Cristalizando Proteínas de Membrana para determinação da estrutura usando mesofases lipídico

Olá e bem-vindo ao Grupo de Biologia Estrutural e Funcional da Membrana. Meu nome é Martin Caffery. O foco de nossa pesquisa é a membrana biológica, cujo esquema é mostrado no primeiro slide, a membrana que envolve a célula e as organelas subcelulares quando presentes é uma estrutura molecularmente fina, com apenas duas moléculas lipídicas de diâmetro e cravejadas de proteínas.

Estamos interessados na estrutura e funções aplicadas a lipídios e proteínas. No entanto, para os propósitos desta série JO, limitarei meu foco às proteínas de membrana. Procuramos entender como essas proteínas de membrana funcionam em nível molecular por dois motivos.

Em primeiro lugar, há a satisfação intelectual em saber como algo funciona. Em segundo lugar, sabendo como funciona, assim como sua bicicleta ou carro, existe a perspectiva de consertá-lo em caso de mau funcionamento. O design de medicamentos é um resultado óbvio desse tipo de trabalho.

A abordagem que adotamos para descobrir como uma proteína de membrana funciona em nível molecular é determinar sua estrutura cristalográfica. Isso envolve estabelecer a localização no espaço tridimensional de todos os átomos, ou pelo menos de todos os átomos não hidrogênio que compõem a proteína. O método que usamos para esse fim é chamado de cristalografia de raios-X macromolecular MX para abreviar.

Aqui vemos um exemplo de uma proteína de membrana cuja estrutura foi determinada usando MX em um cristal de qualidade fracionária da proteína é necessário para fazer mx. Como você pode imaginar, há muitas etapas envolvidas na determinação estruturada usando cristalografia macromolecular, conforme ilustrado. Aqui. Normalmente, isso inclui a identificação de um alvo de proteína de membrana e, em seguida, a produção, purificação e cristalização.

As medições de difração são realizadas no cristal usando uma fonte de raios X doméstica ou síncrotron. Os dados de difração são processados, produzindo um mapa de densidade eletrônica, que é então equipado com um modelo molecular. O modelo, quando refinado, pode ser usado para explorar o mecanismo de ação da proteína e para o design de medicamentos baseado em estrutura.

O foco deste artigo é mostrar como produzimos cristais de qualidade fracionária de proteínas de membrana usando mesofases lipídicas pelo chamado método meso. Uma revisão recente do método e seu escopo está disponível na referência um. O protocolo passo a passo que seguiremos aqui é descrito em referência a um fluxograma resumindo as etapas envolvidas e o tempo necessário para a configuração de um teste de cristalização de proteína de mesomembrana final é mostrado aqui.

Este vídeo cobre os degraus delimitados por linhas vermelhas tracejadas. Os itens que você precisará fazer na mesocristalização no modo manual são mostrados aqui. Eles incluem uma solução concentrada do lipídio da proteína de membrana purificada para criar o mease hospedeiro, geralmente mono ole para tornar o lipídio mais óbvio.

Neste vídeo, ele foi dopado com soluções precipitantes de corante vermelho, dispositivos de acariciar cachimbos de água purificados e pontas descartáveis e uma variedade de seringas Hamilton estanques, algumas com agulhas removíveis, um acoplador de furo estreito usado para misturar a solução de proteína com o lipídio para produzir a mease. Um dispensador de repetição de lâminas de microscópio de vidro Hamilton e lamínulas. Fita espaçadora de dupla face perfurada idealmente siloizada para pinças de criação de poços, tecidos de gelo lascados, uma calculadora e, o mais importante de tudo, seu caderno de laboratório.

O procedimento a seguir é usado para preparar uma placa de cristalização sanduíche de vidro. Para carregar, coloque uma lâmina de microscópio siloizada na bancada. Remova a tampa protetora de papel de uma superfície de uma tira de fita espaçadora perfurada de dupla face.

Coloque a fita com o lado adesivo voltado para baixo em contato com a superfície da pressão da corrediça. Sele a fita na lâmina. Usando um brayer ou rolo, uma folha de alumínio pode ser colocada entre a fita e o rolo para proteger a base dos poços.

Remova a segunda tampa de papel da fita para expor sua superfície adesiva superior. Este procedimento gera uma placa de vidro que está pronta para carregamento e posterior teto assim que o carregamento estiver completo. Lamínulas individuais siloizadas próximas à placa para um teto rápido e eficiente de poços.

