A partir de construções de Cristais - Rumo a determinação da estrutura de β-barril exterior Proteínas de Membrana

O objetivo geral deste método é obter quantidades de miligramas de proteínas do barril beta da membrana externa que cristalizarão e desfractarão. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de dobramento e transporte de proteínas de membrana, como a forma como as proteínas do barril beta são inseridas nas membranas celulares. A principal vantagem dessa técnica é que ela é robusta para proteínas de barril beta.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades, porque a escolha de detergentes para purificação, cristalização e defração é um desafio. Jeremy Guerin, um pós-doutorado do laboratório de Susan Buchanan, demonstrará o procedimento, além de mim e de meus colegas no laboratório. Comece este procedimento com a construção de um vetor de expressão T7 contendo a proteína de membrana externa alvo otimizada para códons, ou gene OMP, para expressão in vivo na membrana, conforme descrito no protocolo de texto.

Transforme a construção em uma cepa de expressão de bactérias para expressão, pipetando um microlitro de plasmídeo em 50 microlitros de células BL21 (DE3) quimicamente competentes e misture suavemente pipetando para cima e para baixo. Incube no gelo por 30 minutos. Após a incubação, pulse o calor a 42 graus Celsius por 30 segundos usando um banho-maria e, em seguida, coloque de volta no gelo por um minuto.

Adicione um mililitro de meio SOC pré-aquecido e agite a 37 graus Celsius por uma hora a 1000 RPM usando uma incubadora agitadora de bancada. Após a incubação, coloque 100 microlitros de células em placas de ágar LB contendo um antibiótico apropriado e incube durante a noite a 37 graus Celsius, invertido. Em seguida, realize testes de expressão em pequena escala inoculando cinco mililitros de LB contendo cultura de antibiótico com uma única colônia.

Repita para cinco a 10 colônias. Crescem a 37 graus Celsius com agitação para uma densidade óptica de 600 nanômetros de aproximadamente zero vírgula seis. Induza a expressão do OMP alvo adicionando cinco microlitros de um IPTG molar a cada tubo de cultura e deixe crescer mais uma a duas horas.

Para comparar os níveis de expressão de todas as colónias, centrifugar um mililitro de cada cultura durante um minuto a 15 000 vezes G, utilizando uma microcentrífuga. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 200 microlitros de tampão de carregamento 1X SDS-PAGE. Aquecer a 100 graus Celsius durante cinco minutos e depois centrifugar novamente a 15 000 vezes G durante cinco minutos.

Analise as amostras usando SDS-PAGE pipetando 20 microlitros em cada poço de um gel de dez por cento. Execute o gel por 35 minutos a 200 volts constantes. Por fim, colha as células por centrifugação a 6000 vezes G por dez minutos.

Ressuspenda as células no tampão de lise na proporção de cinco mililitros por grama de pasta celular. Lise as células usando uma prensa francesa ou homogeneizador de células. Em seguida, gire as células lisadas a 15.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius para remover células não lisadas e detritos celulares.

Transferir o sobrenadante para um tubo limpo e centrifugar novamente a alta velocidade durante uma hora a quatro graus Celsius. O pellet resultante é a fração de membrana que contém a proteína de interesse. Usando um homogeneizador Dounce, ressuspenda a fração de membrana.

Primeiro, transfira as membranas e, em seguida, adicione tampão de solubilização na concentração 2X sem detergente. Despeje as membranas ressuspensas em um cilindro graduado e adicione água até que uma concentração final de 1X tampão de solubilização seja atingida. Transferir a amostra para um copo e adicionar detergente lentamente até uma concentração final de cerca de 10 vezes a concentração micelar crítica.

Em seguida, mexa por 0,5 a 16 horas a quatro graus Celsius, dependendo da facilidade com que a proteína-alvo é extraída das membranas. Finalmente, centrifugue a amostra solubilizada a 300.000 vezes G por uma hora a quatro graus Celsius. Prepare uma coluna IMAC de um a cinco mililitros ou use uma coluna pré-embalada.

