Name: In Utero Eletroporação Abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e Conectividade uma única célula (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Aprenda a usar eletroporação in utero para estudar conectividade estrutural e excitabilidade de neurônios corticais em camundongos. Este método permite análise quantitativa detalhada de neurônios individualmente marcados.

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Somos gratos a R. Gutiérrez e A. Morales por sua excelente assistência técnica e LA Weiss para edição. CGB é financiado pelo Espanhol Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011. Este trabalho foi financiado por uma bolsa da Fundação BBVA e SAF2014-58598-JIN (MINECO) para M. Navarrete e por uma bolsa da Fundação Areces Ramón e concede SAF2014-52119-R e BFU2014-55738-redt (de MINECO) para M. Nieto.

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<li>Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Control+of+a+Neuronal+Protein+Using+a+Genetically+Encoded+Unnatural+Amino+Acid+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+intrinsic+properties+and+excitability+of+layer+2%2F3+pyramidal+neurons+during+a+critical+period+for+sensory+maps+in+rat+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex.</a> J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).</li>
<li>Karadottir, R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+patch-clamping+of+cells+in+brain+slices+with+immunocytochemical+labeling+to+define+cell+type+and+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Este protocolo descreve em detalhe como rotular os neurônios do córtex somatossensorial de C75BL / 6 ratos, a fim de analisar a sua conectividade e sua excitabilidade. Com relação aos métodos existentes, visualiza aspectos exigentes de conectividade, tais como o número de ramos axonais por neurônio, sua topografia precisa, e sua localização anatômica. Ao alterar a posição dos eléctrodos, é possível atingir outras populações de neurónios, tal como o córtex cingulado (manter o mesmo ângulo entre os eléctrodos e o cérebro,...

O desenvolvimento de estruturas dendríticas e axonais é uma faceta importante da regulação circuito no sistema nervoso, incluindo no córtex cerebral. Ela desempenha um papel crítico durante a fiação selectiva das diversas subpopulações neuronais. Um certo número de relatórios recentes têm mostrado que, para além de conectividade, a diversidade molecular dos neurónios é reflectida pela aquisição de modos altamente específicos de disparo. No entanto, os mecanismos que determinam a excitabilidade e a conectividade dos subtipos distintos neuronais durante o desenvolvimento, bem como o seu grau de coordenação, são ainda pouco compreendidos 1, 2. In vivo deficitária e ganho de função para análises permitem o estudo da relação entre o nível de expressão de genes específicos e a sua influência no desenvolvimento do circuito. Em electroporação útero (IUE) é uma técnica amplamente utilizada para estudara função de um gene de interesse em populações neuronais específicas e para estudar os padrões gerais da sua conectividade. No entanto, para determinar as características morfológicas de axónios e dendritos em camadas corticais em ratinhos vivos, é essencial para rotular neurónios escassamente. Um sistema de recombinação Cre combinado com IUE pode ser usado para marcar uma população esparsa de neurónios a uma densidade suficientemente baixa para resolver as projecções emitidos pelas células individuais das lâminas corticais identificados. Este método etiquetas um número suficiente de neurónios por córtex para obter dados quantitativa após a análise de números razoáveis de cérebros electroporadas (Figura 1). Este manuscrito apresenta um método para tal análise multa de conectividade. Ele também apresenta uma estratégia semelhante para analisar, em experiências separadas, as propriedades elétricas dos neurônios através da realização de gravações de corrente-clamp na proteína verde fluorescente (GFP) -electroporated células de fatias corticais agudas. estes protocóis são versáteis e pode ser aplicada ao estudo da excitabilidade e conectividade dos neurónios de animais transgénicos e WT, e também de neurónios em que os ganhos e perdas de função são introduzidas por plasmídeos adicionais durante IUE. Embora este protocolo descreve a electroporação de ratinhos no dia embrionário (E) 15,5, esta técnica pode ser realizada em qualquer idade entre 3 e E9.5 dia pós-natal (P) 2 4. Enquanto eletroporação em estágios iniciais como alvo neurônios e precursores do tálamo e camadas profundas do córtex, em fase posterior marcas eletroporação camadas mais superficiais (por exemplo, neurônios E15.5 IUE alvos camada II-III). Em resumo, a combinação de IUE com análise morfológica de células única e electrofisiologia é uma ferramenta útil para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à enorme diversidade estrutural e funcional dos neurónios no sistema nervoso.

