Name: In Utero Eletroporação Abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e Conectividade uma única célula (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Aprenda a usar eletroporação in utero para estudar conectividade estrutural e excitabilidade de neurônios corticais em camundongos. Este método permite análise quantitativa detalhada de neurônios individualmente marcados.

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Somos gratos a R. Gutiérrez e A. Morales por sua excelente assistência técnica e LA Weiss para edição. CGB é financiado pelo Espanhol Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011. Este trabalho foi financiado por uma bolsa da Fundação BBVA e SAF2014-58598-JIN (MINECO) para M. Navarrete e por uma bolsa da Fundação Areces Ramón e concede SAF2014-52119-R e BFU2014-55738-redt (de MINECO) para M. Nieto.

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<li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53 (5), 639-647 (2007).</li>
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<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transportable%2C+inexpensive+electroporator+for+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation.</a> Dev Growth Differ. , (2015).</li>
<li>Miller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+rat+visual+cortex.+I.+A+quantitative+study+of+Golgi-impregnated+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons.</a> J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).</li>
<li>Miller, M., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+rat+visual+cortex.+II.+A+combined+Golgi-electron+microscope+study+of+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons.</a> J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).</li>
<li>Cubelos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cux-2+controls+the+proliferation+of+neuronal+intermediate+precursors+of+the+cortical+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone.</a> Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).</li>
<li>Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Control+of+a+Neuronal+Protein+Using+a+Genetically+Encoded+Unnatural+Amino+Acid+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+intrinsic+properties+and+excitability+of+layer+2%2F3+pyramidal+neurons+during+a+critical+period+for+sensory+maps+in+rat+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex.</a> J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).</li>
<li>Karadottir, R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+patch-clamping+of+cells+in+brain+slices+with+immunocytochemical+labeling+to+define+cell+type+and+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Este protocolo descreve em detalhe como rotular os neurônios do córtex somatossensorial de C75BL / 6 ratos, a fim de analisar a sua conectividade e sua excitabilidade. Com relação aos métodos existentes, visualiza aspectos exigentes de conectividade, tais como o número de ramos axonais por neurônio, sua topografia precisa, e sua localização anatômica. Ao alterar a posição dos eléctrodos, é possível atingir outras populações de neurónios, tal como o córtex cingulado (manter o mesmo ângulo entre os eléctrodos e o cérebro,...

O desenvolvimento de estruturas dendríticas e axonais é uma faceta importante da regulação circuito no sistema nervoso, incluindo no córtex cerebral. Ela desempenha um papel crítico durante a fiação selectiva das diversas subpopulações neuronais. Um certo número de relatórios recentes têm mostrado que, para além de conectividade, a diversidade molecular dos neurónios é reflectida pela aquisição de modos altamente específicos de disparo. No entanto, os mecanismos que determinam a excitabilidade e a conectividade dos subtipos distintos neuronais durante o desenvolvimento, bem como o seu grau de coordenação, são ainda pouco compreendidos 1, 2. In vivo deficitária e ganho de função para análises permitem o estudo da relação entre o nível de expressão de genes específicos e a sua influência no desenvolvimento do circuito. Em electroporação útero (IUE) é uma técnica amplamente utilizada para estudara função de um gene de interesse em populações neuronais específicas e para estudar os padrões gerais da sua conectividade. No entanto, para determinar as características morfológicas de axónios e dendritos em camadas corticais em ratinhos vivos, é essencial para rotular neurónios escassamente. Um sistema de recombinação Cre combinado com IUE pode ser usado para marcar uma população esparsa de neurónios a uma densidade suficientemente baixa para resolver as projecções emitidos pelas células individuais das lâminas corticais identificados. Este método etiquetas um número suficiente de neurónios por córtex para obter dados quantitativa após a análise de números razoáveis de cérebros electroporadas (Figura 1). Este manuscrito apresenta um método para tal análise multa de conectividade. Ele também apresenta uma estratégia semelhante para analisar, em experiências separadas, as propriedades elétricas dos neurônios através da realização de gravações de corrente-clamp na proteína verde fluorescente (GFP) -electroporated células de fatias corticais agudas. estes protocóis são versáteis e pode ser aplicada ao estudo da excitabilidade e conectividade dos neurónios de animais transgénicos e WT, e também de neurónios em que os ganhos e perdas de função são introduzidas por plasmídeos adicionais durante IUE. Embora este protocolo descreve a electroporação de ratinhos no dia embrionário (E) 15,5, esta técnica pode ser realizada em qualquer idade entre 3 e E9.5 dia pós-natal (P) 2 4. Enquanto eletroporação em estágios iniciais como alvo neurônios e precursores do tálamo e camadas profundas do córtex, em fase posterior marcas eletroporação camadas mais superficiais (por exemplo, neurônios E15.5 IUE alvos camada II-III). Em resumo, a combinação de IUE com análise morfológica de células única e electrofisiologia é uma ferramenta útil para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à enorme diversidade estrutural e funcional dos neurónios no sistema nervoso.