Coloque o lipídio em um bloco com temperatura controlada a 45 graus Celsius por três minutos para torná-lo derretido. Observe que o lipídio usado é tipicamente monoterra. Neste vídeo, o lipídio tem um corante vermelho adicionado para visibilidade enquanto o lipídio está derretendo.

Prepare duas seringas Hamilton de 100 microlitros à prova de gás para uso Na etapa de mistura de proteínas lipídicas, remova o óleo de pele de Teflon da seringa que conterá a solução de proteína. Coloque a seringa que irá segurar o lipídio ao lado dela. Nesse caso, o fal é deixado no lugar.

Coloque o acoplador de orifício estreito entre as duas seringas e, em seguida, conecte o acoplador ao dedo da seringa lipídica. Aperte o acoplador na seringa, mas não aperte demais. Remova o êmbolo do cilindro da seringa lipídica.

Certifique-se de que o lipídio esteja derretido. Defina a pipeta para 30 microlitros e absorva lentamente 30 microlitros de capa lipídica derretida. O frasco lipídico.

O lipídio deve ser armazenado sob nitrogênio ou argônio a menos 80 graus Celsius. Lentamente, entregue o máximo possível do lipídio fundido na extremidade aberta da seringa. Tomando cuidado para não introduzir espaços de ar.

Coloque o êmbolo no cilindro em contato com o leopardo derretido e avance lentamente o êmbolo pelo cilindro com a seringa segurada verticalmente. Como mostrado, a bolha de ar presa inadvertidamente sobe no processo e é liberada. Agora temos um tampão de lipídio fundido no barril cujo volume você deve determinar com precisão.

Isso pode ser feito lendo as marcações no corpo da seringa. Nesse caso, o volume é de 23 microlitros, que é registrado no caderno do laboratório. Deslize o pêlo na agulha que se estende do acoplador.

Use o êmbolo para forçar o lipídio fundido para cima do cilindro e lenta e suavemente para dentro da agulha no núcleo do acoplador. Se a agulha estiver ligeiramente cheia demais, o lipídio será visto batendo em sua extremidade aberta. Ao apoiar ligeiramente o êmbolo, o excesso de lipídio pode ser retirado para o acoplador até que esteja nivelado com a ponta da agulha do acoplador.

Neste caso, a unidade acopladora da seringa está totalmente carregada e pronta para ser combinada com a seringa de proteína. A solução deve ser girada a 14.000 G por 10 minutos, cinco a 10 minutos a quatro graus Celsius para remover grandes agregados. Antes de estabelecer testes de cristalização, retire a solução de proteína do balde de gelo e equilibre-a à temperatura ambiente.

Calcule o volume de proteína, então solução a ser usada para formar a fase cúbica na hidratação total ou perto dela para oleano a 20 graus Celsius. A hidratação total com água ocorre em cerca de 40% em peso de água, como no diagrama de fases. Lembre-se de que carregamos a seringa lipídica com 23 de mono a uma densidade de 0,94 miligramas por microlitro.

Isso corresponde a 21,6 miligramas de lipídio, portanto, 21,6 vezes quatro dividido por seis ou 14,4 miligramas ou 14,4 microlitros de solução de proteína são necessários com uma seringa Hamilton de 25 ou 50 microlitros para pegar o volume necessário de solução de proteína, transferir a solução para a ponta de Teflon do êmbolo no barril da solução de proteína. Tomando cuidado para evitar bolhas de ar, retire cuidadosamente a agulha e meça o volume da solução proteica na seringa. Ele deve corresponder ao valor entregue na etapa anterior.

Em preparação para combinar com a seringa carregada de lipídios. Com cuidado, coloque a solução de proteína no barril para ficar nivelada com a extremidade aberta. Isso pode ser observado olhando para baixo através da extremidade de terminação do cano.

A solução de proteína lipina e as seringas carregadas estão agora prontas para serem combinadas em preparação para o Mex fazer isso, aparafuse a seringa de proteína na extremidade aberta do acoplador conectado à seringa lipídica. Tendo combinado duas seringas por meio do acoplador. Deve existir um volume contínuo de líquido desde o lípido numa seringa até à solução proteica na outra seringa.

Na preparação para a mistura, a unidade montada é mantida em uma com uma seringa na mão direita e a outra na esquerda. O torque é aplicado a ambos os barris até o acoplador, usando os dedos e o polegar de ambas as mãos para garantir que a vedação contra os sulcos no acoplador permaneça intacta durante o aperto. O dispositivo de mistura montado nesta fase danificará o ALS e causará vazamento sob o aperto também levará a vazamentos.

