Name: Visualização e quantificação da Camada de livre-Cell nas arteríolas do músculo Rat Cremaster (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Aprenda a quantificar a camada livre de células in vivo em arteríolas do músculo cremaster de ratos. Este método oferece medições mais consistentes e convenientes do que técnicas manuais para estudos de microhemodinâmica.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Medical Research Council (NMRC)/Cooperative Basic Research Grant (CBRG)/0078/2014.

Este estudo está de acordo com a Universidade Nacional de Singapura Institutional Animal Care e Use Committee (protocolo aprovado no. R15-0225). 1. Preparação cirúrgica do Modelo Animal <ol><li> canulações navio <ol><li> Anestesiar a ratazanas macho Sprague-Dawley (6 - 7 semanas de idade) de pesagem (203 ± 20) g com cetamina (37,5 mg / ml) e xilazina (5 mg / ml) cocktail através de injecção intraperitoneal (ip) de injecção (2 ml / kg) . Não recapitular a agulha ou removê-lo a partir da seringa, após a injecção. </li><li> Uma vez que o animal foi anestesiado (confirmado por dedo do pé que comprime a), colocá-la sobre uma almofada de aquecimento para manter a sua temperatura do corpo a 37 ° C. Delicadamente raspar o cabelo na escápula, colo do útero anterior, abdômen, perna medial e saco escrotal. Gentilmente conter as pernas usando fitas de papel adesivas. </li><li> Executar todos os procedimentos cirúrgicos com uma tesoura de microdissecção e pinças angulares durante a visualização atravésum estereomicroscópio. Coloque todos os instrumentos cirúrgicos afiados em uma bandeja resistente a perfurações para evitar lesões durante a cirurgia. </li><li> Esfregue todos os locais cirúrgicos 3 vezes com alternância de iodo e álcool 70% antes de realizar a incisão. Lave todos os cateteres com 30 solução de heparina salina UI / ml. </li><li> Faça de 1 - 1,5 centímetros incisão na pele na linha média sobre as escápulas usando um par de tesouras cirúrgicas sobre a veia jugular direita. Separa-se a fáscia por dissecção cega para expor a veia jugular e canular-lo com um tubo de polietileno (PE-50) cheio com heparina-solução salina utilizando 5-0 suturas de seda. Infundir anestesia suplementar quando necessário (1/3 a 1/2 da dose inicial, por via intravenosa (iv)) ao longo do curso da experiência e cirurgia. </li><li> Realização da traqueostomia para manter a desobstrução das vias aéreas. Adicione de 1 - 1,5 centímetros incisão na área cervical anterior. Canular a traqueia usando um tubo de polietileno (PE-205) com fio de seda 2-0 para fixar o cateter no local. </li><li> Monitor de pressão arterialatravés de punção na artéria femoral. Faça de 1 - 1,5 centímetros incisão na face medial esquerdo da perna traseira. Separar a artéria femoral por dissecção romba. Canular a artéria femoral, com um tubo de polietileno (PE-10) cheio com heparina-solução salina utilizando 5-0 suturas de seda. </li></ol></li><li> Cremaster Muscle Preparação and Flow Visualization <ol><li> Insira uma sutura 5-0 seda através do ápice do saco escrotal para estendê-lo. Realizar uma incisão ao longo da superfície ventral do saco escrotal. Regularmente aplicar a solução isotónica quente (37 ° C; pH 7,4) para o músculo exposta. </li><li> Remover circundante tecidos conjuntivos com cuidado e profundidade usando um aplicador com ponta de algodão. </li><li> Insira uma sutura 5-0 seda através do ápice do músculo cremaster. Corte a sutura em duas partes de igual comprimento e faça um nó em cada lado. Corte o músculo entre os dois nós e esticá-la em uma plataforma transparente de acrílico personalizado puxando suavemente a sutura. Consertara