Name: A partir de construções de Cristais - Rumo a determinação da estrutura de β-barril exterior Proteínas de Membrana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Aprenda a produzir proteínas de membrana externa β-barril em quantidades suficientes para cristalização e estudos estruturais. Este método robusto facilita a determinação da estrutura por cristalografia de raios X.

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Gostaríamos de agradecer a Herve Celia, do CNRS, por fornecer as imagens UV, e a Chris Dettmar e Garth Simpson, do Departamento de Química da Universidade de Purdue, por fornecerem as imagens do SONICC. Gostaríamos de agradecer o financiamento do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais e do Programa de Pesquisa Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde. Além disso, gostaríamos de agradecer o financiamento adicional do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (AMS e CJ), Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NN 1K22AI113078-01) e do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade de Purdue (NN).

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<li>Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TonB-dependent+transporters%3A+regulation%2C+structure%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Micro%22%5BJournal%5D)">TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function.</a> Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).</li>
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<li>Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+V+secretion%3A+mechanism%28s%29+of+autotransport+through+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Phil+Trans+of+the+Royal+Soc+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane.</a> Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).</li>
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<li>Haupert, L. M., Simpson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+protein+crystallization+trials+by+second+order+nonlinear+optical+imaging+of+chiral+crystals+%28SONICC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC).</a> Methods. 55, 379-386 (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

β-barrel OMPs servir papéis essenciais em bactérias Gram-negativas, mitocôndrias e cloroplastos e são alvos importantes para a análise estrutural que oferecem uma riqueza de informações sobre mecanismos moleculares essenciais nas membranas externas desses respectivos organelas. No entanto, a produção de amostra suficiente para análise estrutural nem sempre é fácil e, portanto, um gasoduto geral é apresentado para a produção de quantidades suficientes de alvo OMPs β-barril para determinação da estrutura, explicando em de...

β-barrel OMPs só pode ser encontrada nas membranas exteriores das mitocôndrias, cloroplastos, e bactérias Gram-negativas 1-3. Enquanto que servem funções semelhantes às proteínas a-helicoidal, que tem uma dobra muito diferente que consiste de um domínio β-barril incorporado na membrana central que varia de 8-26 p-cadeias anti-paralelas com cada filamento sendo intimamente ligados aos dois fios vizinhos (Figuras 1 e 2). Os primeiros e os últimos fios de domínio β-barril então interagir um com o outro, quase exclusivamente de uma forma anti-paralela (excepto para VDAC mitocondrial), para fechar e selar o domínio β-barril a partir da membrana circundante. Todas as OMPs β de barril tem ansas extracelulares de variação de sequência e comprimento, que desempenham um papel importante nas interacções de ligandos e / ou contactos proteína-proteína, com estas laçadas por vezes ser tão grande como 75 resíduos, tais como os encontrados em Neisseria transferrina ligação protein A (TbpA) 4. β-barrel OMPs também pode ter extensões periplásmicas N-terminais ou C-terminais que servem como domínios adicionais para a finalidade funcional da proteína (por exemplo, 5-7 bama, FimD 8,9, fadl 10). Embora muitos tipos de OMPs β-barril existem 11, dois dos tipos mais comuns são descritas abaixo como exemplos para os menos familiarizados com o campo, (1) os transportadores dependentes de TonB e (2) autotransportadores. Transportadores TonB-dependentes (por exemplo, FepA, TbpA, BtuB, Cir, etc.) são essenciais para a importação de nutrientes e contêm um domínio plugue N-terminal que consiste em aproximadamente 150 resíduos que é encontrado escondido dentro de um C-terminal 22 de cadeia β- domínio barril incorporado na membrana externa 12 (Figura 3). Embora este domínio previne tampão substrato de passar livremente através do domínio de barril, a ligação do substrato induz uma mudança conformacional dentro do domínio bujão them leva a poro formação (quer por rearranjo de tampão ou por ejecção parcial / total do tampão), o que pode, em seguida, facilitar o transporte do substrato através da membrana externa para o periplasma. Transportadores dependentes de Tonb são especialmente importantes para a sobrevivência de algumas estirpes patogénicas de bactérias Gram-negativas, tais como Neisseria meningitidis que evoluíram transportadoras especializadas que roubam nutrientes como o ferro diretamente de proteínas do hospedeiro humanos 4,13,14. Autotransportadores pertencem ao sistema de secreção V tipo de bactéria Gram-negativas e são OMPs beta-barril, que consistem em um domínio β-barrel (normalmente 12-costas como com ESTA e ESPP) e um domínio de passageiros que é ou secretados ou apresentados no superfície da célula 15,16 (Figura 3). Estes OMPs β-barril muitas vezes servem um papel importante na sobrevivência celular e virulência com o domínio de passageiros que serve tanto como uma protease, adesina, e / ou outro EFfector que medeia a patogénese. métodos estruturais, tais como cristalografia de raios-X, espectroscopia de RMN, e microscopia eletrônica (EM) nos permitem determinar modelos para as OMPs com resolução atômica, que por sua vez podem ser usadas para decifrar exatamente como eles funcionam dentro da membrana externa. Esta informação valiosa pode então ser usado para drogas e desenvolvimento de vacinas, se aplicável. Por exemplo, a ligação à transferrina de proteína A (TbpA) é encontrado na superfície de Neisseria e é necessária para a patogénese porque se liga directamente a transferrina humana e, em seguida, extrai e importa o ferro para a sua sobrevivência. Sem TbpA, Neisseria não podem eliminar o ferro do hospedeiro humano e são tornados não-patogênico. Depois de a estrutura cristalina da transferrina humano ligado a TbpA 4 foi resolvido, tornou-se muito mais clara a forma como as duas proteínas associadas, que as regiões de TbpA mediada a interacção, o que os resíduos são importantes para a extracção do ferro por TbpA, ecomo se pode desenvolver agentes terapêuticos contra Neisseria segmentação TbpA. Portanto, dada a importância de OMPs β-barril em bactérias Gram-negativas para a sobrevivência e patogénese, bem como nas mitocôndrias e função do cloroplasto, e a necessidade de informação estrutural adicional sobre esta classe única de proteínas de membrana e os sistemas nos quais eles funcionam , protocolos gerais são apresentados com o objetivo geral de expressar e purificar OMPs alvo em níveis elevados para a caracterização por métodos estruturais.