Execute as etapas de cromatografia subsequentes a quatro graus Celsius. Lave com água para remover quaisquer vestígios de conservantes. Se estiver usando um sistema de purificação automatizado, instale a coluna de acordo com as instruções do fabricante.

Prepare 500 mililitros de tampão IMAC A sem imidizol e 250 mililitros de tampão IMAC B com imididolol molar. Equilibre a coluna IMAC usando 10 volumes de coluna de tampão IMAC A. Adicione imidizol à amostra de proteína até uma concentração final de 25 milimolares e misture. Em seguida, carregue a amostra na coluna IMAC equilibrada a dois mililitros por minuto.

Colete o fluxo. Em seguida, lave a coluna IMAC com cinco volumes de coluna cada um com concentrações crescentes de imidizol, usando tampão B. Colete as lavagens em frações de dois mililitros. Eluir a amostra com uma concentração final de 250 milimolares para cinco volumes de coluna e recolher a amostra eluída em fracções de dois mililitros.

Analise o escoamento, as frações de lavagem e as frações de eluição usando a análise SDS-PAGE com base em sua absorbância a 280 nanômetros. Agrupar as fracções que contêm o OMP alvo do barril beta, tal como verificado pela análise SDS-PAGE. Em seguida, remova a etiqueta de histadina 6X adicionando protease TEV à amostra combinada e incubando durante a noite a quatro graus Celsius com um balanço suave.

Carregue a solução de protease de amostra em uma coluna IMAC novamente para separar o OMP de barril beta alvo das marcas clivadas e de qualquer amostra não clivada. O fluxo conterá a amostra clivada sem a marca. Para se preparar para a cristalização, carregue a amostra em uma coluna de filtração de gel em um tampão contendo o detergente a ser usado para cristalização.

Colete frações de um mililitro e analise usando a análise SDS-PAGE com base em sua absorbância a 280 nanômetros. Agrupe as frações que contêm a proteína alvo e, em seguida, concentre-se em aproximadamente 10 miligramas por mililitro. Antes de preparar as amostras, monte o aparelho de gel.

Use um tampão de gel pré-resfriado ou passe o gel na câmara fria. Filtre a amostra usando um filtro centrífugo de 0,22 mícron para remover partículas e precipitação. Em seguida, pipete 0,25 microlitros da amostra em dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Rotule um como fervido "e o outro como RT"Em seguida, adicione 9,75 microlitros do tampão de amostra a cada tubo e misture por pipetagem. Para ambas as amostras, adicione também 10 microlitros de tampão de carga 2X SDS e misture suavemente pipetando. Ferva a amostra fervida a 95 graus Celsius por cinco minutos, deixando a amostra RT à temperatura ambiente.

Em seguida, gire a amostra fervida brevemente. Em seguida, carregue 20 microlitros de ambas as amostras no gel nativo pré-montado. Depois de passar o gel por 60 minutos a 150 volts constantes, remova o gel e mergulhe em solução de coloração para visualizar os resultados.

Prossiga com os testes de cristalização em detergente, bi-células e fase cúbica lipídica, usando métodos de Jove publicados anteriormente. As cabeças de cristalização são visualizadas sob um microscópio UV para verificar se os cristais são, de fato, proteínas e não dissolvidos, lipídios ou detergentes. Os cristais de chumbo são rastreados usando uma fonte doméstica ou no síncrotron para ver se os cristais se defractam.

Após a coleta de dados de cristais que desfractam bem, processe os dados usando um software de processamento, como o HKL2000. Transfira os arquivos resultantes para um pacote de software para determinação de estrutura, como Phoenix Suit, e execute a substituição molecular para fase inicial e determinação de estrutura. A estrutura cristalina do YIUR foi determinada com resolução de 2,6 Angstrom usando este método.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas semanas, se for executada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como expressar e purificar proteínas bacterianas da membrana externa para estudos estruturais.