<table><tbody><tr><td>pCAG-Cre</td><td>Addgene</td><td>13775</td><td></td></tr><tr><td>pCALNL-GFP</td><td>Addgene</td><td>13770</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-DsRed2</td><td>Addgene</td><td>15777</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Carl Roth</td><td>301.1</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Carprofeno (Rimadyl)</td><td>Pfizer GmbH</td><td>1615 ESP</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (IsoFlo)</td><td>Abbott (Esteve)</td><td>1385 ESP</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina (Imalgene)</td><td>Merial</td><td>2528-ESP</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina (Xilagesic)</td><td>Calier</td><td>0682-ESP</td><td></td></tr><tr><td>Povidona</td><td>Iodo Meda</td><td>694109.6</td><td></td></tr><tr><td>Pomada para os Olhos (Lipolac)</td><td>Angelini</td><td>65.277</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Sal Balanceada Hanks (HBSS)</td><td>Gibco da Life Technologies</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de Bisturi # 3 - 12 cm</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Bisturi # 10</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Adson Serrilhada - Reta Ferramentas</td><td>de Ciência Fina</td> de 12 cm <td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Fina Endurecida - Reta 11 cm</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Mezenbaum-Nelson Curvada L=14,5 cm</td><td>Teleflex</td><td>PO143281</td><td></td></tr><tr><td>Pontas Curvas Finas - Estilo 7 Dumoxel</td><td>Dumont</td><td>0303-7-PO</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinças-Inox</td> Ferramentas <td>de Ciências Finas</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulhas Mathieu - Serrilhado</td><td>Fino Ferramentas Científicas</td><td>12010-14</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador AutoClip</td><td>Braintree scientific, Inc</td><td>ACS&nbsp; APL</td><td></td></tr><tr><td>9 mm AutoClips</td><td>MikRon Precision, Inc.</td><td></td><td></td>205016</tr><tr><td>Suturas - Polysorb 6-0</td><td>Covidien</td><td>UL-101</td><td></td></tr><tr><td>Barbeador Elétrico&nbsp;</td><td>Panasonic</td><td>ER 240</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato (100 mm, 1,0/0,58 diâmetro externo/interno)</td><td>World Precision Instrument Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Conjuntos de tubos aspiradores para pipetas microcapilares calibradas</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Gaze (Aposan)</td><td>Laboratorios Indas, S.A.U.</td><td>C.N. 482232.8</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes (Star Cott)</td><td>Albasa-Needle</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>25 G (BD Microlance 3)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Tecidos 100 x 20 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>GFP Tag Anticorpo Policlonal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11122</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Secundário, Alexa Fluor 488 conjugado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Eletroporador ECM 830&nbsp;</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodos de platina 650P 7 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P7</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio&nbsp; para Imagem Fluorescente - MZ10F</td><td></td> <td>Leica-VIP</td><td></td></tr> <tr><td>3000 Vaporizador de Isofluorano</td> Sistema de Varredura a Laser Matrx-TCS-SP5 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microscópio Leica-Axiovert</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>200 Zeiss-Cryostat</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>- CM 1950</td><td>Leica-P-97</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Extrator de Microestacas</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Análise de patch clamp softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3)</td><td>Dispositivos Moleculares-Software</td> <td>de</td> Aquisição (<td></td></tr><tr><td>Amplificador MultiClamp 700B)</td><td>Dispositivos Moleculares</td><td>DD1440A</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador Motorizado + Base Rotativa&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Mesa de Ar</td><td>Newport-Bombas</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Peristálticas Miniatura</td><td>WPI</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

in utero eletroporação abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e conectividade uma única célula

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

O sistema nervoso é composto de uma enorme variedade de tipos neuronais distintas. Estas subpopulações neuronais são caracterizados por, entre outras características, as suas morfologias dendríticas distintos, os seus padrões específicos de conectividade axonal, e as suas respostas de queima selectivos. Os mecanismos moleculares e celulares responsáveis ​​por estes aspectos da diferenciação durante o desenvolvimento ainda são pouco conhecidos. Aqui, descrevemos os protocolos combinados para a rotulagem e caracterizar a conectividade estrutural e excitabilidade dos neurônios corticais. Modificação do protocolo in utero eletroporação (IUE) permite a rotulagem de uma escassa população de neurônios. Este, por sua vez, permite a identificação e rastreio dos dendritos e axônios dos neurônios individuais, o caracterização precisa da localização laminar de projeções axonais e análises morfométricas. IUE também pode ser utilizado para investigar mudanças na excitabilidadeDe tipo selvagem (WT) ou neurónios geneticamente modificados, combinando-a com a gravação de células inteiras a partir de fatias de cérebro agudas electroporadas. Estas duas técnicas de contribuir para uma melhor compreensão do acoplamento de conectividade estrutural e funcional e dos mecanismos moleculares que controlam a diversidade neuronal durante o desenvolvimento. Estes processos de desenvolvimento têm implicações importantes sobre fiação axonal, a diversidade funcional de neurónios, e a biologia de distúrbios cognitivos.

Para caracterizar as alterações morfológicas de neurônios em detalhes e ao longo do desenvolvimento, é essencial para rotular neurônios escassamente. Um sistema Cre-recombinase diluída permite a expressão de um gene de interesse em uma população esparsa de neurónios, de modo que apenas os neurónios que incorporam esta enzima expressa GFP (Figura 1A). Usando essa estratégia, a camada II-III é orientada e rotulado por IUE em E15.5. CAG-DsRed2 a 1 ug / mL, é co-electroporad...

Este manuscrito fornece protocolos que usam in utero eletroporação (IUE) para descrever a conectividade estrutural dos neurônios no nível de uma única célula e a excitabilidade dos neurônios marcados com fluorescência. A histologia é utilizado para caracterizar dendrítica e projecções axonais. a gravação de célula inteira em fatias agudas é usado para investigar a excitabilidade.