<table><tbody><tr><td>pCAG-Cre</td><td>Addgene</td><td>13775</td><td></td></tr><tr><td>pCALNL-GFP</td><td>Addgene</td><td>13770</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-DsRed2</td><td>Addgene</td><td>15777</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Carl Roth</td><td>301.1</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Carprofeno (Rimadyl)</td><td>Pfizer GmbH</td><td>1615 ESP</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (IsoFlo)</td><td>Abbott (Esteve)</td><td>1385 ESP</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina (Imalgene)</td><td>Merial</td><td>2528-ESP</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina (Xilagesic)</td><td>Calier</td><td>0682-ESP</td><td></td></tr><tr><td>Povidona</td><td>Iodo Meda</td><td>694109.6</td><td></td></tr><tr><td>Pomada para os Olhos (Lipolac)</td><td>Angelini</td><td>65.277</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Sal Balanceada Hanks (HBSS)</td><td>Gibco da Life Technologies</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de Bisturi # 3 - 12 cm</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Bisturi # 10</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Adson Serrilhada - Reta Ferramentas</td><td>de Ciência Fina</td> de 12 cm <td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Fina Endurecida - Reta 11 cm</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Mezenbaum-Nelson Curvada L=14,5 cm</td><td>Teleflex</td><td>PO143281</td><td></td></tr><tr><td>Pontas Curvas Finas - Estilo 7 Dumoxel</td><td>Dumont</td><td>0303-7-PO</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinças-Inox</td> Ferramentas <td>de Ciências Finas</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulhas Mathieu - Serrilhado</td><td>Fino Ferramentas Científicas</td><td>12010-14</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador AutoClip</td><td>Braintree scientific, Inc</td><td>ACS&nbsp; APL</td><td></td></tr><tr><td>9 mm AutoClips</td><td>MikRon Precision, Inc.</td><td></td><td></td>205016</tr><tr><td>Suturas - Polysorb 6-0</td><td>Covidien</td><td>UL-101</td><td></td></tr><tr><td>Barbeador Elétrico&nbsp;</td><td>Panasonic</td><td>ER 240</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato (100 mm, 1,0/0,58 diâmetro externo/interno)</td><td>World Precision Instrument Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Conjuntos de tubos aspiradores para pipetas microcapilares calibradas</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Gaze (Aposan)</td><td>Laboratorios Indas, S.A.U.</td><td>C.N. 482232.8</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes (Star Cott)</td><td>Albasa-Needle</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>25 G (BD Microlance 3)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Tecidos 100 x 20 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>GFP Tag Anticorpo Policlonal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11122</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Secundário, Alexa Fluor 488 conjugado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Eletroporador ECM 830&nbsp;</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodos de platina 650P 7 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P7</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio&nbsp; para Imagem Fluorescente - MZ10F</td><td></td> <td>Leica-VIP</td><td></td></tr> <tr><td>3000 Vaporizador de Isofluorano</td> Sistema de Varredura a Laser Matrx-TCS-SP5 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microscópio Leica-Axiovert</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>200 Zeiss-Cryostat</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>- CM 1950</td><td>Leica-P-97</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Extrator de Microestacas</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Análise de patch clamp softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3)</td><td>Dispositivos Moleculares-Software</td> <td>de</td> Aquisição (<td></td></tr><tr><td>Amplificador MultiClamp 700B)</td><td>Dispositivos Moleculares</td><td>DD1440A</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador Motorizado + Base Rotativa&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Mesa de Ar</td><td>Newport-Bombas</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Peristálticas Miniatura</td><td>WPI</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

in utero eletroporação abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e conectividade uma única célula

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

O sistema nervoso é composto de uma enorme variedade de tipos neuronais distintas. Estas subpopulações neuronais são caracterizados por, entre outras características, as suas morfologias dendríticas distintos, os seus padrões específicos de conectividade axonal, e as suas respostas de queima selectivos. Os mecanismos moleculares e celulares responsáveis ​​por estes aspectos da diferenciação durante o desenvolvimento ainda são pouco conhecidos. Aqui, descrevemos os protocolos combinados para a rotulagem e caracterizar a conectividade estrutural e excitabilidade dos neurônios corticais. Modificação do protocolo in utero eletroporação (IUE) permite a rotulagem de uma escassa população de neurônios. Este, por sua vez, permite a identificação e rastreio dos dendritos e axônios dos neurônios individuais, o caracterização precisa da localização laminar de projeções axonais e análises morfométricas. IUE também pode ser utilizado para investigar mudanças na excitabilidadeDe tipo selvagem (WT) ou neurónios geneticamente modificados, combinando-a com a gravação de células inteiras a partir de fatias de cérebro agudas electroporadas. Estas duas técnicas de contribuir para uma melhor compreensão do acoplamento de conectividade estrutural e funcional e dos mecanismos moleculares que controlam a diversidade neuronal durante o desenvolvimento. Estes processos de desenvolvimento têm implicações importantes sobre fiação axonal, a diversidade funcional de neurónios, e a biologia de distúrbios cognitivos.

