Name: Termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano Bound to S -citalopram (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Aprenda a termoestabilizar, purificar e cristalizar o transportador de serotonina humano ligado ao S-citalopram usando células HEK293S. Este método permite estudar proteínas de membrana para desenvolvimento de fármacos.

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Agradecemos a D. Cawley por gerar anticorpos monoclonais. Agradecemos a A. Penmatsa e K. Wang por compartilharem ideias e conhecimentos desenvolvidos a partir do transportador de dopamina. L. Vaskalis pela ajuda com as figuras, H. Owen pela ajuda na preparação do manuscrito e outros membros do laboratório Gouaux por discussões úteis. J.A.C. tem o apoio de uma bolsa de pós-doutorado Banting dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde. E.M.G. é apoiado pela National Science Foundation Graduate Research Fellowship. Somos particularmente gratos a Bernie e Jennifer LaCroute por seu generoso apoio, bem como pelo financiamento do NIH (5R37MH070039). EG é um investigador do Howard Hughes Medical Institute.

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Determinação de estrutura de proteína de membrana por técnicas biofísicas permanece uma tarefa difícil para muitos transportadores clinicamente significativos, receptores e canais 11. Aqui temos conhecimentos partilhar detalhada desenvolvido para a determinação da estrutura do transportador de serotonina humano ligado a S -citalopram. Prevemos que estes métodos irão ser úteis para determinar estruturas de SERT em outros estados conformacionais, bem como estruturas de outras proteínas de membrana difíceis. Além disso, as técnicas bioquímicas descritos aqui também podem ser usadas para estudar a função de SERT purificada em detergente e um ambiente quase nativo lípido. SERT cristalização articulada sobre o desenvolvimento de várias técnicas e ferramentas. Em primeiro lugar, as melhorias na estabilidade térmica transportador produzidos variantes SERT que foram bem-comportado em várias micelas de detergentes seguintes extração do transportador a partir de membranas 6. Em segundo lugar, o uso-citalopram do ligando de afinidade elevada ao longo S purificação e cristalização adicional estabilidade melhorada e reduzida heterogeneidade conformacional. Em terceiro lugar, o desenvolvimento do sistema de expressão BacMam 7 permitido para a produção de grandes quantidades de SERT em um curto período de 2 semanas, o que facilita tanto a imunização e cristalização. Finalmente, o desenvolvimento de estratégias para seleccionar anticorpos de afinidade elevada que reconhecem epitopos 3D permitiu a descoberta de que o anticorpo 8B6 que promove a embalagem bem ordenada de complexos anticorpo-SERT em cristais. Há uma série de passos e reagentes críticos, bem como problemas comuns que ocorrem frequentemente ao longo do protocolo. Em primeiro lugar, a geração de elevado título de vírus SERT P2 pode ser problemático. A adição de concentrações baixas de vírus P1 para gerar vírus P2, como descrito neste protocolo normalmente mitiga este problema, e nos casos em que o título do vírus P2 é baixo, vírus P3 podem ser feitos Utilizang vírus a uma MOI de 0,0001. Os vírus com um título inferior a 1 x 10 8 partículas de vírus / ml não devem ser utilizados e quase sempre resultar em rendimentos baixos da proteína. Para a expressão, HEK293S GnTI - células foram escolhidos uma vez que falta N -acetylglucosaminyltransferase eu actividade e, assim, não pode sintetizar-glicanos complexos n, em vez produzindo apenas N-glicanos de manose elevada. Cliva EndoH N -ligada glicosilação de altas glicanos de manose em dois locais na alça extracelular 2 (EL2), deixando uma acetilglicosamina N ligado a asparagina. A digestão de N -linked açúcares reduz entropia superfície de EL2 que é provável importante para a cristalização. Para a geração de anticorpos, o SERT IC deve ser utilizada para a imunização. GFP é altamente imunogénica e 12 não deve ser usada como uma etiqueta de fusão para gerar anticorpos uma vez que é difícil de remover completamente por SEC. A N- flexível e C-terminal da SERT também não eramincluída na construção, a fim de evitar os anticorpos contra estas regiões. Os ratos podem ser imunizados com 30 ug de proteína reconstituída; continuar ratinhos imunizantes até concentrações elevadas no soro de anticorpos pode ser detectada e produzir células de hibridoma, tal como descrito 13. Uma construção thermostabilized é geralmente a melhor escolha para a imunização; se o transportador é bem comportado e mantém a actividade biológica após purificação, esta é muitas vezes suficiente para produzir anticorpos. O anticorpo 8B6 foi levantada contra WT SERT. Para a cristalização, apenas as fracções de pico contendo de Sec complexo monodisperso como julgado por FSEC devem ser combinadas e concentradas. cristais SERT-8B6 crescer em uma estreita faixa de condições e há uma série de passos que devem ser tomadas para solucionar problemas especificamente relacionados ao crescimento SERT cristal. Tris base ajustado com HCl, não deve ser usado na solução de reservatório, uma vez que este tampão não suporta o crescimento de cristais; é, assim, CRIticos em vez disso, use Tris ajustado com NaOH. cristais SERT crescer numa estreita faixa de concentrações de PEG 400, de modo que se cristais não crescem ou se se observarem cristais muitos pequenos, mesmo um pequeno aumento ou diminuição da concentração de PEG 400 seria aconselhável. Além disso, o aditivo de ácido 6-amino-hexanóico também foi utilizado no ecrã optimizado para melhorar a nucleação. A proporção gota de proteína: solução bem é também uma chave determinante para o crescimento de cristais. Gota rácios de 1,5-2: 1 são recomendados, com proporções mais estreitas gota a 2: 1, tipicamente de suporte do crescimento de cristais de 3-dimensionais maiores. Finalmente, o uso de baixo perfil placas de 24 poços também é crucial para o crescimento de cristais, presumivelmente devido à alteração da taxa de difusão de vapor. Uma abordagem alternativa para o método SPA foi desenvolvido para o rastreio de mutantes que estabilizam o transportador de serotonina rato numa conformação ligado a cocaína utilizando um filtro de ensaio de ligação 5. Em contrapartida, o ba SPAensaio sed permite passos de aquecimento sequenciais seguintes por determinação da fração de SERT, que permanece ligada ao ligando. Assim, isto permite a determinação rápida da temperatura de fusão a partir de um pequeno número de amostras. O método SPA baseia-se na disponibilidade de um ligando de alta afinidade marcado radioactivamente e, se não se conhecem os ligandos que se ligam com afinidade submicromolar, em seguida, uma abordagem alternativa será necessário. Muitos outros métodos são geralmente usados para medir a estabilidade da proteína tais como a ligação de corantes fluorescentes e de calorimetria 14 mas são de baixo rendimento e são incapazes de medir directamente a função ou requerem grandes quantidades de proteína. Se o método SPA não pode ser utilizado, uma abordagem alternativa de elevado rendimento é uma termoestabilidade Ensaio Baseado em FSEC 15 (FSEC-TS), em que a amostra é aquecida seguido pela separação da fracção de permanecer transportador. FSEC-TS é uma abordagem útil para aceder comportamento cromatográfica e estado oligomérico e é apferramenta complementar owerful que pode ser usado juntamente com o método SPA. Uma comparação de vários sistemas de expressão de proteína comum, também foi encontrada para favorecer a utilização de células de mamífero para expressão e sem surpresa SERT 16 esta é provavelmente o caso para muitas proteínas de origem mamífera. Os métodos que usamos para a expressão foram adaptados para SERT, mas é provável facilmente adaptável. As condições que favorecem elevados níveis de expressão deve ser cuidadosamente identificados através da variação do tempo de expressão, temperatura, concentração de vírus, e a presença de inibidores de histona-desacetilase, tais como o butirato de sódio. Em geral, favorecem a purificação por afinidade de um detergente de cadeia longa, tais como C12M leve juntamente com CHS antes da reconstituição para manter o ligando de alta afinidade de ligação. Reconstituição utilizando absorção hidrofóbica é uma técnica suave que se descobriram ser eficaz para vários outros transportadores e receptores. Se estenão é bem sucedida, a remoção de detergentes com altas concentrações de micelas críticas por diálise, de diluição, ou SEC pode ser empregue 17, desde que o antigénio seja suficientemente estável em tais detergentes. Nos casos em que não há anticorpos adequados são encontrados, nós quase sempre encontrar o problema é devido à perda de função ou desnaturação do antígeno e, nesses casos, foi realizada com sucesso novas imunizações prestando especial atenção à bioquímica de proteínas. Finalmente, os ligandos e anticorpos que se ligam com afinidade elevada deve formar a base para um experimento de cristalização racionalmente planeada, e tirando partido de uma variante termoestável, pode-se o despiste de uma gama mais ampla de condições, fazendo variar as propriedades de diferentes detergentes. Além disso, a cristalização de uma mesofase lipídica 18 ou usando bicelles 19 deve ser sempre considerada como uma alternativa à cristalização em micelas. Estes princípios e métodos podem ser usados ​​com algum modificação para muitas outras proteínas transmembranares que são difíceis de expressar e purificar a partir de outros hospedeiros de expressão, e será particularmente útil para a determinação da estrutura de alvos de drogas de alta afinidade.