extremidade do fio de sutura para a plataforma com a aderência azul. NOTA: a remoção completa de cercar tecidos conjuntivos é crucial na obtenção de contraste de imagem ideal. </li><li> 1.2.3 Repita o passo até 5 a 6 fixações são feitas. Remova cuidadosamente o músculo cremaster do epidídimo usando alta cautério temperatura. Superfuse solução isotónica quente para o músculo exposta para evitar a desidratação do tecido. <ol><li> Cerque o músculo cremaster com peças dobradas de gaze. Cobrir o músculo exposta com uma película de polivinil. Os pedaços de gaze com o filme formar uma bacia rasa para segurar solução isotônica quente para o objetivo de imersão em água microscópio (Figura 1A). </li></ol></li><li> Transferir o animal para a fase de animais de um microscópio intravital (Figura 1C). Ligue a punção arterial a um sistema de aquisição de dados fisiológica para monitorização da pressão contínua (Figura 1E). </li><li> Manter a temperat muscularure a 35 ° C com um elemento de aquecimento ligado por baixo da plataforma do animal (Figura 1B). Coloque um sensor de temperatura junto ao músculo para fornecer feedback negativo para o controlador de energia do elemento de aquecimento (Figura 1D). </li><li> Deixar o animal no estágio durante 15 minutos para equilibrar com o ambiente. </li><li> Visualizar o fluxo sanguíneo ao microscópio intravital com um objetivo de imersão em água 40X e um condensador de funcionamento longa. </li><li> Escolha uma arteríola não ramificado (&lt;60 um), com base em um foco de imagem clara e contraste entre o núcleo de RBC, CFL e dos vasos paredes, a fim de focar o microscópio sobre o plano diametral do vaso sanguíneo. Rodar a câmara montada no microscópio para alinhar verticalmente a parede do vaso. </li><li> Grave o fluxo de sangue usando uma câmera de vídeo de alta velocidade com uma taxa de quadros de 3.000 / seg por 1 segundo. Salvar o vídeo gravado em formato AVI em tons de cinza não-comprimido de 8 bits para preservar a qualidade da imagem. NOTA:<html> Recomenda-se uma velocidade mínima do quadro de gravação de 3.000 quadros / seg para assegurar que a medição de CFL pode ser realizada pelo menos uma vez por RBC sob condições de fluxo fisiológicas arteriolar. </li><li> Usar um filtro azul com pico de transmissão em comprimento de onda de 394 nm, e passa-banda espectral de 310 - 510 nm, para aumentar o contraste entre as hemácias e plasma. NOTA: Certifique-se de que o espectro de luz que passa através do filtro azul da fonte de luz microscópica (lâmpada de halogéneo de 100 W) é de baixa intensidade de luz para evitar qualquer dano tecidual potencial. </li><li> No final da experiência, os animais a eutanásia com uma sobredose de pentobarbital de sódio. </li></ol></li></ol> Análise 2. Imagem <ol><li> Pré-processamento para a medição da largura do CFL <ol><li> Abra MATLAB e execute o arquivo &#39;CFL_pre.m&#39;. (Este e outros arquivos MATLAB pode ser encontrado noip &quot;&gt; Suplementar MATLAB Arquivo.) </li><li> Clique em &quot;Abrir arquivo&quot; para selecionar o arquivo de vídeo para analisar. </li><li> Ajuste o controle deslizante de &quot;rotação&quot; para alinhar as paredes dos vasos verticalmente. NOTA: Os usuários podem exibir as linhas de grade de apoio para o alinhamento navio, selecionando o botão de opção &#39;Grid On&#39; e ajuste o nível de zoom da imagem deslizando o controle deslizante &#39;Zoom&#39;. </li><li> Clique no botão &#39;Confirmar Editar&#39; para confirmar o alinhamento navio. </li><li> Clique no botão &#39;Definir ROI para a cultura&#39; para definir a região de interesse (ROI). A imagem alinhada será exibido em uma janela