Visualização da Motilidade da Vesícula em Neurônios Usando Imagem de Fluorescência

Pegue o plasmídeo desejado em meio sem soro. Este plasmídeo codifica proteínas específicas da vesícula com marcadores fluorescentes.

Em outro tubo, pegue o reagente de transfecção diluído em meio sem soro.

Misture as duas soluções e incuba.

O reagente de transfecção se combina com o plasmídeo, formando um complexo.

Pegue um poço contendo neurônios aderentes na mídia com soro. Adicione os complexos e incube. O complexo facilita a entrada do plasmídeo na célula.

Descarte a mídia para remover complexos não internalizados.

Adicione mídia fresca e depois incuba.

O plasmídeo entra no núcleo para ser transcrito e é então traduzido em proteínas fluorescentes específicas da vesícula que marcam as vesículas nos neurônios.

Usando um microscópio de fluorescência sob temperatura controlada, adquira imagens em intervalos de tempo especificados.

Para analisar as imagens, defina os parâmetros de rastreamento.

Identifique a vesícula de interesse e registre suas coordenadas em cada uma das imagens.

Compile os dados para visualizar o movimento da vesícula.

Neste procedimento, misture 4 microgramas de plasmídeo com 200 microlitros de meio sem soro. Em um tubo separado, diluir oito microlitros do reagente de transfecção em 200 microlitros de meio sem soro. Em seguida, incube a solução por 5 minutos em temperatura ambiente. Após cinco minutos, misture a solução de plasmídeo e a solução reagente de transfecção e incube a mistura por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione a mistura aos pratos de fundo de vidro revestido.

Incube os neurônios a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, substitua o meio por 2 mililitros de meio de cultura cortical cerebral e incube os neurônios a 37 graus Celsius por um a dois dias.

Para imagens, use um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera CCD com lentes objetivas de 40x. Mantenha a temperatura em 37 graus Celsius usando um sistema de incubação. Adquira imagens de neurônios em 1 quadro a cada 5 segundos durante um período de 100 segundos controlado pelo software de aquisição de imagem.

Para analisar as imagens, abra todas as imagens sequenciais no software ImageJ com rastreamento manual. Para combinar as imagens sequenciais, escolha Imagem, depois Pilhas seguidas de Imagens a serem empilhadas e clique em OK. Depois disso, escolha Plug-ins e, em seguida, Rastreamento manual. Uma janela de rastreamento aparecerá. Clique na caixa de seleção de Mostrar parâmetros e defina os parâmetros de rastreamento na seção de parâmetros.

Em seguida, clique em Adicionar faixa para iniciar uma nova faixa. Depois de determinar as vesículas de interesse, clique no centro dos sinais nas imagens sequenciais para registrar as coordenadas XY. Repita este procedimento para coletar as coordenadas XY das vesículas de todas as imagens sequenciais. Cada imagem avança automaticamente para a imagem sucessiva depois que o ponto de referência é selecionado.