Name: Visualizando Frequency Stromule com microscopia de fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprenda a visualizar a frequência de estromulos em cloroplastos de Nicotiana benthamiana usando microscopia confocal de fluorescência em células vivas. Este método fornece dados reprodutíveis sobre a dinâmica dessas estruturas em biologia vegetal.

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J.O.B. e A.M.R. foram apoiados por bolsas de pré-doutorado da National Science Foundation.

NOTA: Para este protocolo, temos nos concentrado em ensaio frequência stromule na epiderme de N. deixa benthamiana. Várias linhas transgénicas estáveis foram gerados que pode ser utilizado para este fim, incluindo a 35S PRO: FNRtp: EGFP 13 e NRIP1 Cerulean: 6. Ambas estas linhas mostram a expressão robusta de fluoróforos no estroma do cloroplasto de folhas cultivadas sob uma ampla gama de condições. Alternativamente, fluoróforos segmentados por cloroplastos pode ser transitoriamente expresso em N. benthamiana usando Agrobacterium Transformações 13. Isto é menos do que ideal as linhas transgénicas, dado que as infiltrações de Agrobacterium induzem algumas respostas de defesa basais em N. benthamiana e interacções com Agrobacterium pode alterar a frequência stromule na folha 14, potencialmente complicar a interpretação dos resultados. Finalmente, para visualizar a formação stromule in vitro,cloroplastos pode ser extraído a partir de qualquer espécie de planta, utilizando fluoróforos geneticamente codificados ou um corante fluorescente, tal como descrito na secção 5 abaixo. 9,15 NOTA:. Métodos pormenorizados de cultivo de plantas foram previamente descritos 16 Resumidamente, crescer N. plantas benthamiana em 4 potes &quot;preenchidos com qualquer mistura de solo profissional que fornece uma boa drenagem. Cubra mudas com uma cúpula de plástico transparente para os primeiros 10-14 dias para fornecer um ambiente úmido para a germinação. adicionar qualquer combinação de fertilizantes padrão seguindo as instruções do fabricante para 14- plantas dias de idade. Cultive plantas sob luz branca, usando ~ 100 mol fótons m -2 seg -1 intensidade de luz. As plantas aquáticas regularmente. 1. Preparar as amostras de folhas para visualização NOTA: dinâmica Stromule são afetados por ferindo 8, então a preparação do tecido deve ser realizada imediatamente antes visualizando stromules por microscopia de fluorescência confocal. Idealmente, uma amostra deve ser visualizado com 15 min após remoção a partir da planta. <ol><li> Corte uma pequena secção da folha usando uma lâmina de barbear muito afiada. Sempre utilizar a mesma região da folha de consistência, e ter a certeza de visualizar a mesma superfície (adaxial ou abaxial) em todas as experiências. </li><li> Imediatamente após o corte da secção de folha, submergir a secção de folha em 5 ml de uma seringa sem agulha cheia com água, remover o ar a partir da seringa, e aplicar um vácuo, cobrindo o orifício de seringa com um dedo e puxando o êmbolo. <ol><li> Solte o êmbolo com cuidado para não danificar a secção de folha. Repetir este duas ou três vezes, ou até a maior parte do ar ter sido retirado e a folha parece ser verde profundo. NOTA: Este passo remove o ar na folha que pode interferir com a visualização precisa de stromules. </li></ol></li><li> Adicionar uma gota de água para um slide e colocar a folha nesta secção gota. Em seguida, adicione outro drop de água para a parte superior da folha, e colocar uma lamela de cobertura sobre a folha. Se houver quaisquer bolhas de ar, bata suavemente a lamínula até que sejam removidos. O slide está agora pronto para a microscopia, e deve ser visualizada imediatamente. </li></ol> 2. A visualização Stromules com microscopia de fluorescência confocal <ol><li> Com luz transmitida, o foco sobre um campo de visão perto do centro da secção de folha (de distância a partir das células danificadas pela lâmina de barbear). Usar uma objectiva 20X de modo que muitos cloroplastos podem ser visualizadas simultaneamente. Guardar uma imagem com luz transmitida de modo que tipos de células podem distinguir-se mais tarde, se necessário. </li><li> Alternar a fonte de iluminação para um laser com filtros de excitação e emissão adequados para o fluoróforo ser utilizado. Por exemplo, excita GFP com um laser de 488 nm e recolher emissões entre 500 nm e 525 nm. <ol><li> Usando o software do microscópio, selecione o canal de GFP e clique para ajustar a abertura pinhole a 1 Aiunidade de ry. Escolha de varredura a laser, para começar a visualizar a amostra e, em seguida, clique no canal de GFP para ajustar a intensidade do laser eo ganho de detector para minimizar a potência do laser, enquanto ainda visualizar claramente stromules. Uma vez que essas configurações tenham sido determinadas, mantê-los o mais consistente possível em todos os experimentos. </li></ol></li><li> Prepare uma experiência -stack z que irá recolher uma série de imagens através da epiderme da folha no campo de visão. <ol><li> Para o z -stack, incluir todos os cloroplastos epidérmicas no campo de visão para evitar viés (por exemplo, se os cloroplastos perto da superfície da folha ter mais stromules em condições testadas). </li><li> Captar imagens no intervalo máximo possível, que incluirá todos os stromules mas minimizar o tempo necessário para um -stack z. Por exemplo, se uma unidade de Airy é equivalente a uma secção confocal de focagem é que 2 um de profundidade, tendo uma imagem a cada 2 um é provavelmente ideal. NOTA: O epidermi folhaS é uma superfície irregular, de modo que a profundidade total do -stack z irá variar, dependendo da amostra; a maioria -stacks z exigirá 10-20 imagens, mas pode incluir mais. </li><li> Ajuste a velocidade de digitalização e resolução de imagem conforme necessário para se certificar de que o -stack z é recolhido rapidamente (normalmente dentro de 5-10 min, se possível). Salve o -stack z para análise posterior. </li></ol></li></ol> Processamento 3. Imagem <ol><li> Determinar a freqüência stromule usando qualquer software de análise de imagem. Para este protocolo, recomendamos a utilização ImageJ, que está disponível ao público a partir do National Institutes of Health (http://imagej.nih.gov/ij/), ou o upgrade popular de ImageJ, Fiji (http://fiji.sc / Fiji). </li><li> Mesclar o z -stack em uma única imagem utilizando a projeção de máxima intensidade no software. </li><li> Identificar e contar manualmente todos os cloroplastos na imagem. </li><li> Para cada cloroplasto, determinar visualmente se um ou mais stromulessão vistas estendendo-se desde o cloroplasto na imagem do z mesclada -stack. Para exemplos, ver Figura 1. Observação: Uma vez que as funções biológicas de stromules não são conhecidos, qualquer, cheio de estroma, extensão tubular fina do cloroplasto pode ser considerado como um &quot;stromule&quot;, independentemente do comprimento. Como regra geral, uma extensão cheio de estroma do cloroplasto é um stromule se for menos do que cerca de 1 um de diâmetro ao longo da maioria do seu comprimento 7. Certifique-se que uma pessoa analisa todas as imagens para controlar as diferenças subjetivas para determinar se ou não um cloroplasto tem uma stromule. Um segundo pesquisador deve verificar independentemente as frequências stromule para reduzir ainda mais preconceitos subjetivos. </li></ol> 4. Desenho Experimental e Amostragem NOTA: Stromule frequência é altamente variável entre as folhas, mas vários relatos sugerem que há pouca variação na frequência stromule dentro de uma indivi9,17 dupla folha. <ol><li> Calcular a frequência da folha stromule de um único campo de vista de uma folha. Descarte a folha, e considerar esta uma amostra independente. Não considere campos separados de vista de uma folha como amostras independentes. NOTA: Não há forte consenso sobre a melhor medida essas mudanças na atividade stromule, e até que a função de stromules é mais claramente definida, os investigadores devem continuar a ser criativo em quantificar a dinâmica stromule. Para a comparação entre a literatura, no entanto, as normas comuns de comunicação de dados deve ser utilizado, além de abordagens mais criativas. No mínimo, sempre relatar a frequência de cloroplastos que têm um ou mais stromules. </li><li> Determinar a frequência dos cloroplastos que têm stromules em um campo de visão. Use ImageJ para identificar todos os cloroplastos em um campo de visão. Em seguida, para cada cloroplasto, determinar se o cloroplasto tem formado pelo menos um stromule. frequência stromule relatório como o percentaGE de cloroplastos com um stromule. NOTA: Alguns pesquisadores transformar a percentagem, por exemplo, com a transformação arco-seno, antes de relatar frequências stromule; enquanto esta é uma opção para a análise estatística, o arco-seno de frequência stromule não é um valor intuitivo e não precisa ser relatado no texto principal ou números de um estudo. <ol><li> Como abordagem alternativa, contar o número total de stromules, e dividi-lo pelo número total de cloroplastos. NOTA: Na maioria dos casos, isso irá produzir resultados semelhantes para abordar 4.2; pode superestimar a frequência stromule, no entanto, se um único cloroplasto tem formado muitos stromules. No exemplo mostrado em resultados representativos, por exemplo, vários cloroplastos têm dois ou mais stromules, elevando o número de stromules por cloroplasto para 40/87 (versus uma frequência stromule de 33/87). </li><li> Alternativamente, determinar o comprimento, em vez de frequência stromule stromule. O comprimento pode ser medidoem ImageJ, traçando a stromule com a ferramenta de linha à mão livre. Observação: Uma vez que o papel biológico do stromules permanece desconhecido, não é claro que o comprimento stromule afecta a sua função. Relatam diferenças significativas em comprimento stromule se eles são observados, mas também relatam as frequências stromule (como descrito em 4.2). NOTA: frequência Stromule pode ser altamente variável entre as folhas diferentes sob as mesmas condições de crescimento. Portanto, embora a determinação frequência stromule pode ser demorado, os experimentos devem ser cuidadosamente projetado para incluir amostras de grande tamanho. Usando conjuntos de dados do nosso laboratório, determinou-se que uma amostra de pelo menos 16 plantas por cada tratamento é geralmente suficientemente poderoso para determinar se existe uma diferença estatisticamente significativa de pelo menos uma alteração de 1,5 vezes na frequência stromule entre duas condições (com a norma α = 0,05 e β = 0,80). </li></ol></li><li> A análise estatística dos resultados. <ol><li> Para comparar a mimum stromule frequências de dois