Visualizando Frequency Stromule com microscopia de fluorescência

O objetivo geral deste procedimento é visualizar e determinar a frequência de estromos usando microscopia de fluorescência confocal de células vivas dentro das folhas e para visualizar estromos in vitro usando cloroplasto extraído das folhas. Esses métodos experimentais podem ajudar a responder a questões-chave na biologia celular vegetal e na pesquisa do cloroplasto, descobrindo como os estromulos funcionam. A principal vantagem dessas técnicas é que elas produzem dados reprodutíveis e robustos, mesmo dessas estruturas de cloroplastos altamente dinâmicas.

Tivemos a ideia do estudo de isolamento do cloroplasto porque algumas pesquisas sugeriram que a formação de estromule exigia estruturas citosólicas, como o citoesqueleto, para se formar. Então decidimos misturar a célula e ver se os estromules ainda podiam se formar. Para preparar amostras de folhas, comece usando uma lâmina de barbear muito afiada para cortar uma pequena seção de uma folha de Nicotiana benthamiana.

Imediatamente após cortar a seção da folha, mergulhe-a em uma seringa de cinco mililitros cheia de água. Em seguida, remova o ar da seringa e aplique um vácuo usando um dedo para cobrir o orifício da seringa, antes de puxar o êmbolo. Solte suavemente o êmbolo para evitar danificar a seção da folha.

Em seguida, repita a remoção do ar duas ou três vezes, ou até que o ar tenha sido removido e a folha pareça verde profunda. Adicione uma gota de água a uma lâmina e coloque a seção da folha na gota. Em seguida, adicione outra gota de água no topo da folha e adicione uma lamínula.

Se houver bolhas de ar, bata suavemente na lamínula até que sejam removidas. Com luz transmitida e uma objetiva de 20x, concentre-se em um campo de visão próximo ao centro da seção da folha, visualizando vários cloroplastos simultaneamente. Salve uma imagem com luz transmitida, para que os tipos de células possam ser distinguidos posteriormente, se necessário.

Em seguida, mude para iluminação a laser com os filtros de excitação e emissão apropriados para o fluoróforo que está sendo usado e salve outra imagem. Usando o software do microscópio, selecione o canal GFP e clique para ajustar a abertura do orifício para uma unidade arejada. Selecione a varredura a laser para começar a visualizar a amostra e, em seguida, clique no canal GFP e no ganho do detector para minimizar a potência do laser enquanto ainda visualiza claramente os estromulas.

Em seguida, prepare um experimento de pilha Z que coletará a série de imagens através da epiderme da folha no campo de visão. Ajuste a velocidade de digitalização e a resolução da imagem conforme necessário para garantir que a pilha Z seja coletada rapidamente. Em seguida, salve a pilha Z para análise posterior.

Usando a imagem J, mescle a pilha Z em uma única imagem usando a intensidade máxima no software. Em seguida, identifique e conte manualmente todos os cloroplastos na imagem. Para cada cloroplasto, determine visualmente se um ou mais estromélios são vistos estendendo-se do cloroplasto na imagem da pilha Z mesclada.

Para extrair cloroplastos intactos, prepare o tampão de extração a frio usando os seguintes reagentes. Em seguida, com NaOH e HCl, ajuste o pH para 6,9 e leve à geladeira antes de usar. Prepare o tampão de isolamento e ajuste o pH para 7,6.

Se as folhas não estiverem expressando um estromofluoróforo geneticamente codificado, prepare o diacetato de carboxifluoresceína ou a solução de CFDA. Para isolar os cloroplastos, remova aproximadamente 5 a 10 gramas de folhas de várias plantas e enxágue brevemente em água fria. Em seguida, transfira imediatamente as folhas para 50 mililitros de tampão de extração a frio.

Usando um liquidificador com vários pulsos curtos, moa as folhas e filtre a mistura por duas a três camadas de pano de queijo para remover os restos das folhas. Divida o cloroplasto extraído em dois tubos de centrifugação de 50 mililitros e centrifugue por um minuto a 750 x g. Descarte o sobrenadante e use 10 mililitros de tampão de isolamento para ressuspender os cloroplastos verdes.

Em seguida, centrifugar novamente durante um minuto a 750 x g, rejeitar o sobrenadante e utilizar tampão de isolamento para ressuspender os cloroplastos até um volume final de cinco mililitros. Se os cloroplastos forem de plantas transgênicas que expressam proteínas fluorescentes direcionadas a plastídios, transfira 20 microlitros dos cloroplastos para uma lâmina e adicione uma lamínula. Em seguida, faça microscopia.

Para corar cloroplastos de plantas que não estão expressando proteínas fluorescentes direcionadas a plastídios, adicione cinco microlitros de estoque CFDA de 50 milimolares aos cinco mililitros de cloroplastos em tampão de isolamento. Depois de deixar os cloroplastos incubarem por cinco minutos, transfira uma pequena alíquota para uma lâmina, adicione uma lamínula e faça microscopia. Por fim, use um conjunto de filtros FITC ou GFP e uma objetiva de 20x para visualizar vários cloroplastos simultaneamente.

Ou um objetivo maior para visualizar um único cloroplasto isolado. Uma pilha mesclada mostrando a frequência de estômulos GFP na codoledência de mudas jovens de N.Benthamiana é mostrada aqui. Neste painel, a imagem foi dessaturada e invertida para que o estroma pareça preto.

Os cloroplastos foram rotulados como não tendo estromulos ou tendo pelo menos um estromula. Dos 87 cloroplastos epidérmicos visualizados, 33 apresentam estromos, com uma frequência de 37,9% nesta folha. Este gráfico representa a análise de mais de 23.000 cloroplastos e várias centenas de células de uma única folha de 21 plantas diferentes.

A frequência média de estromos durante o dia foi de 20,8 mais ou menos 1,8 por cento, e a frequência média de estromos noturnos foi de 12,8 mais ou menos 0,9 por cento, indicando uma frequência diurna significativamente maior, conforme determinado pelo teste T de Welch. Nesta figura, estromos de cloroplastos foram observados in vitro após o isolamento de N. benthamiana expressando GFP direcionada a plastídios, ou após o uso de CFDA para corar cloroplastos de N. benthamiana ou Spinachia oleracea. Ao realizar imagens de células vivas de estromulas, é importante trabalhar rapidamente e manipular o tecido vegetal o mínimo possível.

Após este procedimento, outros métodos, como silenciamento de genes ou tratamentos químicos, podem ser usados para descobrir atores moleculares adicionais ou vias envolvidas na formação e função do estroma. Esta técnica tem sido usada por pesquisadores em biologia celular vegetal e imunidade vegetal para estudar o papel dos estromules nas vias de sinalização celular e nas respostas das plantas a patógenos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como calcular a frequência de estromulos em uma folha e como observar estromos em cloroplastos extraídos.

E lembre-se de que os lasers e a tensão elétrica que fornecem um microscópio confocal eletrônico de varredura podem ser extremamente perigosos, e é importante entender os requisitos do sistema para usar este equipamento.