pop-up. Ajustar o objetivo rectangular na imagem e clique duas vezes para confirmar a ROI. Pule esta etapa se o corte de imagem não é necessária. NOTA: Apenas incluem um único recipiente na ROI para analisar a largura do recipiente de CFL. Clique no botão &quot;Reiniciar Imagem &#39;para restaurar a imagem à sua forma original, se necessário. </li><li> Clique no9; Extrato &#39;botão para extrair todos os quadros de vídeo editados em imagens de mapas de bits consecutivos (8-bit em tons de cinza &quot;Imagens BMP&#39;). As imagens extraídas podem ser encontrados na pasta com o mesmo nome do arquivo de vídeo selecionado. </li></ol></li><li> Medição da largura CFL <ol><li> Abra MATLAB e execute o arquivo &#39;CFL_measure.m&#39;. </li><li> Clique em &quot;Selecionar Pasta&quot; para selecionar a pasta que contém as imagens extraídas. </li><li> Clique na pasta que contém as imagens e clique em &quot;Selecionar Pasta&quot;. O primeiro quadro de imagem na pasta será carregado e mostrado no painel &#39;Tons de cinza imagem&#39;, juntamente com o seu cinza histograma de intensidade no painel &#39;Imagem Histograma&#39;. </li><li> Selecione o quadro de imagem desejada na caixa de lista para realizar a análise, caso contrário, o primeiro quadro de imagem será selecionado. </li><li> Clique &quot;Encontrar navio Paredes &#39;para identificar o interior da parede do vaso na imagem, que é determinada no local onde oluz perfil de intensidade de pico trânsitos de escuro para claro ao longo de dois pixels. </li><li> Verificar &#39;filtro mediano&#39; para aplicar um filtro de média para a imagem para reduzir o ruído de &quot;sal e pimenta&quot;. </li><li> Check &#39;Auto Contraste&#39; para ajustar as intensidades de imagem digital para aumentar o contraste da imagem. </li><li> Selecione um algoritmo de limiarização na caixa de listagem que determina automaticamente um valor limiar (τ) que divide os níveis de cinza em duas classes - pixels brancos com níveis de cinza acima τ (CFL), e pixels pretos com níveis de cinza abaixo τ (RBC core). NOTA: Como um método alternativo, use limiar manual se nenhum dos algoritmo de limiarização automatizado proporciona um limiar de imagem apropriado. Clique no botão de opção &#39;Manual&#39; e ajuste o controle deslizante para definir o valor de limiar manual. </li><li> Para medir a variação espacial das larguras CFL, digite a resolução de pixels na caixa de &#39;pixels de resolução&#39; (a resoluçãoCom esta configuração experimental foi de 0,42 mm / pixel). </li><li> Clique no botão &quot;Calcular&quot; para obter a variação espacial das larguras CFL. Clique em &#39;.csv Exportar&#39; para exportar os dados de largura CFL em um formato de tabela. </li><li> Para medir a variação temporal das larguras CFL em uma linha de análise específica ao longo do vaso, clique no botão de opção &#39;Temporal Variação &quot;e insira as informações taxa de quadros (a taxa de quadros usada nesta configuração experimental foi 3.000 frames / seg). </li><li> Digite o primeiro quadro e último quadro das imagens para a análise nas caixas &#39;Iniciar Frame&#39; e &#39;Última frame&#39;, respectivamente. </li><li> Seleccione a posição da linha de análise ao longo do vaso deslizando barra deslizante da &quot;Linha Análise &#39;. Confirmar a posição da linha de análise, o qual é ilustrado em ambos os &#39;imagem em escala de cinza &quot;e&quot; imagem binária&#39;. </li><li> Clique em &quot;Calcular&quot; para obter a variação temporal das larguras CFL. click &#39;Export .csv&#39; para exportar os dados de largura CFL em um formato de tabela. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