<table><tbody><tr><td>Robô de cristalização</td><td>TTP Labtech, Art Robbins-Any</td><td></td> <td>deve funcionar aqui, exceto para</td></tr><tr><td>termociclador de PCR</td> de cristalização LCP <td>Eppendorf,</td> <td>BioRad-Media</td><td></td></tr> <tr><td>Shaker</td><td>New Brunswick, espectrômetro Infors HT-UV-vis</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Eppendorf-SDS-PAGE</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>aparelho</td><td>BioRad</td><td>1645050, 1658005</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE e géis nativos</td><td>BioRad, Life Technologies</td><td>4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)</td><td></td></tr><tr><td>AkTA Prime</td><td>GE</td> <td>Healthcare-AkTA</td><td></td></tr> <tr><td>Purifier</td><td>GE</td> <td>Healthcare-Microcentrifuge</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Eppendorf-Centrifuge</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(velocidade baixa-média)</td><td>Beckman-Coulter-Ultracentrifuge</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(alta velocidade)</td> <td>Rotor Beckman-Coulter-SS34</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Rotor Sorvall-Type</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>45 Ti</td><td>Rotor Beckman-Coulter-Type</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>70 Ti</td> Homogeneizador <td>Beckman-Coulter-Dounce</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>06 435C</td><td></td></tr><tr><td>Emulsiflex</td><td>Avestin-Tubo</td><td></td> de <td></td></tr><tr><td>diálise</td><td>Ferramentas Sigma</td><td>D9652</td><td></td></tr><tr><td>LCP Hamilton</td><td>, TTP Labtech-VDX</td> Placas <td>de</td><td></td></tr> <tr><td>24 poços</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>Placas sanduíche</td><td>Hampton Research, Dimensões Moleculares</td><td>HR3-151, MD11-50 (MD11-53)</td><td></td></tr><tr><td>Folhas de cristalização Grace</td><td>Bio-Labs</td><td>875238</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep S300 HR coluna</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1167-01</td><td></td></tr><tr><td>coluna Q-Sepharose</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td></td></tr><tr><td>Peneiras de cristalização</td><td>Hampton Research, Qiagen, Dimensões</td> moleculares-Seringa <td></td><td></td></tr><tr><td>à prova de gás (100 ml)</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a partir de construções de cristais - rumo a determinação da estrutura de β-barril exterior proteínas de membrana