O transportador de serotonina (SERT) é uma proteína da membrana integral, que facilita o transporte de serotonina através das membranas celulares 1. SERT pertence a uma família de Neurotransmissor SIMPORTADORES sódio (NSS), que também inclui a dopamina e norepinefrina transportadores 2. SERT é o alvo molecular de medicamentos antidepressivos e anti-ansiedade amplamente prescritos que agem para inibir competitivamente o transporte da serotonina 3. SERT explora o co-transporte energeticamente favorável de sódio para remover o neurotransmissor da fenda sináptica. Caracterização extensiva do sistema serotonérgico tem mostrado que mudanças no metabolismo da serotonina parecem influenciar praticamente todos os processos neurológicos, incluindo humor, sono, dor, cognição e agressão comportamentos 4. SERT função pode ser modificado através da utilização de antidepressivos e de recaptação da serotonina (SSRIs) -citalopram como S, bem como por psychostimulants e drogas de vício tais como anfetaminas e -methylamphetamine N 3,4-metilenodioxi ou &quot;ecstasy&quot; 1,2. ISRSs são extremamente importante para o tratamento de transtornos de humor, no entanto, a base estrutural para a sua acção preciso não é bem compreendido. WT SERT é instável em micelas de detergentes, impedindo assim o progresso no sentido de uma estrutura tridimensional (3D) de SERT 5,6. Recentemente, desenvolvemos variantes de SERT que são robustamente estável em uma ampla gama de detergentes e reter SSRI actividade 6 vinculativo. Estas variantes SERT termoestáveis ​​foram seleccionados usando um ensaio de estabilidade térmica à base de proximidade de cintilação. Aqui, descrevemos um procedimento para a geração de anticorpos de elevada afinidade que se podem ligar SERT, e a purificação e cristalização de SERT termoestável, em complexo com o anticorpo e S -citalopram. Este protocolo assume que a SERT e 8B6 genes têm sido bem sucedidaY clonado nos vectores BacMam 7 e insectos de expressão, respectivamente. Para gerar anticorpos, de ADNc que codificam os resíduos 73-616 de WT SERT foi clonado no vector BacMam com um Strep II etiqueta C-terminal (SERT IC). Para a tela de estabilidade térmica, foi usado resíduos SERT 73-616 com GFP C-terminal, Strep II e 10-his (TC SERT). Mutações pontuais individuais foram gerados no fundo SERT TC. Para o protocolo de cristalização, a proteína de fusão SERT-GFP foi usado com Twin-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys], e 10-his, transportando os mutantes termoestáveis, Y110A, I291A, e T439S e mutações de cisteínas superfície C554A, C580A , e C622A (CC SERT). Sequências de clivagem de trombina (LVPRGS) também foram inseridos no CC SERT após Q76 e T618 para permitir a remoção do N- e C-terminais. O plasmídeo que codifica para o Fab de 8B6 foi manipulada para expressar tanto o pesada e levecadeias do anticorpo com sequências de secreção de gp67 sob o controlo de dois promotores poliedrina separados. O C-terminal da cadeia pesada do anticorpo 8B6 foi marcado com um 8-His e um local de clivagem de trombina foi inserido entre a cadeia pesada e a etiqueta.

