Termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano Bound to S -citalopram

O objetivo geral deste procedimento é gerar um transportador que seja suficientemente estável para estudos estruturais e usar esse transportador modificado para produzir cristais que defractam para alta resolução por cristalografia de raios-x. Este método pode responder a questões-chave no campo da biologia estrutural, como como resolver a estrutura das proteínas de membrana que são importantes alvos de drogas. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para selecionar uma conformação ligada a um medicamento usando um ensaio funcional.

Embora esse método possa fornecer informações sobre os transportadores de neurotransmissores, ele também pode ser aplicado a receptores, canais e proteínas solúveis, que se ligam a pequenas moléculas com alta afinidade. Ressuspenda completamente as células tripsonizadas HEK293S GnTI menos em DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal a uma densidade de 0,5 milhão de células por mililitro em um reservatório de pipeta descartável. Usando uma pipeta multicanal, adicione 100 microlitros de células a cada poço de uma placa revestida de poli-D-lisina.

Ressuspenda as células no reservatório da pipeta depois de encher cada placa para garantir uma distribuição uniforme das células. Incube as células na incubadora de 37 graus Celsius com 8% de dióxido de carbono. Substitua o meio celular uma hora antes da transvecção.

Preparar os complexos de reagentes de transvecção de ADN misturando 450 nanogramas de ADN com 45 microlitros de DMEM isento de soro para cada construção no fundo cert TC a ser analisado. Em seguida, adicione 1,6 microlitros do reagente de transvecção a 45 microlitros de DMEM sem soro e misture. Adicione imediatamente a solução reagente de transvecção diluída à solução de DNA e misture.

Não misture as soluções na ordem inversa. Aguarde de 10 a 15 minutos antes de adicionar 20 microlitros da mistura de DNA do reagente de transvecção a quatro dos poços. Incubar as células com 200 nanomolares de citalopram e 25 microlitros de TBS por cinco minutos em temperatura ambiente.

Para solubolizar as células, adicione 25 microlitros de oito milimolares C12M, um milimolar CHS e coquetel de inibidores de protease em TBS. Incube as células por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 50 microlitros de TBS com citalopram tritiado 20 nanomolares, 0,1% de albumina de soro bovino e miligramas por mililitro de seu ensaio de proximidade de cintilação de afinidade de etiqueta ou SPA Beads, a três poços para cada construção.

Para o último poço, adicione a mesma solução TBS, mas complemente com sertralina 100 micromolar para determinar a ligação não específica. Certifique-se de que as contas SPA de afinidade de sua etiqueta estejam bem misturadas ao adicioná-las à placa de 96 poços. Meça a ligação de citalopram tritiado usando um contador de cintilação de 96 poços à temperatura ambiente com um tempo de contagem de um minuto por poço.

Continue contando as placas até que a contagem total se estabilize em aproximadamente 36 horas. Após a medição, aqueça as placas por 15 minutos em um bloco de aquecimento com tampa aquecida a 33 graus Celsius. Meça novamente a ligação do citalopram tritiado após o aquecimento.

Repita essas etapas com modificação da etapa de aquecimento. Ajuste as temperaturas de aquecimento dependendo da temperatura de fusão aparente da proteína alvo e da termoestabilidade da construção mais estável. Continue a aquecer as placas até que todas as construções tenham contagens específicas baixas.

Cultive HEK293S células GnTI menos em suspensão a 37 graus Celsius com 8% de dióxido de carbono e 85% de umidade em um agitador a 130 RPM e 293 meios de expressão suplementados com 2% de soro bovino fetal. Infectar 10 litros de células com o vírus P2 com uma multiplicidade de infecção de dois e uma densidade de três milhões de células por mililitro. 12 a 16 horas após a infecção, adicione butirato de sódio a uma concentração de 10 milimolares a partir de um estoque molar.

48 a 60 horas após a infecção, colher as células por centrifugação a 4.000 vezes G por 15 minutos. Remova o sobrenadante. Ressuspenda as células em 150 mililitros de TBS com 2 micromolares de escitalopram ou outros inibidores de SERT.

as células de 10 litros de cultura em água morna a aproximadamente 30 graus Celsius e ressuspendê-las passando rapidamente as células por uma pipeta de 10 mililitros até ficarem homogêneas. Adicione todas as células a um copo com uma barra de agitação e adicione toda a solução de detergente às células, mexendo sempre. Solubilize as células a quatro graus Celsius por uma hora com agitação.

Gire o lisado a 8.000 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius. Transvase o sobrenadante para tubos de ultracentrífuga limpos e descarte o pellet. Em seguida, gire o sobrenadante a 100.000 vezes G por uma hora em uma ultracentrífuga.