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

As proteínas de membrana desempenham funções importantes nas células, como transporte de nutrientes, motilidade, sinalização, sobrevivência e virulência, mas constituem apenas ~ 1% por cento das estruturas conhecidas. Existem dois tipos de proteínas de membrana, α-helicoidal e β-barril. Enquanto as proteínas de membrana α-helicoidal podem ser encontradas em quase todas as membranas celulares, as proteínas de membrana de β barril só podem ser encontradas nas membranas externas das mitocôndrias, cloroplastos e bactérias Gram-negativas. Um gargalo comum em estudos estruturais de proteínas de membrana em geral é obter amostra pura suficiente para análise. Na esperança de ajudar os interessados em resolver a estrutura de sua proteína de membrana externa (OMP) de β barril favorita, são apresentados protocolos gerais para a produção de OMPs alvo de β barril em níveis úteis para determinação da estrutura por cristalografia de raios-X e / ou espectroscopia de RMN. Aqui, delineamos o design de construção para expressão nativa e para expressão em corpos de inclusão, purificação usando uma etiqueta de afinidade e cristalização usando técnicas de triagem de detergente, bicelle e fase cúbica lipídica. Esses protocolos foram testados e funcionam para a maioria dos OMPs de bactérias Gram-negativas; No entanto, existem alguns alvos, particularmente para mitocôndrias e cloroplastos que podem exigir outros métodos de expressão e purificação. Como tal, os métodos aqui devem ser aplicáveis para a maioria dos projetos que envolvem OMPs de bactérias Gram-negativas, mas os níveis de expressão e a quantidade de amostra purificada variam dependendo do OMP alvo.

Yiur é um transportador de ferro dependente TonB que é um alvo da vacina putativa contra Yersinia pestis. Ele foi originalmente identificados utilizando um ensaio de microarray. Aqui, as medidas que foram tomadas para determinar a estrutura de yiur utilizando cristalografia de raios-X são descritas (Figura 9). Para a clonagem, a sequência de ADN de yiur (menos a sequência de sinal N-terminal) foi amplificado por PCR a partir de ADN genómico e sub-clonado num vec...

β proteínas da membrana externa (OMPs) servem a muitas funções dentro das membranas externas de bactérias Gram-negativas, mitocôndrias e cloroplastos. Aqui, esperamos aliviar um gargalo conhecido em estudos estruturais, apresentando protocolos para a produção de OMPs de β barril em quantidades suficientes para determinação de estrutura por cristalografia de raios-X ou espectroscopia de RMN.

A partir de construções de Cristais - Rumo a determinação da estrutura de β-barril exterior Proteínas de Membrana