<table><tbody><tr><td>DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td></td><td>Fisher BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Sigma</td><td>T-7660</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Invitrogen</td><td>15519-028</td><td>5-Bromo-3-indolil &beta;-D-galactopirinosídeo</td></tr><tr><td>Isopropil beta-D-1-tiogalactopiranosídeo</td><td>Anatrace</td><td>I1003</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Sf9 reagente de transfecção</td></tr><tr><td>Sf9</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 III SFM mídia</td><td>Life Technologies</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293S GnTI-</td><td>ATCC</td><td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle 293 mídia</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>293 mídia de expressão</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>0984018DJ</td><td></td></tr><tr><td>Butirato de sódio</td><td>Sigma</td><td>303410</td><td></td></tr><tr><td>S-citalopram</td><td>Sigma</td><td>E4786</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>n-Dodecil-beta-D-Maltopiranosídeo</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>Hemisuccinato de colesterol</td><td>Sigma</td><td>C6013</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457P</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757P</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457P</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Pepestatina A</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Desthiobiotin</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1000-05</td><td></td></tr><tr><td>Asolectina</td><td>Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma</td><td>C-8667</td><td></td></tr><tr><td>Lipídio A</td><td>Sigma</td><td>L5399</td><td></td></tr><tr><td>Lipídio polar cerebral</td><td>Avanti Lipídios polares</td><td>141101C</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads</td><td>Biorad</td><td>152-3920</td><td>Resina de absorção hidrofóbica</td></tr><tr><td>Cabra anti-rato IRDye 680RD</td><td>Odyssey</td><td>926-68070</td><td>Usado como anticorpo secundário para western blotting</td></tr><tr><td>Lauryl maltose neopentilglicol</td><td>Anatrace</td><td>NG310</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>Serotonina</td><td>Sigma</td><td>H9523</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac 8B6</td><td></td><td></td><td>Disponível dos autores</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT Strep II</td><td></td><td></td><td>SERTIC, Disponível dos autores</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT GFP gêmeo Strep His</td><td></td><td></td><td>SERTTC, Disponível a partir dos autores</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERTCC, Disponível a partir dos autores</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>n-Octyl &beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>O310</td><td></td></tr><tr><td>Anagrade Trombina</td><td>Haematologic Technologies</td><td>HCT-0020</td><td></td></tr><tr><td>EndoH</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Tris é usado para a preparação de reservatórios de cristalização</td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Sigma</td><td>91893</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 6-aminohexanóico</td><td>Sigma</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CV</td><td></td></tr><tr><td>Isoplate-96 TC</td><td>PerkinElmer</td><td>6005070</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen</td><td>SL100688</td><td>Reagente de transfecção de polímero para células mamalianas</td></tr><tr><td>Cobre HIS-Tag YSI SPA Beads</td><td>PerkinElmer</td><td>RPNQ0096</td><td>His-tag affinity SPA beads</td></tr><tr><td>Citalopram, [N-Methyl-3H]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET1039250UC</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td>bloco de aquecimento para ensaio de termoestabilidade</td></tr><tr><td>ThermoTop</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>SmartBlock PCR 96, termobloco para placas PCR</td><td>Eppendorf</td><td>5306000006</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &micro; m filtro de seringa</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de filtro de 1 L</td><td>Corning</td><td>430517</td><td></td></tr><tr><td>Balão de cultura de tecidos de fundo plano de 2 L Genemate</td><td></td><td>F-5909-2000</td><td></td></tr><tr><td>Balão de cultura de tecidos defletor de 2 L</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000B</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Forma Orbital Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>416</td><td></td></tr><tr><td>Resina Strep-Tactin</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1208-025</td> Extrusora de <td>resina de afinidade estreptocócica</td></tr> Sistema <tr><td></td><td>de imagem Li-Cor Sistema de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>imagem</td><td>Odyssey</td><td></td><td>western blot sistema de imagem</td></tr><tr><td>XK16 coluna</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9889-37</td><td>usada para purificação de Strep-Tactin e Talon</td></tr><tr><td>Concentrador de proteínas MWCO de 100 kDa</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador de proteínas MWCO de 30 kDa</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; kta FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>UPC-900</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>51476</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 (10/300) coluna</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td>Usado para</td></tr><tr><td>FSEC Aparelho de fluxo tangencial</td><td>Pall Filtron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &micro; célula de fluxo tangencial de filtro m</td><td>Pall Filtron</td><td>PSM20C11</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO concentrador de fluxo tangencial</td><td>Pall Filtron</td><td>OS030T12</td><td></td></tr><tr><td>resina Talon</td><td>Clonetech</td><td>635504</td><td>resina de afinidade His-tag usada para purificação Fab</td></tr><tr><td>1 mL HiTrap SP coluna</td><td>GE Healthcare</td><td>17115101</td><td>Trocador de cátions usado para purificação Fab</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL</td> coluna<td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>Usado para separação SEC da placa SERT-8B6</td></tr><tr><td>VDXm de 24 poços</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-306</td><td></td></tr><tr><td>lamínulas de 18 mm</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-239</td><td></td></tr><tr><td>Contador de vírus Virocyt</td><td>Virocyt</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>MicroBeta</td><td>Trilux PerkinElmer</td><td>1450</td><td>Contador de cintilação de 96 poços</td></tr><tr><td>HiTrap SP coluna</td><td>GE Healthcare</td><td>17115101</td><td></td></tr><tr><td>Sertralina</td><td>Sigma</td><td>S6319</td><td></td></tr></tbody></table>

termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano bound to<em&gt; s</em&gt; -citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

O transportador da serotonina é um transportador de sódio e acoplado a cloreto de que &quot;bombas&quot; de serotonina extracelular em células. -citalopram S é um medicamento utilizado para tratar a depressão e ansiedade através da ligação ao transportador da serotonina com alta afinidade, bloqueando a recaptação de serotonina. Aqui nós relatamos um procedimento eficiente e um conjunto de ferramentas para estabilizar, expresso, purificar e cristalizar serotonina complexos transportadores de anticorpos ligados a S -citalopram e outros antidepressivos. Mutações que estabilizam o transportador da serotonina foram identificados utilizando um ensaio de ligação S -citalopram. Transportador de serotonina expressa em baculovírus transduzidas HEK293S GnTI - células, foi reconstituída em proteolipossomas e utilizados para produzir anticorpos de elevada afinidade. Nós desenvolvemos uma estratégia para descobrir anticorpos que são úteis para estudos estruturais. Uma abordagem simples para a expressão de fragmentos de anticorpo em células Sf9 também foi estabelecida.Complexos transportadores-anticorpo purificado usando este procedimento são bem-comportado e prontamente cristalizar, produzindo complexos com S -citalopram que difractam raios-X para 3-4 Å de resolução. As estratégias desenvolvidas aqui pode ser utilizado para determinar a estrutura de outras proteínas da membrana desafiantes.

