Visualização e quantificação da Camada de livre-Cell nas arteríolas do músculo Rat Cremaster

O objetivo geral deste procedimento é quantificar as variações espaço-temporais na largura da camada livre de células in vivo. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área da micro-hemodinâmica, contribuindo para uma melhor compreensão do papel da afinidade celular na microcirculação. A principal vantagem deste método é que a largura da afinidade celular in vivo pode ser quantificada de forma mais consistente e conveniente do que as técnicas manuais anteriores de medição, que eram muito demoradas.

Antes de iniciar a medição da largura da camada livre de células, execute o arquivo de script pré-MatLab para camada livre de células. Em seguida, clique em abrir arquivo para selecionar o arquivo de vídeo para análise e ajuste o controle deslizante de rotação para alinhar verticalmente as paredes do vaso único, usando o controle deslizante de zoom para ajustar o nível de zoom conforme necessário. Quando o vaso estiver na posição apropriada, clique em confirmar edição e, em seguida, clique em definir ROI para recortar e definir a região de interesse.

A imagem alinhada será exibida em uma janela pop-up. Ajuste o retângulo objetivo na imagem conforme necessário e clique duas vezes no objetivo para confirmar a região de interesse. Em seguida, clique em Extrair Imagens para extrair todos os quadros de vídeo editados em imagens bitmap consecutivas, que serão encontradas na pasta com o mesmo nome do arquivo de vídeo selecionado.

Para medir a largura da camada livre de células, clique em Selecionar Pasta e clique na pasta de imagens. O primeiro quadro da imagem aparecerá no painel de imagem em escala de cinza, juntamente com o histograma de intensidade cinza correspondente no painel de histograma da imagem. Selecione o quadro de imagem desejado na caixa de listagem para realizar a análise e clique em Encontrar Paredes do Vaso para identificar a parede interna do vaso na imagem, determinada como o local onde o pico do perfil de intensidade luminosa transita de escuro para claro ao longo de dois pixels.

Marque o filtro mediano para aplicar um filtro mediano à imagem, reduzindo o ruído do tipo sal e pimenta. Marque o contraste automático para ajuste digital das intensidades da imagem, melhorando o contraste. Em seguida, selecione um algoritmo de limiarização na caixa de listagem para determinar automaticamente o valor de limiarização que divide os níveis de cinza em duas classes: pixels brancos com níveis de cinza acima do valor de limiarização e pixels pretos com níveis de cinza abaixo desse valor.

Para medir a variação espacial das larguras da camada livre de células, insira a resolução do pixel na caixa de resolução do pixel. Em seguida, clique em Calcular para obter a variação espacial das larguras da camada livre de células e clique em Exportar .csv para exportar os dados de largura da camada livre de células em formato tabulado.

Para medir a variação temporal das larguras da camada livre de células em uma linha específica de análise ao longo do vaso, clique em Variação Temporal e insira as informações da taxa de quadros. Insira os quadros inicial e final das imagens para a análise nas caixas quadro inicial e quadro final, respectivamente. Ajuste a barra deslizante da linha de análise para selecionar a posição da linha de análise ao longo do vaso e confirme a posição da linha de análise conforme ilustrado nas imagens em escala de cinza e nas imagens binárias.

Em seguida, clique em Calcular para obter a variação temporal das larguras da camada livre de células e clique em Exportar .csv para exportar os dados da largura da camada livre de células em formato tabulado. Aqui, é mostrado um fluxo típico de hemácias através de uma artéria não ramificada no músculo cremaster de rato, onde a camada livre de células pode ser observada entre o núcleo de hemácias e a parede interna do vaso.

Um bom contraste entre esses componentes é essencial para garantir a precisão das medições da largura da camada livre de células. A fase inicial da análise de imagem envolveu a detecção da parede interna do vaso. Ao adquirir o perfil de intensidade de luz ao longo da linha de análise perpendicular ao vaso, a localização é aproximada no pico que transita de escuro para claro ao longo de dois pixels.

Posteriormente, os limites do núcleo dos eritrócitos são detectados utilizando o algoritmo de limiarização de imagem e as larguras da camada livre de células podem então ser calculadas. Como os eritrócitos na camada livre de células possuem diferentes transmitâncias de luz, a diferença nos níveis de cinza pode ser subdividida em duas classes. No entanto, a identificação de um valor de limiar preciso entre os dois picos do histograma da imagem pode ser limitada pela baixa qualidade da imagem e contraste.

Para melhorar o contraste entre os glóbulos vermelhos e a camada livre de células, pode-se usar um filtro azul. Isso é ainda mais evidente nestas imagens, nas quais os limites dos núcleos dos glóbulos vermelhos foram identificados com maior precisão utilizando um filtro azul. O algoritmo de limiarização também pode influenciar a medição da largura da camada livre de células, como é aparente nestas imagens, nas quais diferentes algoritmos de limiarização resultaram na identificação de limites distintos dos núcleos dos glóbulos vermelhos e, consequentemente, em diferentes larguras da camada livre de células.

A medição da largura da camada livre de células in vivo é muito sensível à qualidade das imagens. Portanto, é essencial realizar a cirurgia com cuidado e utilizar um assistente óptico apropriado para obter imagens de boa qualidade. Além disso, é fundamental selecionar o algoritmo apropriado de limiarização de imagem para garantir uma medição precisa e consistente da largura da camada livre de células.