In Utero Eletroporação Abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e Conectividade uma única célula

O objetivo geral desta abordagem de eletroporação in utero é caracterizar a conectividade estrutural e a excitabilidade dos neurônios corticais em condições normais e experimentais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na neurobiologia do desenvolvimento, como dissecar a estrutura e a conectividade funcional do cérebro e a biologia dos distúrbios cognitivos. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a marcação de uma população esparsa de neurônios e permite vestir os dendritos e acessar os neurônios individuais, o que leva a uma análise quantitativa mais eficiente e fimética.

Antes da injeção, prepare dez microlitros de mistura de DNA por cirurgia para marcação de célula única ou estudo de patch clamp padrão. Em seguida, manipule os embriões suavemente com os dedos para localizar o telencéfalo. Em seguida, coloque um capilar de borossilicato preparado em uma pipeta de boca.

Passe a ponta da agulha pelo útero, evitando vasos sanguíneos, até atingir o ventrículo lateral. Depois disso, injete lentamente aproximadamente um microlitro de solução de DNA de cor Fast Green até que uma grande mancha azul seja observada. Uma etapa crítica neste procedimento é a injeção do DNA.

Isso deve ser feito o mais suavemente possível. Agora, coloque os eletrodos de platina de sete milímetros lateralmente na cabeça de um embrião e aplique a voltagem através dos eletrodos de platina. Neste procedimento, crioproteja os cérebros fixos em dez mililitros de sacarose a 30% em PBS a quatro graus Celsius por um a dois dias até que eles afundem.

Em seguida, prepare cubos de papel alumínio de um centímetro cúbico e encha os cubos 2/3 ou o caminho com OCT. Depois, coloque os miolos nos cubos e congele-os em gelo seco. Posteriormente, armazene os cérebros congelados a 80 graus Celsius.

Para seccionar os cérebros no criostato, coloque uma gota de OCT na superfície do disco da amostra. Retire a folha de alumínio do bloco histológico e posicione o bloco na orientação desejada sobre o OCT líquido. Aplique pressão firme até que o bloco histológico seja fixado.

Em seguida, insira o disco de amostra na cabeça da amostra do criostato e oriente a amostra para seccionamento. Em seguida, corte seções de 50-100 micrômetros de espessura e transfira as criosseções flutuantes para PBS usando um pincel fino. Em seguida, bloqueie os cortes por uma hora em temperatura ambiente com 5% de soro fetal bovino em PBS, contendo 0,5% de Triton X-100.

Em seguida, incube-os durante a noite a quatro graus Celsius com anticorpo primário 1:500 diluído em solução de bloqueio. No dia seguinte, lave as seções três vezes em PBS. Adicionar o anticorpo secundário 1:500 diluído em solução de bloqueio e incubar as secções durante uma hora à temperatura ambiente.

Em seguida, lave as seções três vezes em PBS. Em seguida, contra-core as seções com dapE em PBS contendo 0,5% Triton X-100 por dez minutos. Enxágue as seções com PBS e monte-as com meio de montagem.

Para reconstruir os neurônios, adquira imagens das seções cerebrais com alta ampliação e alta resolução. Em seguida, selecione Tile Scan no software de aquisição para cobrir a área de interesse, abrangendo todos os dendritos e processos axonais. Adquira um número suficiente de pilhas no eixo Z para evitar a perda de informações.

Depois disso, abra a imagem e selecione a opção de linha segmentada no menu. Desenhe uma linha seguindo a estrutura do neurônio. Em seguida, vá para Analisar, Ferramentas, seguido por Gerenciador de ROI e, em seguida, Adicionar para salvar a linha.

Repita esse processo para cada axônio ou dendrito do neurônio analisado. No menu Gerenciador de ROI, pressione Medir para obter o comprimento. Exporte as medições para um arquivo de texto ou planilha para análise.

Para realizar uma gravação do neurônio expresso em GFP de um camundongo eletroporado GFP, coloque o cérebro em uma placa de cultura resfriada. Corte o cerebelo com uma tesoura pequena. Em seguida, pegue o cérebro com uma espátula e seque-o em uma toalha de papel.

Cole o plano caudal ventral do cérebro em um suporte de vibrato. Coloque o suporte em um vibratomo cheio de ACSF gelado e certifique-se de que a câmara do vibratome tenha carbogenação contínua. Em seguida, obtenha cortes agudos cortando cortes coronais de 300 micrômetros em 15 minutos.

Em seguida, incube as fatias agudas a 25 graus Celsius por pelo menos 60 minutos em ACSF enquanto borbulha com carbogênio. Após 60 minutos, transferir uma fatia para a câmara de registo utilizando uma pipeta Pasteur ou uma escova pequena. Segure a fatia com uma harpa e profunda-a com ACSF a uma taxa de dois mililitros por minuto.

Para corrigir um neurônio GFP positivo, localize a área de interesse através do microscópio em 10x. Em seguida, encontre uma célula positiva para GFP usando a objetiva de 60x. Em seguida, encha o eletrodo de registro com solução intracelular.

Em seguida, coloque uma pipeta de vidro no porta-pipetas. Depois, coloque a ponta da pipeta no banho e concentre-se na ponta. Assim que a pipeta estiver no banho, aplique pressão positiva através do sistema de controle de contrapressão.

Aproxime-se da célula de interesse sob orientação visual, mantendo a contrapressão na pipeta. Após o aparecimento de uma pequena covinha na superfície da célula, libere a pressão. Neste ponto, uma vedação hermética com uma resistência maior que um giga-ohm pode ser formada.

Caso contrário, aplique uma leve pressão negativa para facilitar. Enquanto a vedação está sendo formada, traga o grampo de tensão de retenção para 60 milivolts. Uma vez que a vedação de giga-ohm é formada, aplique um pulso de sucção para romper a membrana celular e entrar no modo de célula inteira.

Quando estiver no modo de célula inteira, mude do voltage clamp para corrente clamp modo e comece a gravar. Essas imagens mostram a entrega de vetores aos neurônios da camada 2/3 por eletroporação in utero no dia embrionário 15,5, e os cortes coronais foram preparados no dia 16 pós-natal. O vetor CAG DsRed2 foi cotransfectado como controle.

A GFP é expressa apenas nos neurônios que também incorporaram cre, permitindo a recombinação dos locais LoxP no vetor CALNL GFP. Aqui está uma imagem confocal de alta ampliação das árvores dendríticas de outro neurônio GFP esparsamente rotulado. Este é um neurônio piramidal eletroporado com GFP que foi observado sob campos claros e condições de fluorescência verde.

Aqui está uma resposta típica e regular de um neurônio de controle eletroporado CAG-GFP na camada 2/3. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 30 minutos para eletroporações in utero e meio dia para a gravação do patch clamp, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de fazer a cirurgia o mais rápido possível para reduzir o estresse da mãe e aumentar as chances de sobrevivência dos filhotes.

Após esse procedimento, outros métodos como a expressão podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a relação entre a expressão de genes específicos e sua influência no desenvolvimento do substituto. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência do desenvolvimento explorarem a conectividade e a morfologia dos neurônios em camundongos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a operação no útero para descrever a estrutura e a conectividade dos neurônios no nível de uma única célula e a excitabilidade dos neurônios marcados com fluorescência.