Visualizando Frequency Stromule com microscopia de fluorescência

O objetivo geral deste procedimento é visualizar e determinar a frequência de estromulos utilizando microscopia de fluorescência confocal em células vivas dentro de folhas, e para visualizar estromulos in vitro utilizando cloroplastos extraídos de folhas. Esses métodos experimentais podem ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia celular vegetal e na pesquisa de cloroplastos, ao descobrir como os estromulos funcionam. A principal vantagem dessas técnicas é que elas geram dados reprodutíveis e robustos, mesmo para essas estruturas de cloroplastos altamente dinâmicas.

Tivemos a ideia do estudo de isolamento de cloroplastos porque algumas pesquisas sugeriam que a formação de estromulos exigia estruturas citoplasmáticas, como o citoesqueleto, para se desenvolver. Por isso, decidimos homogeneizar a célula e verificar se os estromulos ainda poderiam se formar. Para preparar as amostras de folhas, comece usando uma lâmina de barbear muito afiada para cortar uma pequena seção de uma folha de Nicotiana benthamiana.

Imediatamente após cortar o fragmento da folha, submergi-lo em uma seringa de cinco mililitros preenchida com água. Em seguida, remova o ar da seringa e aplique vácuo cobrindo o orifício da seringa com o dedo, antes de puxar o êmbolo. Libere suavemente o êmbolo para evitar danificar o fragmento da folha.

Em seguida, repita a remoção de ar duas ou três vezes, ou até que todo o ar tenha sido removido e a folha pareça verde-escura. Adicione uma gota de água a uma lâmina e coloque o fragmento da folha sobre a gota. Em seguida, adicione outra gota de água sobre a folha e coloque uma lamínula.

Se houver bolhas de ar, toque suavemente na lamínula até que sejam removidas. Com luz transmitida e uma objetiva de 20x, foque em um campo de visão próximo ao centro da seção da folha, visualizando múltiplos cloroplastos simultaneamente. Salve uma imagem com luz transmitida, para que os tipos celulares possam ser diferenciados posteriormente, se necessário.

Em seguida, mude para a iluminação a laser com os filtros de excitação e emissão apropriados para o fluoróforo utilizado e salve outra imagem. Utilizando o software do microscópio, selecione o canal GFP e clique para ajustar a abertura do diafragma a uma unidade airy. Selecione a varredura a laser para começar a visualizar a amostra e, em seguida, clique no canal GFP e no ganho do detector para minimizar a potência do laser, mantendo ainda uma visualização clara das estromulas.

Em seguida, prepare um experimento de pilha Z que coletará a série de imagens através da epiderme da folha no campo de visão. Ajuste a velocidade de varredura e a resolução da imagem conforme necessário para garantir que a pilha Z seja coletada rapidamente. Em seguida, salve a pilha Z para análise posterior.

Usando o ImageJ, una a pilha Z em uma única imagem utilizando a intensidade máxima no software. Em seguida, identifique e conte manualmente todos os cloroplastos na imagem. Para cada cloroplasto, determine visualmente se um ou mais estromulos são observados estendendo-se a partir do cloroplasto na imagem da pilha Z combinada.

Para extrair cloroplastos intactos, prepare o tampão de extração frio utilizando os seguintes reagentes. Em seguida, com NaOH e HCl, ajuste o pH para 6,9 e refrigere antes do uso. Prepare o tampão de isolamento e ajuste o pH para 7,6.

Se as folhas não estiverem expressando um estromofluoróforo codificado geneticamente, prepare uma solução de diacetato de carboxifluoresceína, ou CFDA. Para isolar cloroplastos, remova aproximadamente 5 a 10 gramas de folhas de várias plantas e lave brevemente em água fria. Em seguida, transfira imediatamente as folhas para 50 mililitros de tampão de extração frio.

Usando um liquidificador com vários pulsos curtos, triture as folhas e filtre a mistura por duas a três camadas de pano de queijo para remover os detritos foliares. Divida os cloroplastos extraídos em dois tubos de centrífuga de 50 mililitros e centrifugue por um minuto a 750 x g. Descarte o sobrenadante e use 10 mililitros de tampão de isolamento para ressuspender os cloroplastos verdes.

Em seguida, centrifugue novamente por um minuto a 750 x g, descarte o sobrenadante e use o tampão de isolamento para re-suspender os cloroplastos até um volume final de cinco mililitros. Se os cloroplastos forem de plantas transgênicas expressando proteínas fluorescentes direcionadas aos plastídios, transfira 20 microlitros dos cloroplastos para uma lâmina e adicione uma lamínula. Em seguida, realize a microscopia.

Para corar cloroplastos de plantas que não expressam proteínas fluorescentes direcionadas ao plastídio, adicione cinco microlitros de estoque de CFDA 50 milimolar aos cinco mililitros de cloroplastos em tampão de isolamento. Após permitir que os cloroplastos incubem por cinco minutos, transfira uma pequena alíquota para uma lâmina, adicione uma lamínula e realize a microscopia. Por fim, utilize um conjunto de filtros FITC ou GFP e uma objetiva de 20x para visualizar múltiplos cloroplastos simultaneamente.

Ou uma objetiva de maior aumento para visualizar um único cloroplasto isolado. Aqui é mostrada uma pilha combinada mostrando a frequência de estomulos verdes fluorescentes na epiderme de plântulas jovens de N. benthamiana. Neste painel, a imagem foi dessaturada e invertida para que o estroma apareça preto.

Os cloroplastos foram classificados como tendo ou não estromulos. Dos 87 cloroplastos epidérmicos visualizados, 33 apresentam estromulos, o que corresponde a uma frequência de 37,9 por cento nesta folha. Este gráfico representa a análise de mais de 23.000 cloroplastos e de várias centenas de células de uma única folha proveniente de 21 plantas diferentes.

A frequência média de estromulos durante o dia foi de 20,8 mais ou menos 1,8 por cento, e a frequência média noturna de estromulos foi de 12,8 mais ou menos 0,9 por cento, indicando uma frequência significativamente maior durante o dia, conforme determinado pelo teste T de Welch. Nesta figura, estromulos de cloroplastos foram observados in vitro após o isolamento de N. benthamiana expressando GFP direcionada a plastídeos, ou após o uso de CFDA para colorir cloroplastos de N. benthamiana, ou Spinachia oleracea. Ao realizar a microscopia de células vivas de estromulos, é importante trabalhar rapidamente e manipular o tecido vegetal o mínimo possível.

Após este procedimento, outros métodos como silenciamento gênico ou tratamentos químicos podem ser utilizados para descobrir outros participantes moleculares ou vias envolvidas na formação e função de estromulos. Esta técnica tem sido usada por pesquisadores em biologia celular vegetal e imunidade de plantas para estudar o papel dos estromulos em vias de sinalização celular e nas respostas das plantas a patógenos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como calcular a frequência de estromulos em uma folha e de como observar estromulos em cloroplastos extraídos.

E lembre-se de que os lasers e a tensão elétrica que alimentam um microscópio confocal eletrônico de varredura podem ser extremamente perigosos, e é importante compreender os requisitos do sistema para o uso desse equipamento.