tratamentos, utilize o teste t de Welch (também conhecido como o teste t ou t heteroscedástico assumindo variância desigual). NOTA: Este teste não é tão poderoso quanto o teste t de Student convencional, mas o teste t de Welch é vantajoso porque não assume que a variação na distribuição de frequência stromule é semelhante entre os tratamentos. NOTA: Uma vez que a frequência stromule é uma &quot;proporção&quot;, a sua distribuição de amostragem está previsto para ser binomial, em vez do que o normal, o que poderia análise estatística, teoricamente, inclinação, se as amostras são muito baixa ou se a frequência stromule é muito baixo (próximo a 0%) ou muito elevado (perto de 100%). Alguns relatórios têm utilizado arcsine transformações antes da análise estatística, que se destina a transformar uma distribuição binomial a uma distribuição normal, e, assim, satisfazer os requisitos da norma de um teste t de Student ou ANOVA. Na prática, no entanto, umatransformações rcsine têm pouco ou nenhum efeito na análise estatística, e, portanto, não são recomendados. Em vez disso, repetir experiências para aumentar o tamanho da amostra, o que vai aumentar o poder estatístico e reduzir os erros de interpretação de dados. </li><li> Independentemente da abordagem estatística é usado, não se esqueça de informar cuidadosamente a estratégia de amostragem, dimensão da amostra, teste estatístico e valor de p para cada experimento. NOTA: Como com outros campos da biologia, um valor p inferior a 0,05 pode ser considerado &quot;estatisticamente significativa&quot;, embora os pesquisadores certamente deve informar o valor p precisa obtido. Se p é ligeiramente acima de 0,05, aumentando o tamanho da amostra com duas ou três experiências podem contribuir para determinar se ou não a diferença observada é reprodutível e estatisticamente significativa. </li></ol></li></ol> 5. Extrair cloroplastos intactos para Visualize Stromule Dynamics NOTA: Vários métodostêm sido utilizados para isolar os cloroplastos de folhas, incluindo um protocolo ligeiramente diferente num estudo recente sobre a formação in vitro stromule 15. O protocolo detalhado abaixo utiliza um método relativamente simples que não se obter amostras de cloroplastos bioquimicamente puros, mas que em vez disso isolar uma quantidade grande de cloroplastos intactos, 9,18 saudáveis. <ol><li> Prepare tampão de extracção a frio: mM Hepes NaOH 50, sorbitol 330 mM, EDTA 2 mM, MgCl 1,0 mM 2, e MnCl 1,0 mM 2. Ajustar o pH para 6,9 com NaOH e HCl, e refrigerar antes da utilização. Nota: Embora não necessário, utilizando tampões frio e manter as amostras em gelo quando possível irá produzir uma proporção mais elevada de cloroplastos intactos. </li><li> Preparar tampão de isolamento: 50 mM de Hepes NaOH, sorbitol 330 mM, EDTA 2 mM, MnCl 2 1,0 mM, NaCl mM, 1,0 mM de MgCl 2, 10 mM de KCl, e 1,0. Ajustar o pH para 7,6 com NaOH e HCl e refrigerar antes da utilização. </li><li> Se as folhas não sãoexpressando um fluoróforo do estroma geneticamente codificada, diacetato de carboxifluoresceína preparar a solução (CFDA): CFDA solução estoque a 50 mM em sulfóxido de dimetilo (DMSO) (2,3 mg CFDA por 1,0 mL de DMSO). NOTA: A concentração exacta não é crítica. Manter estoque CFDA no escuro em todos os momentos. Armazenar aliquotas de pequenos CFDA 50 mM a -20 ° C. </li><li> Para isolar cloroplastos, remova ~ 5-10 g folhas de várias plantas e lavar brevemente em água fria. transferir imediatamente para 50 ml de tampão de extracção a frio. folhas de moagem, utilizando um liquidificador com vários pulsos curtos. Filtrar através de duas ou três camadas de gaze para remover restos de folhas, dividir os cloroplastos extraídos em dois tubos de centrífuga de 50 ml e centrifugar durante 1 min a 750 x g. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender as cloroplastos verdes em tampão de isolamento 10 ml. Centrifugar novamente durante 1 min a 750 xg, descartar o sobrenadante e ressuspender cloroplastos em tampão de isolamento para levar o volume final até 5 ml. </li><li> Transferir 201; l dos cloroplastos para um slide, cubra com uma lamela, e começar a microscopia. NOTA: Os cloroplastos de plantas transgênicas que expressam proteínas fluorescentes segmentadas plastídeo agora está pronto para visualização por microscopia de fluorescência confocal. </li><li> Manchar cloroplastos de plantas que não são expressam proteínas fluorescentes segmentadas plastídeo para visualizar stromules. <ol><li> Adicionam-se 5 ul de estoque 50 mM de CFDA para os 5 ml de cloroplastos-suspensas em tampão de isolamento. Levar a concentração final de 50 uM. </li><li> Permitir cloroplastos para incubar durante 5 min, e, em seguida, transferir uma pequena alíquota (~ 50 jil) a uma lâmina, coberta com uma lamela, e começar a microscopia. </li><li> Use um conjunto de filtros FITC ou GFP. Use um objetivo 20X para visualizar muitos cloroplastos, simultaneamente, ou um objectivo superior para visualizar um único cloroplasto isolado. NOTA: CFDA ficam fluorescentes dentro do estroma dos cloroplastos intactos. </li><li> Se não houver fundo fluorescência forte, lavar o chloroplasts novamente em 10 ml de tampão de isolamento após a 5 minutos de incubação com CFDA, centrifugar durante 1 minuto a 750 xg, descartar o sobrenadante e ressuspender em 5 ml de tampão de isolamento. </li></ol></li></ol>