É uma questão de experiência com a inevitável tentativa e erro e perda ocasional de amostra. Vale a pena, portanto, praticar com lipídios e água ou solução tampão para ter uma ideia do sistema antes de começar a usar uma solução de proteína valiosa para afetar a mistura, avance o êmbolo no lado da proteína da unidade de mistura montada até o limite com o polegar ou indicador conduzindo a solução de proteína para fora da seringa de proteína através do acoplador e para a seringa lipídica. Se a unidade tiver sido selada de forma eficaz, esta ação causará um movimento igual e oposto do êmbolo no lado lipídico.

O êmbolo no lado lipídico agora é usado para conduzir o conteúdo da seringa lipídica de volta através da peneira e para a seringa de proteína. Este processo é repetido muitas vezes. Ocasionalmente, cem passagens ou mais são necessárias para produzir uma fase misa homogênea.

No início da mistura, o movimento do material para frente e para trás através do acoplador pode ser desigual e, às vezes, é necessária força extra para efetuar a mistura. Isso é de se esperar. A mistura inicial é geralmente acompanhada pelo desenvolvimento de uma nebulosidade não uniforme na amostra e novamente é esperada.

À medida que a homogeneização progride. A textura sentida pela força necessária para mover os êmbolos para frente e para trás torna-se mais uniforme e característica da fase cúbica da víscera, assim como a aparência visual da fase cúbica emergente. Se as condições forem adequadas e a fase cúbica se formar, a dispersão deve aparecer opticamente transparente no corpo da seringa.

Assim, as marcações no corpo da seringa devem ser claramente legíveis durante a fase meso no corpo. No caso de proteínas coloridas, a fase meso terá a cor da proteína, mas será opticamente transparente. Um resfriamento muito leve da amostra durante a mistura, colocando o misturador de seringas por um curto período de tempo no gelo, pode acelerar a homogeneização e a obtenção de transparência.

No entanto, é importante não exagerar na amostra, deve-se tomar cuidado para evitar uma mistura extremamente vigorosa, pois isso pode fazer com que a temperatura da amostra suba devido ao aquecimento por fricção. Nesta conjuntura, a fase cúbica de misa foi formada e a proteína é reconstituída no blay lipídico. A fase misa está agora pronta para ser dispensada em poços individuais das placas de cristalização.

Primeiro, no entanto, a fase meso deve ser transferida para uma seringa Hamilton de 10 microlitros montada em um dispensador de repetição. Comece este processo acoplando a seringa ao dispensador fino. Carregue a seringa com a mease.

Retire a agulha e o êmbolo da seringa. Deixe o fal de Teflon no lugar. Remova a porca de retenção do dispensador com a ajuda de uma pequena moeda.

Com o braço da catraca totalmente retirado. Insira a seringa sem o êmbolo e a agulha através do anel de retenção do dispensador. Recoloque o lado da junta do nó de retenção voltado para a seringa e aperte-o firmemente na extremidade aberta da seringa.

Deve-se tomar cuidado para garantir que a seringa esteja devidamente centralizada no anel de retenção e que o cilindro esteja alinhado paralelamente ao braço da catraca. Ambos podem ser julgados por I. Esses dois requisitos são importantes porque se o êmbolo não funcionar livremente e a pressão se acumular na seringa de origem durante o carregamento e pode ocorrer vazamento. Passe o êmbolo pelo anel de aperto com a porca da pinça, desaparafuse algumas voltas e guie o êmbolo na extremidade aberta da seringa.

Pressione o braço da catraca totalmente, mova o êmbolo para dentro do cano e verifique se ele se move livremente e através do cano. Se o parafuso e a barra guia estiverem afrouxados, aperte-o novamente e verifique novamente se o êmbolo se move livremente. I a seringa dispensadora está pronta para carregar.

Mova o êmbolo de um lado da unidade de mistura montada até a marca de graduação de zero microlitro. Transferir a fase meso para a outra seringa e o acoplador. Desconecte a seringa vazia com seu UL no lugar da unidade de mistura e conecte imediatamente a seringa carregada com o acoplador conectado à terminação rosqueada da seringa dispensadora de 10 microlitros.