Uma biblioteca de mutantes de um único ponto no fundo SERT TC foi criado para a tela para thermostabilizing mutações. mutantes individuais foram geradas utilizando a mutagénese padrão. O protocolo de selecção utiliza células HEK293S e uma tela de termoestabilidade com base em proximidade de cintilação transientemente transfectada para rapidamente identidade mutações úteis para a cristalização, conforme descrito na Figura 1A. Valores Trama Tm contra ligado de [3H] citalopram à TA revela construções com elevada termoestabilidade e de expressão de níveis adequados para a purificação de proteínas (Figura 1B). Três mutantes (Y110A, I291A, e T439S) foram combinadas para gerar uma construção altamente estável (Figura 1C). A termoestabilidade está também correlacionada com o aumento da estabilidade em detergentes de cadeia curta necessárias para a cristalização do complexo Fab-SERT. A expressão em larga escala de SERT humano utilizando baculovírus-transduced HEK293S GnTI - células pode levar menos de 2 semanas e podem produzir quantidades de miligramas, tal como ilustrado na Figura 2A. Utilização da proteína SERT CC GFP permite a SERT ser convenientemente seguido durante a expressão e a purificação por fluorescência (Figura 2B). A nossa estratégia de purificação envolveu 1) solubilização de SERT ligado a S -citalopram a partir de GnTI HEK293S - células em C12M na presença de CHS como um lípido de estabilização; 2) ligação do SERT a uma matriz de afinidade Strep; 3) a remoção de proteínas contaminantes por lavagem exaustiva; e 4) eluição da SERT funcional com tampão contendo destiobiotina (Figura 2C). A proteína eluída é em grande parte isenta de outras proteínas detectáveis por coloração com azul de Coomassie e monodisperso como julgado por FSEC (Figura 2D, E). Uma estratégia semelhante foi feita para purificar SERT com uma etiqueta Strep II que foi usada para reconstitution e imunização (Figura 3A, B). Incorporação de SERT em proteolipossomas aumenta a meia-vida no soro e a estabilidade da SERT e aumenta a probabilidade de isolamento de anticorpos de elevada afinidade. Além disso, a inclusão de lípido A, um componente da parede celular bacteriana, serve como um potente adjuvante 9. Os lipossomas multilamelares foram preparados pela adição de tampão para uma mistura de lípidos secos em tubos de vidro e ressuspensas em tampão. A extrusão de lipossomas através de filtros de tamanho de poro de 200 nm produz monodispersas suspensões lipossómicas unilamelares. Os lipossomas são, em seguida, saturado com um detergente, seguida pela adição de SERT purificada em detergente. Finalmente, o detergente é removido por adição de resina hidrofóbica de absorção para o lípido: mistura detergente. ligando adicional deve ser adicionado à amostra reconstituída para seleccionar anticorpos que reconhecem a conformação ligada antidepressivo. A presença de SERT nas proteolipossomos deve ser confirmado porsolubilização de uma pequena amostra com tintura SDS-PAGE carga ou C12M e em execução no SDS-PAGE e FSEC (Figura 3C, D). linhas celulares de hibridoma que expressam anticorpos SERT pode ser rastreada para ligantes de afinidade elevada que reconhecem epítopos em 3D. Estas propriedades são cruciais para o eventual sucesso de cristalização, como o anticorpo deve manter-se firmemente ligada a uma região estruturada para promover empacotamento cristalino de homogéneos, domínios bem ordenadas. No primeiro passo, os anticorpos que reconhecem regiões não estruturados são identificados. SERT é desnaturado e transferido para uma membrana de nitrocelulose; anticorpos que se ligam SERT desnaturado será ocidental-positiva e provavelmente reconhecem epítopos lineares. Na Figura 4A, que mostram exemplos de 2 anticorpos que são ocidental-positiva e, provavelmente, não é útil para promover crystallogenesis. Na Figura 4B, os restantes anticorpos ocidental-negativos são incubadas com 100 nM de SERT-GFP e separados porFSEC. Os anticorpos que se ligam SERT irá deslocar o pico de GFP-positiva para uma posição anterior. Os complexos SERT-anticorpo pode ser diluída adicionalmente em detergente para determinar se eles podem ligar-se com afinidade nanomolar, seguido de análise por FSEC. A adição de resultados de serotonina em alterações conformacionais no transportador e, portanto, os anticorpos podem ser novamente pesquisadas para determinar se são capazes de reconhecer especificamente a conformação SSRI-ligado. Na Figura 4C, os anticorpos são mostrados para ligar SERT na presença de serotonina, que mostra que o epitopo (s) não mudam do SSRI ao substrato estado ligado. Finalmente, na Figura 4D combinações de anticorpos são testados quanto à sua capacidade para se ligar epitopos distintos, o que resulta em mais um desvio para a esquerda. Aqui, o 15B8 ou 8A11 anticorpos reconhecem um epitopo que é diferente do 8B6. O anticorpo 8B6 foi escolhido para posterior análise estrutural com base na triagem de cristal preliminar com trea papaínated Fab. Os genes de 8B6 do Fab foram clonados num vector de expressão de células de insecto. Fab podem ser expressas e segregadas a partir de células Sf9 em crescimento em suspensão. O 8B6 Fab pode ser purificado a partir do sobrenadante de células Sf9 por His-tag de afinidade (Figura 5A, B) e cromatografia de permuta catiónica (Figura 5C, D) resultando em proteína que aparece livre de contaminantes em geles de SDS-PAGE. Na Figura 5E, o recombinante 8B6 Fab é mostrado ligar SERT e é usado em experiências bioquímicas e biofísicas subsequentes. A afinidade purificado SERT CC é digerida com trombina e a EndoH e misturado com 8B6 Fab de modo a formar um complexo na presença de S -citalopram. O complexo transportador-anticorpo é então separado por SEC em C8M (Figura 6A) e as fracções de pico conter tanto SERT e Fab como mostrado por SDS-PAGE (Figura 6B). Uso de C8M é crucial para a formação de cristais, provavelmente porqueo detergente de cadeia curta permite uma melhor embalagem entre as moléculas na rede cristalina. FSEC é empregada para determinar quais as fracções devem ser recolhidas para cristalização (Figura 6C); As fracções que não são monodispersas e / ou contêm grandes quantidades de SERT livre ou Fab não devem ser combinados. Prisma cristais SERT-anticorpo em forma podem ser cultivadas na presença de S -citalopram usando este protocolo por enforcamento difusão de vapor de queda (Figura 7A). Os cristais resultantes difratar raios-X para uma resolução de 3,15 Å 10 (Figura 7B). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig1.jpg" /> Figura 1: proximidade de cintilação à base de termoestabilidade Ensaio A.. Visão geral do protocolo para o rastreio de termoestabilidade na presença de [3H] citalopram. B. Máxima ligado [3 </sup&gt; H] citalopram versus a temperatura de fusão aparente (Tm). As linhas pontilhadas representam os valores para o transportador WT. Os 3 mutantes mais termoestáveis ​​são rotulados. Área cinzenta representa mutantes que têm menos de 10% de [3H] citalopram em relação ao WT e valores de Tm de ligação, portanto, imprecisas devido a uma baixa relação sinal-ruído. C. Curvas termoestabilidade para WT SERT TC e os 3 primeiros mutantes. As barras de erro representam o desvio padrão (SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig2.jpg" /> Figura 2: Visão de mamíferos heterólogos Protein Expression A.. Visão geral esquematizado de geração de vírus BacMam e expressão de SERT em HEK293S GnTI -. Células B. ELEK293S GnTI - células que expressam o CC SERT (fluorescência da GFP) C.. Perfil de eluição de CC SERT em resina de afinidade Strep. Vestígio verde representa a concentração de destiobiotina, 0 - 100% (0-5 mM) D.. Análise de afinidade purificado CC SERT numa 4 - gel de 15% SDS-PAGE E.. FSEC de afinidade CC SERT purificada detectado pelo GFP fluorescência (excitação: 480 nm; emissão: 510 nm). O pico de eluição de 15 mL é SERT (#) e 18 mL é GFP livre (*). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig3.jpg" /> Figura 3: Representante Affinity Purificação e Reconstituição da SERT IC A.. Visão esquemática da geração de anticorpos. &lt;strong&gt; B. Perfil de eluição observado a 280 nm de a purificação por afinidade de SERT IC em resina de afinidade Strep. Vestígio verde representa a concentração de destiobiotina, 0 - 100%. (0-5 mM) C. Análise de afinidade purificados e reconstituídos num SERT 4 - gel de 15% SDS-PAGE D.. FSEC de SERT solubilizado após a reconstituição. A fluorescência dos resíduos de triptofano foi usado para detectar SERT (Excitação: 280 nm; emissão: 335 nm). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig4.jpg" /> Figura 4:. Análise do representante SERT Antibodies A. O rastreio de anticorpos por Western blot. Aproximadamente 1 ug de CC SERT com ou sem GFP foi aplicado a 4 - 15% de SDS-gel de PAGE e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A ligação foi detectada utilizando um anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado com corante IV. 2G4 e 10F2 são western positivo. B. A ligação de anticorpos a 100 nM SERT GFP e detecção por FSEC detectada utilizando GFP fluorescência. C. A ligação de Fab seleccionados a 100 nM SERT GFP na presença de 1 mM de serotonina. D. A ligação de 8A11 ou 15B8 Fabs para Sert-8B6 Fab. Picos menores de eluição de 18 ml são GFP livre. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig5.jpg" /> Figura 5: A purificação representativas do 8B6 de Fab a partir de células Sf9 Um.. perfil de eluição observado a 280 nm da purificação do 8B6 Fab por His-tag de afinidade chromatograp<html> HY. Vestígio verde representa a concentração de imidazole, 0 - 50% (0 - 250 mM) B.. Não-redutoras e redutoras em gel de SDS-PAGE depois de purificação por afinidade de His-tag. Proteína que corre perto de 50 kDa é Fab não reduzido (#) e as espécies menores de 25 kDa é reduzido Fab (*). C. perfil de eluição observado a 280 nm da purificação do 8B6 Fab por permuta catiónica exibindo um único pico simétrico que elui sob um gradiente linear de cloreto de sódio. Vestígio verde representa a concentração de NaCl, 0 - 100%. (0 - 500 mM) D. Análise do 8B6 Fab num gel de SDS-PAGE a 12,5%, após purificação por permuta catiónica. E. Ligação do 8B6 Fab a 10 nM SERT GFP, detectada usando fluorescência da GFP. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> e 6 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6: Cromatograf ia de Filtração em Gel representativas do Complexo SERT-8B6 na presença de S Uma -citalopram.. Gel perfil de eluição da filtração purificado complexo SERT-8B6. pico principal que elui a 11,5 mL é o complexo SERT-8B6. Pico em 15-17 mL contém GFP e Fab B.. Análise do complexo SERT-8B6 purificado numa 4 - em gel de SDS-PAGE a 15%. As posições de SERT e as cadeias pesada e leve do Fab são mostrados por uma barra. C. FSEC das fracções separadas por tamanho. complexos SERT-8B6 foram detectados utilizando a fluorescência do triptofano. Fracção 17 contém uma quantidade maior de SERT que não fez complexo com Fab. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54792 / 54792fig7.jpg&quot; /&gt; Figura 7: Cristalização do Complexo SERT-8B6 Bound to S -citalopram A.. A microscopia de luz em forma de paralelepípedo de cristais do complexo SERT-8B6 após 2 semanas de crescimento. A barra de escala é igual a 200 um. B. cristais SERT-8B6 difratar raios-X a 3,15 Å. anel azul representa 3,15 Å. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Tabela 1:. A tela cristalização para o Complexo SERT-8B6 Bound to S -citalopram <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792table1.xlsx">Por favor clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Este manuscrito descreve como para o rastreio de mutações thermostabilizing, purificar o transportador humano de serotonina, gerar anticorpos de elevada afinidade, e cristalizar o complexo transportador-anticorpo serotonina ligada ao -citalopram S droga antidepressiva. Este protocolo pode ser adaptado para o estudo de outros transportadores difíceis de membrana, receptores e canais.

Termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano Bound to<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar um transportador suficientemente estável para estudos estruturais e utilizar esse transportador modificado para produzir cristais que difratam a alta resolução por cristalografia de raios X. Este método pode responder perguntas fundamentais na área da biologia estrutural, como a forma de determinar a estrutura de proteínas de membrana que são alvos importantes de fármacos. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser usada para selecionar uma conformação ligada a um fármaco por meio de um ensaio funcional.Embora este método possa fornecer informações sobre transportadores de neurotransmissores, ele também pode ser aplicado a receptores, canais e proteínas solúveis, que se ligam a moléculas pequenas com alta afinidade. Suspender completamente as células HEK293S GnTI negativas tripsinizadas em DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal até uma densidade de 0,5 milhão de células por mililitro em um reservatório descartável para pipeta. Utilizando uma pipeta multicanal, adicionar 100 microlitros de células a cada poço de uma placa revestida com poli-D-lisina.Resuspenda as células no reservatório da pipeta após o preenchimento de cada placa para garantir uma distribuição uniforme das células. Incube as células no incubador a 37 graus Celsius com 8% de dióxido de carbono. Substitua o meio celular uma hora antes da transvecção.Prepare os complexos do reagente de transvecção de DNA misturando 450 nanogramas de DNA com 45 microlitros de DMEM sem soro para cada construto a ser analisado no fundo cert TC. Em seguida, adicione 1,6 microlitro do reagente de transvecção a 45 microlitros de DMEM sem soro e misture. Adicione imediatamente a solução diluída do reagente de transvecção à solução de DNA e misture.Não misture as soluções em ordem inversa. Aguarde de 10 a 15 minutos antes de adicionar 20 microlitros da mistura de DNA do reagente de transvecção a quatro dos poços. Incube as células com 200 nanomolares de citalopramo e 25 microlitros de TBS por cinco minutos à temperatura ambiente.Para solubilizar as células, adicione 25 microlitros de C12M oito milimolar, CHS um milimolar e coquetel de inibidores de protease em TBS. Incube as células por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 50 microlitros de TBS com citalopram tritiado 20 nanomolar, albúmina sérica bovina 0,1% e miligramas por mililitro de anticorpo anti-his conjugado a microesferas de proximidade de cintilação ou microesferas SPA, a três poços para cada construto.Para o último poço, adicione a mesma solução de TBS, mas suplemente com sertralina 100 micromolar para determinar a ligação não específica. Certifique-se de que as microesferas de afinidade com marcação por His estejam completamente homogeneizadas ao adicioná-las à placa de 96 poços. Meça a ligação de citalopram tritiado utilizando um contador de cintilação de 96 poços à temperatura ambiente, com um tempo de contagem de um minuto por poço.Continue a contagem das placas até que as contagens totais atinjam um platô em aproximadamente 36 horas. Após a medição, aqueça as placas por 15 minutos em um bloco de aquecimento com tampa aquecida a 33 graus Celsius. Meça novamente a ligação de citalopram tritiado após o aquecimento.Repita esses passos com modificação do passo de aquecimento. Ajuste as temperaturas de aquecimento conforme a temperatura aparente de fusão da proteína-alvo e a estabilidade térmica da construção mais estável. Continue aquecendo as placas até que todas as construções apresentem contagens específicas baixas.Cultive células HEK293S GnTI negativas em suspensão a 37 graus Celsius com 8% de dióxido de carbono e 85% de umidade em agitador a 130 RPM e meio de expressão 293 suplementado com 2% de soro bovino fetal. Infete 10 litros das células com o vírus P2 com uma multiplicidade de infecção de dois e uma densidade de três milhões de células por mililitro. 12 a 16 horas após a infecção, adicione butirato de sódio até uma concentração de 10 milimolar a partir de um estoque de um molar.48 a 60 horas após a infecção, colete as células por centrifugação a 4.000 vezes G durante 15 minutos. Remova o sobrenadante. Re-suspenda as células em 150 mililitros de TBS com 2 micromolares de escitalopram ou outros inibidores do SERT.as células de 10 litros de cultura em água morna aproximadamente a 30 graus Celsius e ressuspenda-as passando rapidamente as células por uma pipeta de 10 mililitros até ficar homogêneo. Adicione todas as células a um béquer com um bastão de agitação e adicione toda a solução detergente às células sob agitação. Solubilize as células a quatro graus Celsius por uma hora com agitação.Centrifugue o lisado a 8.000 × g durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Decante o sobrenadante para tubos limpos de ultracentrífuga e descarte o precipitado. Em seguida, centrifugue o sobrenadante a 100.000 × g durante uma hora em uma ultracentrífuga.Após a ultracentrifugação, filtre o sobrenatante através de um filtro de 0,2 mícron e descarte o precipitado. Em seguida, passe o lisado por 10 mililitros de resina de afinidade strep acondicionada em uma coluna, utilizando uma bomba peristáltica equilibrada com tampão de lavagem. Depois, conecte uma coluna de afinidade strep a um sistema de cromatografia líquida de proteínas rápida e lave a coluna a dois mililitros por minuto com 66 mililitros de tampão de lavagem.Eluir a proteína purificada no mesmo tampão de lavagem suplementado com desthiobiotina 5 milimolar a 0,5 mililitro por minuto, utilizando 33 mililitros de tampão. Coletar frações de um mililitro. As frações do pico serão aproximadamente 10 mililitros.Para formar os complexos de transportador e anticorpo, primeiro digira a proteína purificada durante a noite à temperatura ambiente com trombina para remover as marcas e Endo H para desglicosilação. Concentre a proteína até uma concentração de 10 miligramas por mililitro e um volume de 250 a 300 microlitros utilizando um concentrador de proteína por centrifugação com corte de peso molecular de 100 quilodaltons. Misture a proteína SERT concentrada com o fragmento Fab 8B6 em uma proporção molar de um para 1,2 em um volume inferior a 500 microlitros.Centrifugue a mistura a 100.000 ×g e quatro graus Celsius por 20 minutos. Após a centrifugação, colete o sobrenatante contendo o complexo SERT Fab e descarte o pellet. Separe o complexo utilizando cromatografia líquida de proteínas rápida em uma coluna de exclusão por tamanho.Equilibre com TBS suplementado a 0,5 mililitros por minuto. Antes da cristalização, concentre as frações de pico da separação do complexo até dois miligramas por mililitro utilizando um concentrador proteico por centrifugação com corte de peso molecular de 100 quilodaltons. Uma absorbância de duas UA a 280 nanômetros equivale a um miligrama por mililitro.Adicione Fab adicional em uma proporção de um para 0,05 complexo por Fab livre. Adicione também 10 micromolar de citalopram livre S. Após centrifugar a amostra, colete o sobrenadante contendo o complexo Fab SERT e descarte o pellet.Monte uma tela de poço de 24 poços em gota suspensa a quatro graus Celsius de acordo com a tabela um no protocolo do texto. Pipete 500 microlitros de cada solução reservatório em uma placa de 24 poços de perfil baixo com selante aplicado em cada poço. Pipete 1,5, 1,75 e dois microlitros do complexo SERT Fab sobre uma lamínula de vidro silanizada de 18 milímetros.Em seguida, pipete um microlitro da solução reservatório sobre a amostra de proteína. Cristais individuais aparecerão em aproximadamente três dias e crescerão até 100 a 175 micrômetros após 14 dias. São mostrados aqui resultados representativos para triagem de termoestabilidade na presença de citalopram tritiado.Os valores de temperatura de fusão plotados contra a ligação máxima mostram mutantes com alta termoestabilidade e expressão. São exibidas aqui as curvas de termoestabilidade para o SERT TC do tipo selvagem e os três melhores mutantes, Y110A, I291A e T439S. Esta imagem de microscopia mostra células HEK293S GnTI negativas expressando SERT CC com fluorescência verde presente na membrana celular.A cromatografia de exclusão por tamanho com detecção de fluorescência do SERT CC mostra um pico principal em 15 mililitros. A análise por SDS-PAGE exibe uma única espécie proteica amplamente livre de contaminantes. É apresentada uma separação representativa de complexos de anticorpos transportadores por cromatografia de exclusão por tamanho.O pico principal eluindo em 11,5 mililitros continha tanto SERT quanto Fab, conforme mostrado em um gel de SDS-PAGE. A microscopia de luz do complexo anticorpo-SERT ligado ao citalopram S após duas semanas de crescimento mostra cristais com formato prismático de aproximadamente 100 a 175 mícrons. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como identificar mutações que estabilizam uma proteína de membrana em uma conformação ligada a um ligante e de como montar triagens de cristalização com complexos proteína-anticorpo.Ao tentar realizar este procedimento, é importante lembrar que ligantes são necessários para a estabilização do TC de SERT e essenciais para a cristalização do CC de SERT. As implicações desta técnica estendem-se ao tratamento de condições psiquiátricas, pois SERT é o alvo molecular de muitos medicamentos antidepressivos. Após este procedimento, a função de SERT purificada pode ser caracterizada utilizando métodos bioquímicos e biofísicos.