A medição da largura CFL é essencial para uma melhor compreensão da hemodinâmica na microcirculação. Em particular, a medição de larguras CFL tem sido realizada em mesentérica 6, espinhotrapézio 24 e cerebrais 25 microcirculations. Medição convencional de in vivo larguras CFL foi restrita a estimativas por inspeção manual dos quadros de vídeo gravadas. As medições manuais necessários a média de vários quadros de vídeo sucessivas antes de identificar visualmente os limites das ce...

Estudos em animais in vivo são fundamentais para a ciência básica para a compreensão da fisiologia e patologia humanas. Em particular, estudos micro-hemodinâmicos in vivo podem elucidar o potencial comprometimento das funções microcirculatórias alteradas por condições reológicas anormais do sangue. Vários estudos micro-hemodinâmicos anteriores1 usaram o modelo do músculo cremaster de rato para visualizar o fluxo sanguíneo microvascular. O músculo cremaster é uma fina camada de músculo estriado ao redor dos testículos. Assim, o fluxo sanguíneo no músculo pode ser visualizado com um microscópio de transiluminação por meio de exposição cirúrgica. Isso nos permite adquirir as imagens do fluxo sanguíneo in vivo sem o uso de qualquer fluorescência ou agentes de contraste. Além disso, toda a perfusão sanguínea da rede muscular pode ser controlada pela redução do fluxo sanguíneo a montante com a oclusão da aortaabdominal2. Devido a essas vantagens, o modelo do músculo cremaster tem sido amplamente utilizado para investigar a formação de camada livre de células (CFL) em microvasos1,3. 
A largura da CFL é um parâmetro hemodinâmico proeminente na microcirculação, que tem sido de grande interesse por seus importantes papéis na regulação das funções microcirculatórias. O LFC é formado pela migração transversal para dentro de glóbulos vermelhos (RBCs) induzida por cisalhamento em direção ao centro de fluxo4. Consequentemente, essa migração leva à depleção de hemácias próximas às paredes dos vasos, resultando em uma camada de plasma livre de células. Consequentemente, o CFL parietal torna-se naturalmente uma barreira de difusão para a entrega de oxigênio (O2) do núcleo das hemácias para os tecidos e para a eliminação de óxido nítrico (NO) pelas hemácias5,6. Além disso, a produção de NO também pode ser modulada pelas variações dinâmicas da largura da CFL7,8. Portanto, os papéis do CFL no transporte de gás e na regulação da homeostase na microcirculação precisam ser totalmente determinados para entender melhor o fluxo sanguíneo na microcirculação. Estudos recentes têm se concentrado em unir as funções hemodinâmicas e de transporte de gás do CFL na microcirculação9-12. Além disso, um conjunto separado de estudos também investigou como a elevação patológica na agregação de hemácias modula a formação de CFL e seu efeito na biodisponibilidade de O2 e NO nos tecidos13,14. 
Os papéis da CFL tornam-se mais significativos na microcirculação, onde o tamanho relativo da largura da CFL ao diâmetro do vaso é proeminente. Isso requer uma abordagem eficaz de quantificar o CFL no fluxo sanguíneo in vivo. Particularmente, a aquisição e a análise de imagens são os dois principais componentes que determinam a precisão da medição da largura da CFL. A visualização bem-sucedida do fluxo sanguíneo tecidual deve ser precedida por uma preparação cirúrgica apropriada do modelo animal. Além disso, uma técnica adequada de análise de imagem é necessária para superar as limitações das medições manuais convencionais que são induzidas principalmente por erros humanos15,16. Com os avanços na instrumentação óptica e no poder de computação para processamento de imagem digital, agora é possível obter uma medição mais precisa e consistente da largura da CFL17-19. No entanto, a precisão dessas medições, sendo baseadas em imagens, ainda depende, em última análise, da qualidade das imagens.
Portanto, este estudo explora os fatores que influenciam a medição da largura da CFL in vivo. Nós nos concentramos particularmente em demonstrar a preparação cirúrgica e a análise de imagem digital para medidas da largura da CFL em arteríolas do músculo cremaster de ratos.

<table><tbody><tr><td>Microscópio intravital</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Câmera de alta velocidade</td><td>Photron</td><td>1024PCI</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Filtro azul</td><td>HOYA</td><td>B390</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento Sensor de pressão e sistema biopac</td><td>Sistema Biopac</td><td>TSD104A, MP100</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento Controlador de temperatura</td><td>Shimaden</td><td>SR 1</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Plasma Lyte A</td><td>Baxter</td><td>NDC:0338-0221</td><td>Quente em 37 &deg; C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>Solução salina 0,9%</td> <td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparina (5.000 UI/ml)</td><td>Tubo</td> de polietileno LEO <td></td><td></td></tr><tr><td>PE-10</td><td>Becton Dickinson</td><td>427400.024</td><td>" OD x .011" ID&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno PE-50</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>427411.038" OD x .023" ID</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno PE-205</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>427446.082" OD x .062" ID</td></tr><tr><td>2-0 sutura de seda não absorvível</td><td>Deknatel</td><td>113-S</td><td></td></tr><tr><td>5-0 sutura de seda não absorvível</td><td>Deknatel</td><td>106-S</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento de circulação de água</td><td>Gaymar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banho de água</td><td>Fisher Scientific</td><td>Isotemp 205</td><td>Equipamento</td></tr> Gaze <tr><td>de Algodão Estéril&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-468</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores com ponta de algodão</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Dumont</td> Kent <td>Scientific</td><td>INS14188</td><td>Instrumento cirúrgico</td></tr><tr><td>Pinça de microdissecação</td><td>Kent Scientific</td><td>INS15915</td><td>Instrumento cirúrgico</td></tr><tr><td>Pinça de íris 1 x 2 dentes</td><td>Kent Scientific</td><td>INS15917</td><td>Surgical instrumento</td></tr><tr><td>Pinça de canulação de vasos</td><td>Kent Scientific</td><td>INS500377</td><td>Instrumento cirúrgico</td></tr><tr><td>Micro tesoura</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14177</td><td>Instrumento cirúrgico</td></tr><tr><td>Tesoura de íris</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14225</td><td>Instrumento cirúrgico</td></tr><tr><td>Clipe de vaso</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14120</td><td>Instrumento cirúrgico</td></tr><tr><td>Sistema de cautério Gemini</td><td>Braintree Scientific</td><td>GEM 5917</td><td>Instrumento cirúrgico</td></tr></tbody></table>