In Utero Eletroporação Abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e Conectividade uma única célula

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

O objetivo geral desta abordagem de eletroporação in utero é caracterizar a conectividade estrutural e a excitabilidade de neurônios corticais em condições normais e experimentais. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na neurobiologia do desenvolvimento, como a análise da estrutura e da conectividade funcional do cérebro e da biologia dos transtornos cognitivos. A principal vantagem desta técnica é que ela permite marcar uma população esparsa de neurônios e possibilita visualizar as dendrites e acessar neurônios individuais, o que resulta em uma análise quantitativa mais eficiente e mais fiel.Antes da injeção, prepare dez microlitros de mistura de DNA por cirurgia para marcação de célula única ou estudo padrão de grampo de patch. Em seguida, manipule os embriões suavemente com os dedos para localizar o telencéfalo. Depois, coloque uma micropipeta de borossilicato preparada em um pipetador bucal.Passe a ponta da agulha através do útero, evitando vasos sanguíneos, até alcançar o ventrículo lateral. Em seguida, injete lentamente aproximadamente um microlitro de solução de DNA corada com Fast Green até que uma grande mancha azul seja observada. Uma etapa crítica de

in-utero-electroporation-approaches-to-study-excitability-neuronal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Na eletroporação utero é um método valioso para transfecting células progenitoras neuronal in vivo. Dependendo da colocação dos eletrodos e do ponto no tempo de desenvolvimento de eletroporação, certos subgrupos de células corticais podem ser alvo. Células-alvo podem então ser analisados ​​in vivo ou in vitro para efeitos da alteração genética.

No útero Eletroporação seguido por Cultura Neuronal primário para estudar a função do gene no subconjunto dos neurônios corticais

Na eletroporação útero permite a entrega rápida em um gene espacialmente e temporalmente maneira controlada no desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC). Aqui nós descrevemos um adaptável altamente in utero protocolo de eletroporação que pode ser usado para entregar constrói expressão em vários domínios embrionário do SNC, incluindo o telencéfalo diencéfalo e retina.

Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação

Um método de transferência de genes no cérebro do rato em desenvolvimento é descrito usando um único método cirúrgico ea forma especial de eletrodos. Esta técnica exclusiva permite a transfecção de DNA plasmídeo temporal e espacialmente, o que ajudará muitos neurocientistas em estudar o desenvolvimento do cérebro.

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

Controlar a expansão de células estaminais somáticas é um factor principal dificultando o seu estudo e a utilização em terapia. Aqui, descrevemos um sistema para controlar temporalmente neural haste de expansão de células durante o desenvolvimento e na vida adulta, o que pode ser usado para aumentar o número de neurónios gerados no cérebro do rato.

Expansão da embrionárias e adultas células-tronco neurais por<em&gt; In Utero</em&gt; Eletroporação ou injeção estereotáxica Viral

Este artigo descreve em pormenor um protocolo para electroporate no útero do córtex cerebral eo hipocampo em E14.5 em ratinhos. Mostramos também que este é um método valioso para estudar dendritos e espinhas nessas duas regiões cerebrais.

Visualização e manipulação genética de dendritos e espinhas no córtex cerebral e hipocampo do rato usando<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

O vídeo demonstra um método para estudar a excitabilidade de células neuronais que expressam proteína fluorescente usando uma pinça de corrente de contato de célula inteira. No modo de pinça de corrente, potenciais de ação indicativos de excitabilidade neuronal são gerados.

Estudando a excitabilidade de neurônios fluorescentes usando um grampo de patch de célula inteira

Este protocolo descreve um processo melhorado que implica...

Ex utero Eletroporação e Explantes hemisfério inteiro: um método simples Experimental de Estudos do Desenvolvimento Cortical Precoce

Este procedimento mostra como direcionar interneurônios no prosencéfalo de camundongo em desenvolvimento por meio de eletroporação in utero. Essa técnica foi particularmente eficiente para alcançar a expressão gênica seletiva em subtipos de interneurônios destinados às camadas superficiais do córtex.

Subtipo seletivo Eletroporação de Cortical Interneurônios

Aqui, nós fornecemos um método confiável e de baixo custo para gerar electroporated culturas do cérebro organotypic fatia de embriões do rato apropriados para microscopia confocal e técnicas de geração de imagens ao vivo.

Ex Utero Eletroporação e culturas Organotypic fatia do cérebro embrionário Mouse para imagens ao vivo de migração gabaérgica interneurônios

O dobro na eletroporação uteral permite atingir populações celulares que são separadas espacial e temporalmente. Esta técnica é útil para visualizar interações entre essas populações celulares usando proteínas fluorescentes em condições normais, mas também após experimentos funcionais para perturbado genes de interesse.

Dupla em Eletroporação utero para atingir populações celulares temporais e espacialmente separadas

Aprenda a usar eletroporação in utero para estudar conectividade estrutural e excitabilidade de neurônios corticais em camundongos. Este método permite análise quantitativa detalhada de neurônios individualmente marcados.

In Utero Eletroporação Abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e Conectividade uma única célula

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