thermostabilization-expression-purification-crystallization-human

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Expressão e purificação de TRPC3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de Single-particle Cryo-elétron

Aqui nós apresentamos um protocolo para expressar, solubilizar e purificar vários transportadores de borato eucarióticas com homologia à família de transportador de SLC4 usando o fermento. Também descrevemos um ensaio químico do cross-linking para avaliar as proteínas homomeric purificado para assembly multiméricas. Esses protocolos podem ser adaptados para outras proteínas de membrana desafiador.

Expressão, solubilização e purificação de transportadores eucarióticas borato

Este artigo apresenta uma série de métodos consecutivos para a expressão e purificação de Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp este protocolo um sistema rápido para purificar o complexo proteico em um dia. Os métodos cobertos são mutagênese direcionada ao local, expressão proteica em Escherichia coli,cromatografia de afinidade, cromatografia de filtração de gel e cristalização.

PCR Mutagenesis, Clonagem, Expressão, Protocolos rápidos de purificação de proteínas e Cristalização do Tipo Selvagem e Formas Mutantes de Synthase Triptofano

Estudos estruturais e bioquímicos de transportadores de membrana humana requerem quantidades de miligramas de proteína estável, intacta e homogênea. Aqui descrevemos métodos escaláveis para selecionar, expressar e purificar transportadores de solutos humanos usando genes otimizados para códons.

Expressão de alto rendimento e purificação de carreadores de solutos humanos para estudos estruturais e bioquímicos

Descrevemos uma estrutura que incorpora análise bioquímica e computacional direta para orientar a caracterização e cristalização de grandes domínios de bobina enrolada. Essa estrutura pode ser adaptada para proteínas globulares ou estendida para incorporar uma variedade de técnicas de alto rendimento.

Combinando Wet and Dry técnicas de laboratório para orientar a cristalização de grandes espiral enrolada contendo proteínas

Aqui, apresentamos um método para expressar e purificar S100A12 (calgranulina C). Descrevemos um protocolo para medir sua atividade antimicrobiana contra o patógeno humano H. pylori .

Expressão, Purificação e Actividade Antimicrobiana de S100A12

Aprenda a termoestabilizar, purificar e cristalizar o transportador de serotonina humano ligado ao S-citalopram usando células HEK293S. Este método permite estudar proteínas de membrana para desenvolvimento de fármacos.

Termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano Bound to

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