Para caracterizar as alterações morfológicas de neurônios em detalhes e ao longo do desenvolvimento, é essencial para rotular neurônios escassamente. Um sistema Cre-recombinase diluída permite a expressão de um gene de interesse em uma população esparsa de neurónios, de modo que apenas os neurónios que incorporam esta enzima expressa GFP (Figura 1A). Usando essa estratégia, a camada II-III é orientada e rotulado por IUE em E15.5. CAG-DsRed2 a 1 ug / mL, é co-electroporad...

Este manuscrito fornece protocolos que usam in utero eletroporação (IUE) para descrever a conectividade estrutural dos neurônios no nível de uma única célula e a excitabilidade dos neurônios marcados com fluorescência. A histologia é utilizado para caracterizar dendrítica e projecções axonais. a gravação de célula inteira em fatias agudas é usado para investigar a excitabilidade.

In Utero Eletroporação Abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e Conectividade uma única célula

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

O objetivo geral desta abordagem de eletroporação in utero é caracterizar a conectividade estrutural e a excitabilidade de neurônios corticais em condições normais e experimentais. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na neurobiologia do desenvolvimento, como a análise da estrutura e da conectividade funcional do cérebro e da biologia dos transtornos cognitivos. A principal vantagem desta técnica é que ela permite marcar uma população esparsa de neurônios e possibilita visualizar as dendrites e acessar neurônios individuais, o que resulta em uma análise quantitativa mais eficiente e mais fiel.Antes da injeção, prepare dez microlitros de mistura de DNA por cirurgia para marcação de célula única ou estudo padrão de grampo de patch. Em seguida, manipule os embriões suavemente com os dedos para localizar o telencéfalo. Depois, coloque uma micropipeta de borossilicato preparada em um pipetador bucal.Passe a ponta da agulha através do útero, evitando vasos sanguíneos, até alcançar o ventrículo lateral. Em seguida, injete lentamente aproximadamente um microlitro de solução de DNA corada com Fast Green até que uma grande mancha azul seja observada. Uma etapa crítica deste procedimento é a injeção do DNA.Isso deve ser feito com o máximo de cuidado possível. Agora, posicione os eletrodos de platina de sete milímetros lateralmente na cabeça de um embrião e aplique uma tensão elétrica por meio dos eletrodos de platina. Neste procedimento, crioproteja os cérebros fixados em dez mililitros de sacarose a 30% em PBS a quatro graus Celsius por um a dois dias, até que afundem.Em seguida, prepare cubos de folha de alumínio com um centímetro cúbico de lado e preencha os cubos até 2/3 da altura com OCT. Depois, coloque os cérebros nos cubos e congele-os em gelo seco. Posteriormente, armazene os cérebros congelados a 80 graus Celsius.Para seccionar os cérebros no criostato, coloque uma gota de OCT na superfície do disco de espécime. Remova a folha de alumínio do bloco de histologia e posicione o bloco na orientação desejada sobre o OCT líquido. Aplique pressão firme até que o bloco histológico esteja fixado.Em seguida, insira o disco do espécime na cabeça do espécime do criostato e oriente o espécime para o corte. Então, corte seções com espessura de 50-100 micrômetros e transfira as crioseções flutuantes para PBS usando um pincel fino. Posteriormente, bloqueie as seções por uma hora à temperatura ambiente com soro bovino fetal a 5% em PBS, contendo Triton X-100 a 0,5%.Em seguida, incube-os durante a noite a quatro graus Celsius com anticorpo primário na diluição de 1:500 em solução bloqueadora. No dia seguinte, lave as seções três vezes em PBS. Adicione anticorpo secundário na diluição de 1:500 em solução bloqueadora e incube as seções por uma hora à temperatura ambiente.Em seguida, lave as seções três vezes em PBS. Posteriormente, contraclareie as seções com dapE em PBS contendo 0,5% de Triton X-100 por dez minutos. Enxágue as seções com PBS e monte-as com meio de montagem.Para reconstruir os neurônios, adquira imagens dos cortes cerebrais com alta ampliação e alta resolução. Em seguida, selecione Varredura em Mosaico no software de aquisição para cobrir a área de interesse, abrangendo todos os dendritos e prolongamentos axonais. Adquira um número suficiente de pilhas no eixo Z para evitar perda de informação.Em seguida, abra a imagem e selecione a opção de linha segmentada no menu. Desenhe uma linha seguindo a estrutura do neurônio. Posteriormente, vá até Analisar, Ferramentas, seguido por Gerenciador de ROI, e depois Adicionar para salvar a linha.Repita este processo para cada axônio ou dendrito do neurônio analisado. No menu do Gerenciador de ROI, pressione Medir para obter o comprimento. Exporte as medidas para um arquivo de texto ou planilha para análise.Para realizar um registro de um