visualização e quantificação da camada de livre-cell nas arteríolas do músculo rat cremaster

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

A camada livre de células é definida como a camada de plasma parietal no fluxo de microvasos, que é desprovida de glóbulos vermelhos. A medição da largura da camada livre de células in vivo e suas variações espaço-temporais podem fornecer uma compreensão abrangente da hemodinâmica na microcirculação. Neste estudo, usamos um sistema microscópico intravital acoplado a uma câmera de vídeo de alta velocidade para quantificar as larguras das camadas livres de células nas arteríolas in vivo. O músculo cremaster de ratos Sprague-Dawley foi exteriorizado cirurgicamente para visualizar o fluxo sanguíneo. Um script de imagem personalizado também foi desenvolvido para automatizar o processamento de imagens e a análise da largura da camada livre de células. Essa abordagem permite a quantificação das variações espaço-temporais de forma mais consistente do que as medições manuais anteriores. A precisão da medição, no entanto, depende em parte do uso de um filtro azul e da seleção de um algoritmo de limiar apropriado. Especificamente, avaliamos o contraste e a qualidade das imagens adquiridas com e sem o uso de filtro azul. Além disso, comparamos cinco diferentes algoritmos de limiar baseados em histograma de imagem (Otsu, mínimo, intermodo, seleção iterativa e limiar entrópico difuso) e ilustramos as diferenças em sua determinação da largura da camada livre de células.

A visualização da CFL in vivo é largamente dependente das preparações cirúrgicos do animal. perda excessiva de sangue ou duração da cirurgia estendida pode sujeitar o animal ao choque e aberrações do fluxo sanguíneo. Manutenção da temperatura do tecido usando uma almofada de aquecimento, bem como uma plataforma de personalização durante a cirurgia e experiência também é crucial para manter as condições fisiológicas do rato. Por utilização de uma lâmpada de halogéneo de 100 W no sistema de microscópio, sem danos...

Este estudo demonstra a preparação cirúrgica do músculo cremaster de rato para a visualização da camada livre de células in vivo. Fatores consideráveis que afetam a precisão da medição da largura da camada livre de células são discutidos neste estudo.

Visualização e quantificação da Camada de livre-Cell nas arteríolas do músculo Rat Cremaster