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

O objetivo geral deste método é obter quantidades na ordem de miligramas de proteínas de membrana externa do tipo beta-barrel que cristalizem e difratem. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de dobramento e transporte de proteínas de membrana, como, por exemplo, como as proteínas beta-barrel são inseridas nas membranas celulares. A principal vantagem desta técnica é que ela é robusta para proteínas beta-barrel.De modo geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois a escolha de detergentes para purificação, cristalização e fracionamento é desafiadora. Jeremy Guerin, um pós-doutorando do laboratório de Susan Buchanan, demonstrará o procedimento, além de mim e colegas do laboratório. Inicie este procedimento pela construção de um vetor de expressão T7 contendo o gene do alvo da proteína de membrana externa com os códons otimizados, ou gene OMP, para expressão in vivo na membrana conforme descrito no protocolo textual.Transforme o construto em uma linhagem bacteriana de expressão para expressão pipetando um microlitro de plasmídeo em 50 microlitros de células quimicamente competentes BL21(DE3) e misture suavemente pipetando para cima e para baixo. Incube no gelo por 30 minutos. Após a incubação, aplique um pulso de calor a 42 graus Celsius por 30 segundos utilizando um banho-maria e, em seguida, retorne ao gelo por um minuto.Adicione um mililitro de meio SOC pré-aquecido e agite a 37 graus Celsius por uma hora a 1000 RPM usando um incubador com agitador de bancada. Após a incubação, plaque 100 microlitros de células em placas de ágar LB contendo um antibiótico apropriado e incube durante a noite a 37 graus Celsius, invertidas. Em seguida, realize testes de expressão em pequena escala inoculando cinco mililitros de LB contendo antibiótico com uma única colônia.Repita o procedimento para cinco a 10 colônias. Incube a 37 graus Celsius com agitação até atingir uma densidade óptica a 600 nanômetros de aproximadamente zero vírgula seis. Induza a expressão da OMP alvo adicionando cinco microlitros de IPTG um molar a cada tubo de cultura e permita o crescimento adicional de uma a duas horas.Para comparar os níveis de expressão de todas as colônias, centrifugue um mililitro de cada cultura por um minuto a 15.000 ×g, utilizando uma microcentrífuga. Remova o sobrenadante e ressuspender as células em 200 microlitros de tampão de carga 1X para SDS-PAGE. Incube a 100 °C por cinco minutos e, em seguida, centrifugue novamente a 15.000 ×g por cinco minutos.Analisar as amostras utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio pipetando 20 microlitros em cada poço de um gel a dez por cento. Executar o gel por 35 minutos a 200 volts constantes. Por fim, colher as células por centrifugação a 6000 vezes G durante dez minutos.Resuspenda as células no tampão de lise numa proporção de cinco mililitros por grama de pasta celular. Lise as células utilizando uma prensa de French ou um homogeneizador celular. Em seguida, centrifugue as células lisadas a 15.000 ×g durante 30 minutos a quatro graus Celsius para remover células não lisadas e debris celulares.Transfira o sobrenatante para um tubo limpo e centrifugue novamente em alta velocidade por uma hora a quatro graus Celsius. O pellet resultante é a fração de membrana que contém a proteína de interesse. Utilizando um homogeneizador de Dounce, re-suspenda a fração de membrana.Primeiro, transfira as membranas e então adicione o tampão de solubilização na concentração 2X sem detergente. Despeje as membranas re-suspendidas em um cilindro graduado e adicione água até atingir uma concentração final de tampão de solubilização 1X. Transfira a amostra para um béquer e adicione o detergente lentamente até uma concentração final de aproximadamente 10 vezes a concentração micelar crítica.Em seguida, agite por 0,5 a 16 horas a quatro graus Celsius, dependendo da facilidade com que a proteína-alvo é extraída das membranas. Por fim, centrifugue a amostra solubilizada a 300.000 ×g por uma hora a quatro graus Celsius. Prepare uma coluna IMAC de um a cinco mililitros ou use uma coluna pré-embalada.Realize as etapas subsequentes de cromatografia a quatro graus Celsius. Lave com água para remover quaisquer traços de conservantes. Se estiver usando um sistema automatizado de purificação, instale a coluna de acordo com as instruções do fabricante.Prepare 500 mililitros do tampão A de IMAC sem imidazol e 250 mililitros do tampão B de IMAC com imidazol a um molar. Equilibre a coluna de IMAC utilizando 10 volumes de coluna do tampão A de IMAC. Adicione imidazol à amostra proteica até uma concentração final de 25 milimolar e misture. Em seguida, aplique a amostra na coluna de IMAC equilibrada a uma taxa de dois mililitros por minuto.Colete o fluxo passante. Em seguida, lave a coluna IMAC com cinco volumes de coluna de concentrações crescentes de imidazol, utilizando o tampão B. Colete as lavagens em frações de dois mililitros. Elua a amostra com uma concentração final de 250 milimolar por cinco volumes de coluna e colete a amostra eluída em frações de dois mililitros.Analisar o fluxo inicial, as frações de lavagem e as frações de eluição utilizando análise por SDS-PAGE com base na absorbância a 280 nanômetros. Agrupar as frações contendo a OMP de barril beta-alvo, conforme verificado por análise de SDS-PAGE. Em seguida, remover a marcação de 6X histidina adicionando a protease TEV à amostra agrupada e incubando durante a noite a quatro graus Celsius com agitação suave.Carregue novamente a solução da protease da amostra em uma coluna de CIM para separar a OMP beta-barrel alvo das marcas clivadas e qualquer amostra não clivada. O fluxo que passa pela coluna conterá a amostra clivada, sem a marca. Para preparar a cristalização, carregue a amostra em uma coluna de filtração em gel em um tampão contendo o detergente que será usado para cristalização.Colete frações de um mililitro e analise utilizando eletroforese SDS-PAGE com base na absorbância a 280 nanômetros. Reúna as frações que contêm a proteína alvo e, em seguida, concentre até aproximadamente 10 miligramas por mililitro. Antes de preparar as amostras, monte o equipamento para gel.Utilize tamp&atilde;o de corrida para gel pr&eacute;-resfriado ou realize a eletroforese no gel na câmara fria. Filtre a amostra utilizando um filtro centr&iacute;fugo de 0,22 m&iacute;cron para remover part&iacute;culas e precipita&ccedil;&atilde;o. Em seguida, pipete 0,25 microlitros da amostra em dois tubos microcentr&iacute;fugos de 1,5 mililitro.Rotule um como "fervido" e o outro como "RT". Em seguida, adicione 9,75 microlitros do tampão amostra a cada tubo e homogeneíze por pipetagem. A ambas as amostras, adicione também 10 microlitros do tampão de carga 2X SDS e misture suavemente por pipetagem. Incube a amostra "fervida" a 95 graus Celsius por cinco minutos, mantendo a amostra "RT" à temperatura ambiente.Em seguida, centrifugue brevemente a amostra fervida. Depois, carregue 20 microlitros de ambas as amostras no gel nativo pré-montado. Após rodar o gel por 60 minutos a 150 volts constantes, remova o gel e mergulhe na solução de coloração para visualizar os resultados.Prossiga com os ensaios de cristalização em detergente, bicélulas e fase cúbica lipídica, utilizando os métodos publicados anteriormente na Jove. As cabeças de cristalização são visualizadas em um microscópio de UV para verificar se os cristais são, de fato, proteína e não cristais de lipídio ou detergente. Os cristais promissores são analisados usando uma fonte própria ou em sincrotrão para verificar se os cristais difratam.Após a coleta de dados de cristais que difratam bem, processe os dados utilizando um software de processamento, como o HKL2000. Transfira os arquivos resultantes para uma suíte de software para determinação de estrutura, como o Phoenix Suit, e realize a substituição molecular para a fase inicial e determinação da estrutura. A estrutura cristalina de YIUR foi determinada em uma resolução de 2,6 Å utilizando este método.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas semanas, se for executada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como expressar e purificar proteínas da membrana externa bacteriana para estudos estruturais.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