neurônio que expressa GFP a partir de um camundongo com GFP eletroporado, coloque o cérebro em uma placa de cultura resfriada. Corte o cerebelo com uma tesoura pequena. Em seguida, levante o cérebro com uma espátula e seque-o em uma toalha de papel.Cole a face ventral caudal do cérebro em um suporte de vibrátomo. Coloque o suporte em um vibrátomo preenchido com ACSF gelado e certifique-se de que a câmara do vibrátomo receba carbogenação contínua. Em seguida, obtenha cortes agudos realizando secções coronais de 300 micrômetros dentro de 15 minutos.Em seguida, incube os cortes agudos a 25 graus Celsius por pelo menos 60 minutos em ACSF enquanto borbulha com carbogênio. Após 60 minutos, transfira um corte para a câmara de registro usando uma pipeta de Pasteur ou um pincel pequeno. Prenda o corte com uma harpa e perfunda-o com ACSF a uma taxa de dois mililitros por minuto.Para realizar o patch de um neurônio positivo para GFP, localize a área de interesse através do microscópio em 10x. Em seguida, encontre uma célula positiva para GFP utilizando a objetiva de 60x. Depois, preencha o eletrodo de registro com a solução intracelular.Posteriormente, coloque uma pipeta de vidro no suporte de pipetas. Em seguida, posicione a ponta da pipeta no banho e foque na ponta. Assim que a pipeta estiver no banho, aplique pressão positiva através do sistema de controle de pressão traseira.Aproxime-se da célula de interesse com orientação visual, mantendo a pressão de retorno na pipeta. Ao surgir uma pequena depressão na superfície da célula, libere a pressão. Nesse momento, pode-se formar um selo apertado com uma resistência maior que um giga-ohm.Caso contrário, aplique uma leve pressão negativa para facilitar esse processo. Enquanto o selamento estiver sendo formado, ajuste o potencial de retenção do clamp de tensão para 60 milivolts. Uma vez formado o selamento de giga-ohm, aplique um pulso de sucção para romper a membrana celular e transicionar para o modo de célula inteira.Uma vez no modo de célula inteira, mude do regime de fixação de voltagem para o regime de fixação de corrente e inicie o registro. Essas imagens mostram a entrega de vetores para neurônios da camada 2/3 por eletroporação intra-útero no dia 15,5 do desenvolvimento embrionário, e as seções coronais foram preparadas no dia 16 pós-natal. O vetor CAG DsRed2 foi cotransfectado como controle.A GFP é expressa apenas nasque neurônios que também incorporaram a cre, permitindo a recombinação dos sítios LoxP no vetor CALNL GFP. Abaixo há uma imagem confocal com alta magnificação dos arborizações dendríticas de outro neurônio GFP esparsamente marcado. Este é um neurônio piramidal eletroporado com GFP, observado em condições de campo claro e fluorescência verde.Aqui está uma resposta típica de disparo regular de um neurônio controle eletroporado com CAG-GFP na camada 2/3. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 30 minutos para eletroporações in utero e meio dia para o registro com patch clamp, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de realizar a cirurgia o mais rápido possível para reduzir o estresse da mãe e aumentar as chances de sobrevivência dos filhotes.Após seguir este procedimento, outros métodos, como a expressão gênica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a relação entre a expressão de genes específicos e sua influência no desenvolvimento do camundongo. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de neurociência do desenvolvimento explorarem a conectividade e a morfologia de neurônios em camundongos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar cirurgia in utero para descrever a estrutura e conectividade de neurônios no nível de célula única e a excitabilidade de neurônios marcados com fluorescência.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Subtipo seletivo Eletroporação de Cortical Interneurônios

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Ex Utero Eletroporação e culturas Organotypic fatia do cérebro embrionário Mouse para imagens ao vivo de migração gabaérgica interneurônios

O dobro na eletroporação uteral permite atingir populações celulares que são separadas espacial e temporalmente. Esta técnica é útil para visualizar interações entre essas populações celulares usando proteínas fluorescentes em condições normais, mas também após experimentos funcionais para perturbado genes de interesse.

Dupla em Eletroporação utero para atingir populações celulares temporais e espacialmente separadas

Aprenda a usar eletroporação in utero para estudar conectividade estrutural e excitabilidade de neurônios corticais em camundongos. Este método permite análise quantitativa detalhada de neurônios individualmente marcados.

In Utero Eletroporação Abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e Conectividade uma única célula

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