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<li>Chiang, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+GATA+transcription+factors+GNC+and+CGA1+reveals+their+key+role+in+chloroplast+development%2C+growth%2C+and+division+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the GATA transcription factors GNC and CGA1 reveals their key role in chloroplast development, growth, and division in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 160 (1), 332-348 (2012).</li>
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<li>Schattat, M. H., Klösgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+stromule+formation+by+extracellular+sucrose+and+glucose+in+epidermal+leaf+tissue+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of stromule formation by extracellular sucrose and glucose in epidermal leaf tissue of Arabidopsis thaliana.</a> BMC Plant Biol. 11, 115(2011).</li>
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<li>Waters, M. T., Fray, R. G., Pyke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromule+formation+is+dependent+upon+plastid+size%2C+plastid+differentiation+status+and+the+density+of+plastids+within+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Stromule formation is dependent upon plastid size, plastid differentiation status and the density of plastids within the cell.</a> Plant J. 39 (4), 655-667 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Ao investigar stromules, três fatores importantes devem ser considerados ao longo de: (i) a manipulação do tecido da planta devem ser mantidos a um mínimo absoluto, (ii) o sistema experimental deve ser mantido consistente, e (iii) estratégias de amostragem devem ser cuidadosamente planejado para assegurar robusto, os dados podem ser reproduzidos são analisados. Stromules são notavelmente dinâmica: eles podem se estender e retrair rapidamente diante dos olhos de um observador sob o microscópi...