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar as variações espaço-temporais na largura da camada livre de células in vivo. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área da micro-hemodinâmica, contribuindo para uma melhor compreensão do papel da afinidade celular na microcirculação. A principal vantagem deste método é que a largura da afinidade celular in vivo pode ser quantificada de forma mais consistente e conveniente do que as técnicas manuais anteriores de medição, que eram muito demoradas.Antes de iniciar a medição da largura da camada livre de células, execute o arquivo de script pré-MatLab para camada livre de células. Em seguida, clique em abrir arquivo para selecionar o arquivo de vídeo para análise e ajuste o controle deslizante de rotação para alinhar verticalmente as paredes do vaso único, usando o controle deslizante de zoom para ajustar o nível de zoom conforme necessário. Quando o vaso estiver na posição apropriada, clique em confirmar edição e, em seguida, clique em definir ROI para recortar e definir a região de interesse.A imagem alinhada será exibida em uma janela pop-up. Ajuste o retângulo objetivo na imagem conforme necessário e clique duas vezes no objetivo para confirmar a região de interesse. Em seguida, clique em Extrair Imagens para extrair todos os quadros de vídeo editados em imagens bitmap consecutivas, que serão encontradas na pasta com o mesmo nome do arquivo de vídeo selecionado.Para medir a largura da camada livre de células, clique em Selecionar Pasta e clique na pasta de imagens. O primeiro quadro da imagem aparecerá no painel de imagem em escala de cinza, juntamente com o histograma de intensidade cinza correspondente no painel de histograma da imagem. Selecione o quadro de imagem desejado na caixa de listagem para realizar a análise e clique em Encontrar Paredes do Vaso para identificar a parede interna do vaso na imagem, determinada como o local onde o pico do perfil de intensidade luminosa transita de escuro para claro ao longo de dois pixels.Marque o filtro mediano para aplicar um filtro mediano à imagem, reduzindo o ruído do tipo sal e pimenta. Marque o contraste automático para ajuste digital das intensidades da imagem, melhorando o contraste. Em seguida, selecione um algoritmo de limiarização na caixa de listagem para determinar automaticamente o valor de limiarização que divide os níveis de cinza em duas classes: pixels brancos com níveis de cinza acima do valor de limiarização e pixels pretos com níveis de cinza abaixo desse valor.Para medir a variação espacial das larguras da camada livre de células, insira a resolução do pixel na caixa de resolução do pixel. Em seguida, clique em Calcular para obter a variação espacial das larguras da camada livre de células e clique em Exportar .csv para exportar os dados de largura da camada livre de células em formato tabulado.Para medir a variação temporal das larguras da camada livre de células em uma linha específica de análise ao longo do vaso, clique em Variação Temporal e insira as informações da taxa de quadros. Insira os quadros inicial e final das imagens para a análise nas caixas quadro inicial e quadro final, respectivamente. Ajuste a barra deslizante da linha de análise para selecionar a posição da linha de análise ao longo do vaso e confirme a posição da linha de análise conforme ilustrado nas imagens em escala de cinza e nas imagens binárias.Em seguida, clique em Calcular para obter a variação temporal das larguras da camada livre de células e clique em Exportar .csv para exportar os dados da largura da camada livre de células em formato tabulado. Aqui, é mostrado um fluxo típico de hemácias através de uma artéria não ramificada no músculo cremaster de rato, onde a camada livre de células pode ser observada entre o núcleo de hemácias e a parede interna do vaso.Um bom contraste entre esses componentes é essencial para garantir a precisão das medições da largura da camada livre de células. A fase inicial da análise de imagem envolveu a detecção da parede interna do vaso. Ao adquirir o perfil de intensidade de luz ao longo da linha de análise perpendicular ao vaso, a localização é aproximada no pico que transita de escuro para claro ao longo de dois pixels.Posteriormente, os limites do núcleo dos eritrócitos são detectados utilizando o algoritmo de limiarização de imagem e as larguras da camada livre de células podem então ser calculadas. Como os eritrócitos na camada livre de células possuem diferentes transmitâncias de luz, a diferença nos níveis de cinza pode ser subdividida em duas classes. No entanto, a identificação de um valor de limiar preciso entre os dois picos do histograma da imagem pode ser limitada pela baixa qualidade da imagem e contraste.Para melhorar o contraste entre os glóbulos vermelhos e a camada livre de células, pode-se usar um filtro azul. Isso é ainda mais evidente nestas imagens, nas quais os limites dos núcleos dos glóbulos vermelhos foram identificados com maior precisão utilizando um filtro azul. O algoritmo de limiarização também pode influenciar a medição da largura da camada livre de células, como é aparente nestas imagens, nas quais diferentes algoritmos de limiarização resultaram na identificação de limites distintos dos núcleos dos glóbulos vermelhos e, consequentemente, em diferentes larguras da camada livre de células.A medição da largura da camada livre de células in vivo é muito sensível à qualidade das imagens. Portanto, é essencial realizar a cirurgia com cuidado e utilizar um assistente óptico apropriado para obter imagens de boa qualidade. Além disso, é fundamental selecionar o algoritmo apropriado de limiarização de imagem para garantir uma medição precisa e consistente da largura da camada livre de células.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A preparação do tecido é descrito para visualização e manipulação experimental da microcirculação vida. Anestesiados em camundongos machos, o fino, altamente vascularizado do músculo cremaster está preparado para microscopia intravital para estudar redes microvasculares incluindo arteríolas, vênulas e capilares. Esta preparação é facilmente adaptada para ratos e hamsters.