O grau de aperto com que o acoplamento é feito é crítico. Como já observado, carreguei a seringa dispensadora pressionando o êmbolo da seringa de 100 microlitros para que a fase meso seja transferida através do acoplador. Se o acoplamento estiver apertado e o êmbolo na seringa dispensadora estiver livre, o êmbolo deve começar a se mover na direção do movimento do êmbolo de carregamento à medida que a seringa dispensadora se enche.

Desconecte a seringa de carregamento com o acoplador conectado da seringa dispensadora. Prenda uma agulha curta e de ponta plana na terminação de aço da seringa dispensadora e aperte-a cuidadosamente no lugar. Prenda o êmbolo ao braço da catraca apertando o nó no anel de preensão.

Deve-se tomar cuidado para não apertar demais o nó. Como isso pode marcar e deformar o êmbolo, tornando-o inutilizável. É importante que a faixa de deslocamento fornecida ao braço da catraca na condição clamped seja limitada a não mais do que uma polegada.

Como mostrado além disso, o êmbolo terá uma tendência a dobrar e a entrega pode falhar. L pressione o tambor da catraca várias vezes para avançar o êmbolo no cano, preenchendo assim o volume vazio da agulha e carregando a agulha. Esta etapa deve ser repetida até 10 vezes até que uma sequência contínua da fase mesa surja da ponta da agulha.

A agulha agora está pronta para uso na configuração de testes de cristalização, que devem começar imediatamente. Não é aconselhável manter a fase cúbica carregada de proteínas por muito tempo antes de estabelecer os testes de cristalização. Como algumas proteínas são instáveis na fase cúbica sem adição de precipitante, coloque uma placa de cristalização de vários poços e uma lamínula em uma superfície, levantada alguns centímetros acima da bancada para facilitar o carregamento.

O contraste ideal e a visibilidade aprimorada são alcançados quando a superfície está ligeiramente escura. Homogeneizar as soluções precipitantes e destampar os frascos para injetáveis. Defina a proppe de distribuição de precipitante para um microlitro com a seringa dispensadora segurada verticalmente em uma mão, use a mão livre para posicionar a ponta da agulha no centro e diretamente acima da base do poço.

Número um. Pressione o botão no dispensador de repetição para expelir um bolo de mease na superfície do vidro. O volume do bolo é de 200 nanolitros.

Quando o dispensador de repetição padrão é usado com uma seringa de 10 microlitros, a ponta da agulha não deve estar mais do que algumas centenas de micrômetros acima da base do poço Para garantir a entrega adequada, a entrega reprodutível é facilmente alcançada. Só é preciso um pouco de prática. Depois que os quatro poços adjacentes estiverem carregados com mease, coloque um microlitro de solução precipitante em cima de cada bolus de mease.

Usando dois microlitros por patente e pontas descartáveis padrão o mais rápido possível, coloque uma lamínula sobre os poços cheios para cobri-los uniformemente para efetuar uma vedação à prova d'água. Use uma espátula para aplicar pressão na lamínula onde ela entra em contato com a superfície adesiva exposta da fita espaçadora. O processo de distribuição de mease e precipitante pode ser repetido até que todos os poços da placa sejam carregados e selados.

A placa está agora pronta para inspeção e incubação. Rotule a placa claramente para fins de rastreamento. As proteínas sensíveis à luz são geralmente tratadas envolvendo as placas em papel alumínio antes de colocá-las na câmara de incubação.

Estes podem ser removidos e examinados ao microscópio em luz suave ou de cor apropriada. Coloque as placas em uma câmara com temperatura controlada, geralmente a 20 graus Celsius ou por volta disso, em um horário regular. Inspecione as paredes quanto ao crescimento de cristais usando um microscópio de luz polarizada com um met de 10 ou 20 vezes.

Objetivo, o cronograma utilizado no laboratório do autor é o seguinte, dia 0 1 2 3 5 7 14 21 30 post set. Inspecione cuidadosamente o bolo de mease. Ajustando a profundidade de foco dentro da amostra de 140 mícrons de espessura.

O exame deve ser feito tanto em luz normal quanto entre polarizadores cruzados, cristais de proteína de membrana incolores crescendo na fase cúbica quando vistos com luz normal. Fique assim. Os cristais de proteína de membrana incolor que crescem em meso quando vistos com luz polarizada se parecem com isso ou com isso, as proteínas de membrana naturalmente coloridas que crescem em meso quando vistas com luz normal se parecem com isso ou isso.

Os próximos passos no processo geral de determinação estruturada são colher e resfriar os cristais e registrar e processar a difração de raios-x deles. Esses tópicos são abordados em artigos separados do JoVE nesta série.