Os cloroplastos são organelas dinâmicas nas células vegetais responsáveis pela fotossíntese e uma série de outros processos metabólicos. As vias de sinalização do cloroplasto também exercem influência significativa na fisiologia e no desenvolvimento das plantas, coordenando as respostas das plantas ao estresse ambiental, patógenos e até mesmo ao formatodas folhas 1-6. Recentemente, os biólogos ganharam interesse em um aspecto pouco compreendido da estrutura do cloroplasto: estromos, túbulos muito finos cheios de estroma que se estendem da superfície do cloroplasto7.
As funções biológicas dos estromos permanecem desconhecidas, embora se saiba que a frequência dos estromos varia em resposta a estímulos ambientais7-9, e os estromos podem ser capazes de transmitir moléculas de sinalização entre organelas6. Todos os tipos de plastídios (não apenas os cloroplastos verdes e fotossintéticos, mas também leucoplastos transparentes, amiloplastos preenchidos com amido e cromoplastos pigmentados, para citar alguns tipos de plastídios) produzem estromulas, e estromules são encontrados em todas as espécies de plantas terrestres que foram examinadas até o momento. Os estromulos podem se estender e retrair dinamicamente, aparecendo ou desaparecendo em segundos, ou podem permanecer relativamente estacionários por longos períodos. Um dos principais obstáculos enfrentados pelos biólogos de estromos é que os estromos são frequentemente estudados usando métodos, tecidos e espécies dramaticamente diferentes, dificultando as comparações entre a literatura de biologia de estromos. No futuro, práticas padrão e descrições completas dos sistemas experimentais usados para estudar estromules serão essenciais para descobrir a função dessas características onipresentes da morfologia do cloroplasto.
Aqui descrevemos métodos para visualizar a formação de estromos nos cloroplastos epidérmicos das folhas de Nicotiana benthamiana. No mesofilo, os cloroplastos são densamente compactados em grandes células tridimensionais, o que dificulta a visualização precisa e rápida dos estromos por microscopia confocal. Por outro lado, as células epidérmicas são relativamente planas, contêm menos cloroplastos e estão na superfície da folha, permitindo uma visualização fácil e rápida dos estromulas. N. benthamiana é um sistema modelo ideal para esses experimentos porque, ao contrário de muitas espécies de plantas, todas as células da epiderme de N. benthamiana produzem cloroplastos10. Na epiderme da maioria das plantas, incluindo Arabidopsis thaliana, apenas as células-guarda estomáticas possuem cloroplastos, enquanto outras células epidérmicas possuem "leucoplastos", plastídios claros, relativamente amorfos e não fotossintéticos9,11,12. Assim, enquanto um único campo de visão de uma epiderme de A. thaliana pode mostrar apenas um punhado de cloroplastos em um par de células-guarda, um campo de visão de uma epiderme de N. benthamiana incluirá dezenas ou mesmo centenas de cloroplastos. Todos os métodos descritos aqui, no entanto, podem ser modificados para investigar outras questões na biologia do estromule; por exemplo, usamos a mesma abordagem para estudar os estromos leucoplastos de A. thaliana9.