O Mouse Preparação Muscle Cremaster for Imaging intravital da Microcirculação

O objetivo deste artigo é demonstrar um método para otimizar a detecção de imunofluorescência de receptor de estrogênio α (ERα) em ratos pial fatias arterial utilizando um microscópio digital de imunofluorescência.

Imagem de receptor de estrogênio α-in Rat Arteríolas Pial usando um Microscópio Digital imunofluorescência

Microscopia de epifluorescência intravital Digital de vênulas na microcirculação cremastérico é um método conveniente para obter insights sobre leucócito-endotelial...

Real-time Digital Imaging de leucócito-endotélio Interação em isquemia-reperfusão (IRI) do músculo cremaster de rato

Nós demonstramos um modelo de ligadura arterial novel no músculo spinotrapezius murino, incluindo um procedimento passo-a-passo e uma descrição da instrumentação necessária. Descrevemos a cirurgia e avaliação dos resultados relevantes referentes à remodelação da rede vascular e vasodilatação funcional usando microscopia intravital e confocal.

Modelo Spinotrapezius murino para avaliar o impacto da ligadura arteriolar em função microvascular e Remodelação

Aqui descrevemos uma técnica experimental de microscopia de fluorescência intravital para visualizar heterotípicos plaquetas neutrófilos interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos. Esta tecnologia microscópico será valiosa para estudar o mecanismo molecular da doença vascular e para testar agentes farmacológicos, em condições fisiopatológicas.

Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos

Microscopia intravital do cremaster microcirculação rato M. oferece um único e bem padronizados modelo in vivo para a análise de medula óssea a migração de células estaminais periféricas.

Microscopia intravital da Microcirculação no músculo Rato Cremaster de Análise de Migração Stem Peripheral celular

Este manuscrito descreve em vitro protocolos de vídeo microscopia para avaliar a função vascular nas artérias de resistência cerebral de rato. O manuscrito também descreve técnicas para avaliar a densidade de microvessel com perfusão de lectina e tecido fluorescente etiquetada usando Laser Doppler Flowmetry.

Avaliação dos mecanismos de controlo Vascular utilizando a microscopia das artérias de resistência isolada de ratos

Este manuscrito descreve um protocolo simples para o isolamento de arteríolas da retina rato que podem ser usados em, cálcio imaging e pressão miografia Estudos eletrofisiológicos.

Isolamento de arteríolas retina para estudos de fisiologia celular Ex Vivo

Aqui, mostramos como realizar microscopia intravital em venulos pós-capilar esfarelados do músculo cremaster do rato. Comumente aplicada a diferentes modelos de inflamação e sepse, particularmente aqueles induzidos por quimiocinas e citocinas, destacamos sua relevância no estudo de muscolopatias envolvendo infiltração exagerada de leucócitos musculares.

Infiltração de leucócitos do Músculo Cremaster em Camundongos Avaliados por Microscopia Intravital

Apresentado aqui é um protocolo para estudar a microcirculação coronária no tecido cardíaco murino vivo por ex vivo monitoramento da pressão e fluxo de perfusão arterial que mantém a pressão, bem como componentes de árvores vasculares, incluindo os leitos capilares e pericitos, já que a artéria septal é canulada e pressurizada.

Medição dinâmica e imagem de capilares, arterioles e pericias em coração de rato

A preparação intensiva de "tubos" endoteliais cerebrais intactos de arteriolas parenchímicas cerebrais é ilustrada para o estudo da regulação do fluxo sanguíneo cerebral. Além disso, demonstramos os pontos fortes experimentais deste modelo de estudo endotelial para a medição de imagens de fluorescência e eletrofisiologia das principais vias de sinalização celular, incluindo alterações no potencial intracelular [Ca2+] e membrana.

Isolamento e Análise Funcional do Endotélio Arteriolar do Cérebro do Rato Parenchyma

Aprenda a quantificar a camada livre de células in vivo em arteríolas do músculo cremaster de ratos. Este método oferece medições mais consistentes e convenientes do que técnicas manuais para estudos de microhemodinâmica.

Visualização e quantificação da Camada de livre-Cell nas arteríolas do músculo Rat Cremaster

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