Termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano Bound to

O objetivo geral deste procedimento é gerar um transportador suficientemente estável para estudos estruturais e utilizar esse transportador modificado para produzir cristais que difratam a alta resolução por cristalografia de raios X. Este método pode responder perguntas fundamentais na área da biologia estrutural, como a forma de determinar a estrutura de proteínas de membrana que são alvos importantes de fármacos. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser usada para selecionar uma conformação ligada a um fármaco por meio de um ensaio funcional.

Embora este método possa fornecer informações sobre transportadores de neurotransmissores, ele também pode ser aplicado a receptores, canais e proteínas solúveis, que se ligam a moléculas pequenas com alta afinidade. Suspender completamente as células HEK293S GnTI negativas tripsinizadas em DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal até uma densidade de 0,5 milhão de células por mililitro em um reservatório descartável para pipeta. Utilizando uma pipeta multicanal, adicionar 100 microlitros de células a cada poço de uma placa revestida com poli-D-lisina.

Resuspenda as células no reservatório da pipeta após o preenchimento de cada placa para garantir uma distribuição uniforme das células. Incube as células no incubador a 37 graus Celsius com 8% de dióxido de carbono. Substitua o meio celular uma hora antes da transvecção.

Prepare os complexos do reagente de transvecção de DNA misturando 450 nanogramas de DNA com 45 microlitros de DMEM sem soro para cada construto a ser analisado no fundo cert TC. Em seguida, adicione 1,6 microlitro do reagente de transvecção a 45 microlitros de DMEM sem soro e misture. Adicione imediatamente a solução diluída do reagente de transvecção à solução de DNA e misture.

Não misture as soluções em ordem inversa. Aguarde de 10 a 15 minutos antes de adicionar 20 microlitros da mistura de DNA do reagente de transvecção a quatro dos poços. Incube as células com 200 nanomolares de citalopramo e 25 microlitros de TBS por cinco minutos à temperatura ambiente.

Para solubilizar as células, adicione 25 microlitros de C12M oito milimolar, CHS um milimolar e coquetel de inibidores de protease em TBS. Incube as células por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 50 microlitros de TBS com citalopram tritiado 20 nanomolar, albúmina sérica bovina 0,1% e miligramas por mililitro de anticorpo anti-his conjugado a microesferas de proximidade de cintilação ou microesferas SPA, a três poços para cada construto.

Para o último poço, adicione a mesma solução de TBS, mas suplemente com sertralina 100 micromolar para determinar a ligação não específica. Certifique-se de que as microesferas de afinidade com marcação por His estejam completamente homogeneizadas ao adicioná-las à placa de 96 poços. Meça a ligação de citalopram tritiado utilizando um contador de cintilação de 96 poços à temperatura ambiente, com um tempo de contagem de um minuto por poço.

Continue a contagem das placas até que as contagens totais atinjam um platô em aproximadamente 36 horas. Após a medição, aqueça as placas por 15 minutos em um bloco de aquecimento com tampa aquecida a 33 graus Celsius. Meça novamente a ligação de citalopram tritiado após o aquecimento.

Repita esses passos com modificação do passo de aquecimento. Ajuste as temperaturas de aquecimento conforme a temperatura aparente de fusão da proteína-alvo e a estabilidade térmica da construção mais estável. Continue aquecendo as placas até que todas as construções apresentem contagens específicas baixas.

Cultive células HEK293S GnTI negativas em suspensão a 37 graus Celsius com 8% de dióxido de carbono e 85% de umidade em agitador a 130 RPM e meio de expressão 293 suplementado com 2% de soro bovino fetal. Infete 10 litros das células com o vírus P2 com uma multiplicidade de infecção de dois e uma densidade de três milhões de células por mililitro. 12 a 16 horas após a infecção, adicione butirato de sódio até uma concentração de 10 milimolar a partir de um estoque de um molar.

48 a 60 horas após a infecção, colete as células por centrifugação a 4.000 vezes G durante 15 minutos. Remova o sobrenadante. Re-suspenda as células em 150 mililitros de TBS com 2 micromolares de escitalopram ou outros inibidores do SERT.

as células de 10 litros de cultura em água morna aproximadamente a 30 graus Celsius e ressuspenda-as passando rapidamente as células por uma pipeta de 10 mililitros até ficar homogêneo. Adicione todas as células a um béquer com um bastão de agitação e adicione toda a solução detergente às células sob agitação. Solubilize as células a quatro graus Celsius por uma hora com agitação.

Centrifugue o lisado a 8.000 × g durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Decante o sobrenadante para tubos limpos de ultracentrífuga e descarte o precipitado. Em seguida, centrifugue o sobrenadante a 100.000 × g durante uma hora em uma ultracentrífuga.

