneta de barreira hidrofóbica, pois o PBT contém detergente que pode enfraquecer a barreira hidrofóbica. A seguir, prepare uma diluição 1:400 de anticorpo secundário conjugado à HRP de cabra anti-coelho e uma diluição 1:400 de anticorpo secundário conjugado ao 555 de burro anti-murino na solução bloqueadora. Incube então as seções de tecido em 100 microlitros da mistura de anticorpos secundários por uma hora à temperatura ambiente em uma câmara úmida.Em seguida, lave os cortes de tecido em um frasco de Coplin contendo PBT por três vezes, cinco minutos cada, à temperatura ambiente. Em seguida, transfira os cortes de tecido para 100 microlitros de tiramida em uma diluição de 1:200 no tampão de amplificação de sinal por tiramida durante dois minutos à temperatura ambiente. O tempo de incubação na solução de tiramida deve ser otimizado experimentalmente para cada lote individual do kit de amplificação de sinal por tiramida, em que se observa uma relação linear entre a intensidade do sinal e a duração da amplificação de sinal baseada em tiramida.Imediatamente após, remova o excesso de solução de tiramida lavando as lâminas três vezes, por cinco minutos cada, em PBT. Remova cuidadosamente o excesso de PBT e cubra imediatamente as seções com uma gota de meio de montagem. Coloque suavemente uma lamínula sobre as seções teciduais e fixe a lamínula com esmalte de unha.Em seguida, mantenha as seções de tecido a quatro graus Celsius por várias horas antes da análise microscópica. Para determinar a distribuição de 5hmC em seções de tecido cerebral, realizou-se a co-detecção dessa modificação epigenética com um marcador para neurônios pós-mitóticos, NeuN. A análise imunohistoquímica revelou que, embora a marcação acentuada de 5hmC colocalizasse com células positivas para NeuN, as células gliais negativas para NeuN possuíam níveis mais baixos de 5hmC genômico.Para determinar a distribuição de 5caC em células-tronco neurais em diferenciação, foi realizada a coloração simultânea desse marcador com um marcador astrocitário, GFAP, em culturas fixadas de células-tronco neurais três dias após a indução da diferenciação glial. Diferentemente do observado em células-tronco neurais ou em astrócitos maduros, um forte sinal de 5caC foi observado em uma grande proporção de células que expressavam GFAP. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente oito horas, se realizada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ter todos os reagentes e materiais prontos junto com suas amostras. Após este procedimento, pode-se realizar a imagem confocal para responder perguntas adicionais sobre a distribuição nuclear de formas modificadas da citosina. Isso pode contribuir para decifrar sua possível função biológica.Não se esqueça de que trabalhar com HCl 2 N pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de cabine de segurança e equipamentos de proteção devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

detection-modified-forms-cytosine-using-sensitive

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O EpiMark 5-HMC e 5-mC Kit de análise podem ser usados ​​para analisar e quantificar 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine dentro de um locus spe específicos. O kit distingue 5 de 5 mC-HMC pela adição de glicose para o grupo hidroxila de 5-HMC através de uma reação enzimática utilizando β-glicosiltransferase (T4-BGT). Quando 5-HMC ocorre no contexto de CCGG, esta modificação converte um site MspI clivável para um site não-clivável.

Alta Sensibilidade de Detecção de 5 hydroxymethylcytosine-in Balb / C Tecido Cerebral

Descrita é um processo de rotulagem em duas etapas usando β-glicosiltransferase (β-GT) para transferir uma azida de glucose para 5 HMC, seguido por química do clique para transferir de um ligante de biotina para o enriquecimento fácil e densidade independente. Este método de marcação eficiente e específico permite o enriquecimento de 5 HMC com fundo extremamente baixo e de alto rendimento de mapeamento epigenômico via sequenciamento de última geração.

Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico

Este vídeo apresenta o protocolo para detecção de sinal durante a hibridização in situ cromogênica de RNA. Essa técnica pode ser usada para diagnosticar visualmente uma infecção oncogênica ativa em uma amostra de tecido intacto.

Detecção de sinal de RNA CISH: uma técnica para detectar sinais cromogênicos durante a hibridização in situ de RNA em amostras de tecido intacto

Este vídeo descreve a técnica de dot-blot para determinar o nível de metilação do DNA em condrócitos humanos in vitro por meio do blotting de amostras de DNA em uma membrana de náilon e a visualização subsequente usando anticorpos monoclonais. Isso ajuda a determinar o fenótipo dos condrócitos em vários estágios da cultura.

Dot Blot de 5-metilcitosina para determinar a extensão da metilação do DNA

Este protocolo descreve a detecção de qPCR de citomegalovírus em tecido de biópsia fixado em formalina e embebido em parafina, que é rápido, sensível, específico e útil para interpretar padrões de coloração ambíguos de hematoxilina e eosina ou imuno-histoquímica.

qPCR é um método sensível e rápido para detecção de DNA por citomegalovírus em formalina-fixo, tecido da biópsia de parafina-embedded

Aqui, apresentamos um protocolo baseado na detecção imunohistológica da proteína c-FOS, uma técnica clássica usada para a identificação de populações neuronais envolvidas em respostas fisiológicas específicas in vivo e ex vivo.

A proteína c-Fos Detecção imuno: Uma ferramenta útil como um marcador de vias centrais envolvidos em respostas fisiológicas específicas<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; Ex Vivo</em

Recém descoberto formas oxidadas de 5-metilcitosina (oxi-mCs), 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5-fC) e 5-carboxylcytosine (5caC) pode representar modificações de DNA distintas com funções únicas funcionais. Aqui, um fluxo de trabalho semi-quantitativa para visualização da distribuição espacial de oxi-mCs, perfis de intensidade de sinal e colocalization é descrito.

Immunostaining para modificações do DNA: análise computacional de imagens Confocal

O objetivo deste relato é descrever o protocolo para a deteção de imuno-histoquímica robusto de marcadores epigenéticas, 5-metilcitosina (5mC) e 5-Hidroximetilcitosina (5hmC) no desenvolvimento e postmitotic mouse retina.

Deteção de immunohistochemical da 5-metilcitosina e 5-Hidroximetilcitosina no desenvolvimento e Mouse Postmitotic Retina

Aqui, nós apresentamos um protocolo para detectar 5 hydroxymethylcytosine nas pilhas e nos tecidos do cérebro, utilizando a mancha da imunofluorescência e os métodos do dot-borrão do ADN.

A detecção de 5-Hidroximetilcitosina em células-tronco neurais e cérebros de camundongos

O presente protocolo destaca um método modificado para detectar e quantificar ligações cruzadas DNA-proteína (DPCs) e suas modificações pós-traducionais (MPTs), incluindo ubiquitilação, SUMOilação e ADP-ribosilação induzida por inibidores de topoisomerase e por formaldeído, permitindo assim o estudo da formação e reparo de DPCs e suas MPTs.

Detecção quantitativa de ligações cruzadas DNA-proteína e suas modificações pós-traducionais

O protocolo descreve um ensaio de hibridização de imunofluorescência em tandem com tecido embebido em parafina fixado em formalina para detectar e quantificar microRNA e proteínas multiplexadas simultaneamente.

Amplificação e reconhecimento de microRNA por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado como um novo método de detecção e quantificação

Aprenda a mapear derivados oxidados de 5mC em tecidos cerebrais de camundongos usando imunohistoquímica sensível com amplificação de sinal por tiramida. Este método permite co-detecção com marcadores de linhagem celular.

Detecção de formas modificadas da citosina Utilizando imunohistoquímica Sensível

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