<table><tbody><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fischer-Scientific</td><td>S320-1</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fischer-Biotech</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal de Varredura a Laser&nbsp;</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td>Modelo: LSM710</td><td></td></tr><tr><td>Diacetato de carboxifluoresceína (CFDA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21879&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>EMD</td><td>MX1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Waring liquidificador</td><td>Waring&nbsp;</td><td>Modelo: 31BL92</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>fiji.sc</td><td></td><td>Software de código aberto para análise de imagens biológicas</td></tr></tbody></table>

visualizando frequency stromule com microscopia de fluorescência

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, ou "túbulos cheios de estroma", são extensões tubulares estreitas da superfície do cloroplasto que são universalmente observadas em células vegetais, mas cujas funções permanecem misteriosas. Juntamente com a crescente atenção sobre o papel dos cloroplastos na coordenação das respostas das plantas ao estresse, o interesse em estromos e sua relação com a dinâmica de sinalização do cloroplasto aumentou nos últimos anos, auxiliado por avanços na microscopia de fluorescência e fluoróforos de proteínas que permitem uma visualização rápida e precisa da dinâmica do estroma. Aqui, fornecemos protocolos detalhados para testar a frequência do estroma nos cloroplastos epidérmicos de Nicotiana benthamiana, um excelente sistema modelo para investigar a biologia do estroma do cloroplasto. Também fornecemos métodos para visualizar estromos de cloroplastos in vitro extraindo cloroplastos das folhas. Finalmente, delineamos estratégias de amostragem e abordagens estatísticas para analisar as diferenças nas frequências de estromulos em resposta a estímulos, como estresse ambiental, tratamentos químicos ou silenciamento de genes. Os pesquisadores podem usar esses protocolos como ponto de partida para desenvolver novos métodos para experimentos inovadores para explorar como e por que os cloroplastos produzem estromulas.

Este protocolo foi usado para visualizar a frequência stromule de dia e à noite nos cotilédones de jovens N. mudas benthamiana. Fatias de uma pilha z foram fundidas em uma única imagem (Figura 1A). Para efeitos visuais, que a imagem foi então Saturado e invertido de modo que o estroma aparece negro (Figura 1B). Os cloroplastos foram marcados quer como não tendo stromules asterisco (verde) ou com pelo menos um stromule (asterisc...

Protocolos para investigar a dinâmica dos estromos do cloroplasto, os túbulos cheios de estroma que se estendem da superfície dos cloroplastos, são descritos.