Após a ultracentrifugação, filtre o sobrenatante através de um filtro de 0,2 mícron e descarte o precipitado. Em seguida, passe o lisado por 10 mililitros de resina de afinidade strep acondicionada em uma coluna, utilizando uma bomba peristáltica equilibrada com tampão de lavagem. Depois, conecte uma coluna de afinidade strep a um sistema de cromatografia líquida de proteínas rápida e lave a coluna a dois mililitros por minuto com 66 mililitros de tampão de lavagem.

Eluir a proteína purificada no mesmo tampão de lavagem suplementado com desthiobiotina 5 milimolar a 0,5 mililitro por minuto, utilizando 33 mililitros de tampão. Coletar frações de um mililitro. As frações do pico serão aproximadamente 10 mililitros.

Para formar os complexos de transportador e anticorpo, primeiro digira a proteína purificada durante a noite à temperatura ambiente com trombina para remover as marcas e Endo H para desglicosilação. Concentre a proteína até uma concentração de 10 miligramas por mililitro e um volume de 250 a 300 microlitros utilizando um concentrador de proteína por centrifugação com corte de peso molecular de 100 quilodaltons. Misture a proteína SERT concentrada com o fragmento Fab 8B6 em uma proporção molar de um para 1,2 em um volume inferior a 500 microlitros.

Centrifugue a mistura a 100.000 ×g e quatro graus Celsius por 20 minutos. Após a centrifugação, colete o sobrenatante contendo o complexo SERT Fab e descarte o pellet. Separe o complexo utilizando cromatografia líquida de proteínas rápida em uma coluna de exclusão por tamanho.

Equilibre com TBS suplementado a 0,5 mililitros por minuto. Antes da cristalização, concentre as frações de pico da separação do complexo até dois miligramas por mililitro utilizando um concentrador proteico por centrifugação com corte de peso molecular de 100 quilodaltons. Uma absorbância de duas UA a 280 nanômetros equivale a um miligrama por mililitro.

Adicione Fab adicional em uma proporção de um para 0,05 complexo por Fab livre. Adicione também 10 micromolar de citalopram livre S. Após centrifugar a amostra, colete o sobrenadante contendo o complexo Fab SERT e descarte o pellet.

Monte uma tela de poço de 24 poços em gota suspensa a quatro graus Celsius de acordo com a tabela um no protocolo do texto. Pipete 500 microlitros de cada solução reservatório em uma placa de 24 poços de perfil baixo com selante aplicado em cada poço. Pipete 1,5, 1,75 e dois microlitros do complexo SERT Fab sobre uma lamínula de vidro silanizada de 18 milímetros.

Em seguida, pipete um microlitro da solução reservatório sobre a amostra de proteína. Cristais individuais aparecerão em aproximadamente três dias e crescerão até 100 a 175 micrômetros após 14 dias. São mostrados aqui resultados representativos para triagem de termoestabilidade na presença de citalopram tritiado.

Os valores de temperatura de fusão plotados contra a ligação máxima mostram mutantes com alta termoestabilidade e expressão. São exibidas aqui as curvas de termoestabilidade para o SERT TC do tipo selvagem e os três melhores mutantes, Y110A, I291A e T439S. Esta imagem de microscopia mostra células HEK293S GnTI negativas expressando SERT CC com fluorescência verde presente na membrana celular.

A cromatografia de exclusão por tamanho com detecção de fluorescência do SERT CC mostra um pico principal em 15 mililitros. A análise por SDS-PAGE exibe uma única espécie proteica amplamente livre de contaminantes. É apresentada uma separação representativa de complexos de anticorpos transportadores por cromatografia de exclusão por tamanho.

O pico principal eluindo em 11,5 mililitros continha tanto SERT quanto Fab, conforme mostrado em um gel de SDS-PAGE. A microscopia de luz do complexo anticorpo-SERT ligado ao citalopram S após duas semanas de crescimento mostra cristais com formato prismático de aproximadamente 100 a 175 mícrons. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como identificar mutações que estabilizam uma proteína de membrana em uma conformação ligada a um ligante e de como montar triagens de cristalização com complexos proteína-anticorpo.

Ao tentar realizar este procedimento, é importante lembrar que ligantes são necessários para a estabilização do TC de SERT e essenciais para a cristalização do CC de SERT. As implicações desta técnica estendem-se ao tratamento de condições psiquiátricas, pois SERT é o alvo molecular de muitos medicamentos antidepressivos. Após este procedimento, a função de SERT purificada pode ser caracterizada utilizando métodos bioquímicos e biofísicos.