Visualização da Motilidade da Vesícula em Neurônios Usando Imagem de Fluorescência

Pegue o plasmídeo desejado em meio sem soro. Este plasmídeo codifica proteínas específicas da vesícula com marcadores fluorescentes.

Em outro tubo, pegue o reagente de transfecção diluído em meio sem soro.

Misture as duas soluções e incuba.

O reagente de transfecção se combina com o plasmídeo, formando um complexo.

Pegue um poço contendo neurônios aderentes na mídia com soro. Adicione os complexos e incube. O complexo facilita a entrada do plasmídeo na célula.

Descarte a mídia para remover complexos não internalizados.

Adicione mídia fresca e depois incuba.

O plasmídeo entra no núcleo para ser transcrito e é então traduzido em proteínas fluorescentes específicas da vesícula que marcam as vesículas nos neurônios.

Usando um microscópio de fluorescência sob temperatura controlada, adquira imagens em intervalos de tempo especificados.

Para analisar as imagens, defina os parâmetros de rastreamento.

Identifique a vesícula de interesse e registre suas coordenadas em cada uma das imagens.

Compile os dados para visualizar o movimento da vesícula.

Neste procedimento, misture 4 microgramas de plasmídeo com 200 microlitros de meio sem soro. Em um tubo separado, diluir oito microlitros do reage