Após a ultracentrifugação, filtrar o sobrenadante através de um filtro de 0,2 mícron e rejeitar o sedimento. Em seguida, passe o lisado por mais de 10 mililitros de resina de afinidade estreptocócica em uma coluna usando uma bomba perisáltica equilibrada em tampão de lavagem. Em seguida, conecte uma coluna de afinidade estreptocócica a um sistema rápido de cromatografia líquida de proteína e lave a coluna a dois mililitros por minuto com 66 mililitros de tampão de lavagem.

Eluir a proteína purificada no mesmo tampão de lavagem suplementado com cinco milimolares de destiobiotina a 0,5 mililitros por minuto usando 33 mililitros de tampão. Colete frações de um mililitro. As frações de pico serão de aproximadamente 10 mililitros.

Para formar os complexos de anticorpos transportadores, primeiro digerir a proteína purificada durante a noite à temperatura ambiente com trombina para remover as marcas e Endo H para desglicosilação. Concentre a proteína a uma concentração de 10 miligramas por mililitro e um volume de 250 a 300 microlitros usando um concentrador de proteína centrífuga de corte de peso molecular de 100 kilodaltons. Misture a proteína SERT concentrada com 8B6 Fab a uma proporção molar de um a 1,2 em um volume inferior a 500 microlitros.

Centrifugue a mistura a 100.000 vezes G e quatro graus Celsius por 20 minutos. Após centrifugação, recolher o sobrenadante que contém o complexo SERT Fab e rejeitar o sedimento. Separar o complexo por cromatografia líquida rápida de proteínas numa coluna de exclusão de tamanho.

Equilibre-o com TBS suplementado a 0,5 mililitros por minuto. Antes da cristalização, concentre as frações de pico da separação do complexo em dois miligramas por mililitro usando um concentrador de proteína centrífuga de corte de peso molecular de 100 kilodaltons. Uma absorbância de duas UA a 280 nanômetros é igual a um miligrama por mililitro.

Adicione Fab adicional em uma proporção de um para 0,05 complexo para liberar Fab. Adicione também 10 S citalopram livre de 10 micromolares. Depois de centrifugar a amostra, recolher o sobrenadante que contém o complexo SERT Fab e rejeitar o sedimento.

Configure uma tela suspensa de 24 poços a quatro graus Celsius de acordo com a tabela um do protocolo de texto. Pipete 500 microlitros de cada solução de reservatório em uma placa de baixo perfil de 24 poços com selante aplicado a cada poço. Pipete 1,5, 1,75 e dois microlitros do complexo SERT Fab em uma lamínula de vidro siliconizado de 18 milímetros.

Em seguida, pipetar um microlitro de solução reservatório sobre a amostra de proteína. Os cristais únicos aparecerão em aproximadamente três dias e crescerão para 100 a 175 micrômetros após 14 dias. Aqui são mostrados resultados representativos para a triagem de termoestabilidade na presença de citalopram tritiado.

Os valores da temperatura de fusão plotados em relação à ligação máxima mostram mutantes com alta termoestabilidade e expressão. Aqui estão as curvas de termoestabilidade para SERT TC do tipo selvagem e os três principais mutantes, Y110A, I291A e T439S. Esta imagem de microscopia mostra HEK293S células GnTI menos expressando SERT CC com fluorescência verde presente na membrana celular.

A cromatografia de exclusão de tamanho de detecção de fluorescência de SERT CC mostra um pico importante em 15 mililitros. A análise por SDS-PAGE exibe uma única espécie de proteína amplamente livre de contaminantes. A separação representativa de complexos de anticorpos transportadores por cromatografia de exclusão de tamanho é mostrada.

O pico principal de 11,5 mililitros continha SERT e Fab, conforme mostrado em um gel SDS-PAGE. A microscopia óptica do complexo de anticorpos SERT ligado ao citalopram S após duas semanas de crescimento mostra cristais em forma de prisma de aproximadamente 100 a 175 mícrons. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar mutações que estabilizam uma proteína de membrana em uma confirmação ligada ao ligante e como configurar telas de cristalização com complexos de anticorpos proteicos.

Ao tentar fazer este procedimento, é importante lembrar que os ligantes são necessários para a estabilização do SERT TC e são essenciais para a cristalização do SERT CC. As implicações desta técnica se estendem à terapia de condições psiquiátricas porque o SERT é o alvo molecular de muitas drogas antidepressivas. Após este procedimento, a função do SERT purificado pode ser caracterizada usando métodos bioquímicos e biofísicos.