Visualizando Frequency Stromule com microscopia de fluorescência

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar e determinar a frequência de estromulos utilizando microscopia de fluorescência confocal em células vivas dentro de folhas, e para visualizar estromulos in vitro utilizando cloroplastos extraídos de folhas. Esses métodos experimentais podem ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia celular vegetal e na pesquisa de cloroplastos, ao descobrir como os estromulos funcionam. A principal vantagem dessas técnicas é que elas geram dados reprodutíveis e robustos, mesmo para essas estruturas de cloroplastos altamente dinâmicas.Tivemos a ideia do estudo de isolamento de cloroplastos porque algumas pesquisas sugeriam que a formação de estromulos exigia estruturas citoplasmáticas, como o citoesqueleto, para se desenvolver. Por isso, decidimos homogeneizar a célula e verificar se os estromulos ainda poderiam se formar. Para preparar as amostras de folhas, comece usando uma lâmina de barbear muito afiada para cortar uma pequena seção de uma folha de Nicotiana benthamiana.Imediatamente após cortar o fragmento da folha, submergi-lo em uma seringa de cinco mililitros preenchida com água. Em seguida, remova o ar da seringa e aplique vácuo cobrindo o orifício da seringa com o dedo, antes de puxar o êmbolo. Libere suavemente o êmbolo para evitar danificar o fragmento da folha.Em seguida, repita a remoção de ar duas ou três vezes, ou até que todo o ar tenha sido removido e a folha pareça verde-escura. Adicione uma gota de água a uma lâmina e coloque o fragmento da folha sobre a gota. Em seguida, adicione outra gota de água sobre a folha e coloque uma lamínula.Se houver bolhas de ar, toque suavemente na lamínula até que sejam removidas. Com luz transmitida e uma objetiva de 20x, foque em um campo de visão próximo ao centro da seção da folha, visualizando múltiplos cloroplastos simultaneamente. Salve uma imagem com luz transmitida, para que os tipos celulares possam ser diferenciados posteriormente, se necessário.Em seguida, mude para a iluminação a laser com os filtros de excitação e emissão apropriados para o fluoróforo utilizado e salve outra imagem. Utilizando o software do microscópio, selecione o canal GFP e clique para ajustar a abertura do diafragma a uma unidade airy. Selecione a varredura a laser para começar a visualizar a amostra e, em seguida, clique no canal GFP e no ganho do detector para minimizar a potência do laser, mantendo ainda uma visualização clara das estromulas.Em seguida, prepare um experimento de pilha Z que coletará a série de imagens através da epiderme da folha no campo de visão. Ajuste a velocidade de varredura e a resolução da imagem conforme necessário para garantir que a pilha Z seja coletada rapidamente. Em seguida, salve a pilha Z para análise posterior.Usando o ImageJ, una a pilha Z em uma única imagem utilizando a intensidade máxima no software. Em seguida, identifique e conte manualmente todos os cloroplastos na imagem. Para cada cloroplasto, determine visualmente se um ou mais estromulos são observados estendendo-se a partir do cloroplasto na imagem da pilha Z combinada.Para extrair cloroplastos intactos, prepare o tampão de extração frio utilizando os seguintes reagentes. Em seguida, com NaOH e HCl, ajuste o pH para 6,9 e refrigere antes do uso. Prepare o tampão de isolamento e ajuste o pH para 7,6.Se as folhas não estiverem expressando um estromofluoróforo codificado geneticamente, prepare uma solução de diacetato de carboxifluoresceína, ou CFDA. Para isolar cloroplastos, remova aproximadamente 5 a 10 gramas de folhas de várias plantas e lave brevemente em água fria. Em seguida, transfira imediatamente as folhas para 50 mililitros de tampão de extração frio.Usando um liquidificador com vários pulsos curtos, triture as folhas e filtre a mistura por duas a três camadas de pano de queijo para remover os detritos foliares. Divida os cloroplastos extraídos em dois tubos de centrífuga de 50 mililitros e centrifugue por um minuto a 750 x g. Descarte o sobrenadante e use 10 mililitros de tampão de isolamento para ressuspender os cloroplastos verdes.Em seguida, centrifugue novamente por um minuto a 750 x g, descarte o sobrenadante e use o tampão de isolamento para re-suspender os cloroplastos até um volume final de cinco mililitros. Se os cloroplastos forem de plantas transgênicas expressando proteínas fluorescentes direcionadas aos plastídios, transfira 20 microlitros dos cloroplastos para uma lâmina e adicione uma lamínula. Em seguida, realize a microscopia.Para corar cloroplastos de plantas que não expressam proteínas fluorescentes direcionadas ao plastídio, adicione cinco microlitros de estoque de CFDA 50 milimolar aos cinco mililitros de cloroplastos em tampão de isolamento. Após permitir que os cloroplastos incubem por cinco minutos, transfira uma pequena alíquota para uma lâmina, adicione uma lamínula e realize a microscopia. Por fim, utilize um conjunto de filtros FITC ou GFP e uma objetiva de 20x para visualizar múltiplos cloroplastos simultaneamente.Ou uma objetiva de maior aumento para visualizar um único cloroplasto isolado. Aqui é mostrada uma pilha combinada mostrando a frequência de estomulos verdes fluorescentes na epiderme de plântulas jovens de N. benthamiana. Neste painel, a imagem foi dessaturada e invertida para que o estroma apareça preto.Os cloroplastos foram classificados como tendo ou não estromulos. Dos 87 cloroplastos epidérmicos visualizados, 33 apresentam estromulos, o que corresponde a uma frequência de 37,9 por cento nesta folha. Este gráfico representa a análise de mais de 23.000 cloroplastos e de várias centenas de células de uma única folha proveniente de 21 plantas diferentes.A frequência média de estromulos durante o dia foi de 20,8 mais ou menos 1,8 por cento, e a frequência média noturna de estromulos foi de 12,8 mais ou menos 0,9 por cento, indicando uma frequência significativamente maior durante o dia, conforme determinado pelo teste T de Welch. Nesta figura, estromulos de cloroplastos foram observados in vitro após o isolamento de N. benthamiana expressando GFP direcionada a plastídeos, ou após o uso de CFDA para colorir cloroplastos de N. benthamiana, ou Spinachia oleracea. Ao realizar a microscopia de células vivas de estromulos, é importante trabalhar rapidamente e manipular o tecido vegetal o mínimo possível.Após este procedimento, outros métodos como silenciamento gênico ou tratamentos químicos podem ser utilizados para descobrir outros participantes moleculares ou vias envolvidas na formação e função de estromulos. Esta técnica tem sido usada por pesquisadores em biologia celular vegetal e imunidade de plantas para estudar o papel dos estromulos em vias de sinalização celular e nas respostas das plantas a patógenos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como calcular a frequência de estromulos em uma folha e de como observar estromulos em cloroplastos extraídos.E lembre-se de que os lasers e a tensão elétrica que alimentam um microscópio confocal eletrônico de varredura podem ser extremamente perigosos, e é importante compreender os requisitos do sistema para o uso desse equipamento.

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Research

JoVE Journal

Biology

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