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Cristalizando Proteínas de Membrana para determinação da estrutura usando mesofases lipídico

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Concepção de fármacos com base Estrutura desempenha um papel importante no desenvolvimento de medicamentos. Prosseguindo alvos múltiplos em paralelo aumenta a chance de sucesso para a descoberta de chumbo. O seguinte artigo destaca como o Seattle Center Structural Genomics para Doenças Infecciosas utiliza uma abordagem multi-alvo para determinação da influenza A subunidade PB2 gene-to-estrutura.

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Descrevemos uma estrutura que incorpora análise bioquímica e computacional direta para orientar a caracterização e cristalização de grandes domínios de bobina enrolada. Essa estrutura pode ser adaptada para proteínas globulares ou estendida para incorporar uma variedade de técnicas de alto rendimento.

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Combinando a cristalografia de raios x com espalhamento de raios-x de pequeno ângulo para modelar regiões não-estruturadas de Nsa1 de S. Cerevisiae

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Cristalografia de Raios-X para Estudar a Transição do Estado Oligomérico da Termotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

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Preparação da amostra usando um método de monocamadas lipídica para estudos cristalográficos eletrônicos

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Cristalização ABCG5/G8 em Ambiente Bitela Lipídica para Cristalografia de Raios-X

Aprenda a produzir proteínas de membrana externa β-barril em quantidades suficientes para cristalização e estudos estruturais. Este método robusto facilita a determinação da estrutura por cristalografia de raios X.

A partir de construções de Cristais - Rumo a determinação da estrutura de β-barril exterior Proteínas de Membrana

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