Name: Um pacote de ferramentas analíticas estabelecidas para investigar a alteração do estado sólido de excipientes à base de lipídios (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T13:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Aprenda a usar calorimetria diferencial de varredura e difração de raios X para caracterizar alterações do estado sólido em excipientes lipídicos farmacêuticos. Esta metodologia robusta auxilia no desenvolvimento de formulações eficazes.

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O Centro de Investigação em Engenharia Farmacêutica (RCPE) é financiado no âmbito do COMET - Centros de Competência para Excelentes Tecnologias pela BMK, BMDW, Land Steiermark e SFG. O programa COMET é gerido pela FFG.

1. Calorimetria exploratória diferencial (DSC)
<ol><li>Preparação do instrumento<ol><li>Use um calorímetro de varredura diferencial equipado com um intracooler, um amostrador automático e o software para controle de instrumentos e análise de dados.</li>
		<li>Ligue a fonte de gás nitrogênio e ajuste a pressão entre 0,2 e 0,5 bar e ligue o instrumento DSC e o trocador automático de amostras.</li>
		<li>Abra o software e ative o modo de espera clicando no botão Sim . Permitir o equilíbrio do dispositivo por pelo menos uma hora</li>
		<li>Limpe o forno com nitrogênio, clique no ícone Novo Método e vá para Definição do Método. Ative a opção Modulação de temperatura na janela de visão geral.  Vá para a guia de cabeçalho e selecione o método clicando em "amostra".</li>
		<li>Vá para a guia Programa de temperatura, selecione Purgar 2 MFC e em MFC protetor, ambos a 50 mL/min.</li>
		<li>Inserir o seguinte método de medição: Modo de espera a 20 °C, ciclo de aquecimento a 5 K/min de 20 °C até acima da temperatura de fusão dos lípidos, retenção isotérmica a esta temperatura durante 5 minutos, ciclo de arrefecimento a 0 °C a 5 K/min a -20 °C, temperatura final de reposição de emergência a uma temperatura de 10 graus °C acima da temperatura mais elevada do programa, e temperatura final de espera a 20 °C.</li>
		<li>Vá para a guia calibração e selecione o arquivo de temperatura e sensibilidade apropriado. Salvar o método</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação e medição de amostras<ol><li>Pesar 3-4 mg de cada amostra em cadinhos de alumínio. Registre o peso exato carregado em cada cadinho e sele o cadinho de alumínio com uma tampa perfurada.</li>
		<li>Coloque os cadinhos na bandeja do amostrador automático e ative o modo de amostrador automático no software e no método relacionado à carga para cada amostra.</li>
		<li>Preencha a posição da amostra, o nome da amostra e o peso de cada amostra, bem como a posição do cadinho de referência na janela Visualização da bandeja da amostra e inicie as medições.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de dados<ol><li>Abra os dados brutos usando o software para análise de dados e plote a temperatura versus fluxo de calor, clicando no botão "X-time / X-temperature"</li>
		<li>Na janela estourada, clique em "Ocultar segmentos isotérmicos". No lado esquerdo da tela, selecione apenas as curvas a serem analisadas (por exemplo, desclique nos dados "Adicionais").</li>
		<li>Verificar o comportamento térmico dos lipídios como eventos endotérmicos e exotérmicos de energia absorvida ou liberada na forma de calor, respectivamente, em função da temperatura.</li>
		<li>Clique na curva, seguida de Avaliação e Área, para calcular a entalpia de fusão como a área sob a curva de endotermas.</li>
		<li>Selecione os limites de integração movendo as linhas verticais em torno de 2 a 3 graus Celsius antes e depois do início e do ponto final do pico.</li>
		<li>Selecione uma linha de base linear para a integração de pico. A área entre a curva e a linha de base é proporcional à mudança na entalpia. Clique em Aplicar para concluir o cálculo. Da mesma forma, calcule a entalpia de cristalização como a área sob a curva de exotermas</li>
		<li>Determine o início da temperatura de fusão (Para) clicando na curva a ser analisada e, em seguida, em Avaliação e Início.</li>
		<li>Selecione os limites de quantificação movendo as linhas verticais para a seção mais reta da curva. Isso geralmente ocorre em torno de 5-10 ° C antes e depois do pico. Em seguida, determine a temperatura de fusão clicando na curva a ser analisada, seguida de Avaliação e Pico. O valor obtido é o pico máximo.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Espalhamento de raios-X de pequeno e grande angular (SWAXS)
<ol><li>Preparação do instrumento<ol><li>Use um sistema de espalhamento de raios-x, compondo uma câmera de foco pontual fixada a um gerador de raios-X de tubo selado e equipada com uma unidade de controle e software relacionado.</li>
		<li>Use cooper (λ = 1,54 Å) a 50 kV e 1 mA como fonte de raios-X e dois detectores sensíveis posicionados linearmente para cobrir regiões de espalhamento de raios-X pequenas e grandes angulares.</li>
		<li>Garantir os requisitos de segurança para proteger da exposição a raios-x.</li>
		<li>Ligue o sistema de água de arrefecimento na unidade de controlo, na bomba de vácuo, nas válvulas de gás e no sistema de controlo de potência e segurança.</li>
		<li>Ligue as válvulas de controle de tensão e purga para os detectores em um fluxo de gás entre 10 e 20 mL/min.</li>
		<li>Ligue o tubo de raios X e a opção de espera e aguarde aproximadamente 10 min. Desligue o modo de espera e ligue o tubo de raios X para a potência máxima (>50kV) e aguarde pelo menos 30 minutos.</li>
		<li>Inicie o software de controle e clique em RESET TPF. Escolha Filtro de rebocador e defina a posição. Vá para Posição para fixar a posição do filtro de tungstênio</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação e medição de amostras<ol><li>Certifique-se de que as amostras estão disponíveis como pó fino. Se necessário, moer as amostras suavemente a baixas temperaturas para fornecer um pó fino.</li>
		<li>Encher as amostras em capilares de vidro especiais com um diâmetro externo de aproximadamente 2 mm, evitando qualquer aprisionamento de ar nos capilares. Sele o capilar de vidro com cera e coloque-o cuidadosamente no suporte capilar.</li>
		<li>Ligue o motor para a rotação da amostra e feche a válvula de vácuo até que a pressão esteja abaixo de 5 mbar.</li>
		<li>No software, corrija a configuração de medições selecionando uma resolução de posição de 1024. Fixe o tempo de exposição para 1200 s.</li>
		<li>Configure os limites de energia clicando no toque em Ferramentas, clique em energia e resolução e clique em reiniciar. Configure os limites de energia para uma faixa adequada entre 400-900.</li>
		<li>Abra o obturador de segurança e inicie as medições. Certifique-se de que a janela de medição mostre um máximo de 80 contagens por segundo. Se isso não for dado, adapte a posição do filtro.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de dados<ol><li>Exporte os dados como arquivos p00. Os dados consistem na intensidade de transmissão e absorção versus o número de canais e o ângulo de difração.</li>
		<li>Transfira os dados para avaliação para um software estatístico e corrija os dados normalizando as intensidades usando a massa de dispersão medida com o filtro de tungstênio.</li>
		<li>Crie um gráfico de intensidade normalizada versus duas vezes o ângulo de difração [(2Θ) 2xtheta].</li>
		<li>Use a função de "leitor de tela" para encontrar picos de difração nas regiões SAXS e WAXS.</li>
		<li>Aplique a equação de Bragg para calcular os picos de difração com intensidade máxima em espaçamento d curto e longo para as regiões WAXS e SAXS, respectivamente.</li>
		<li>Calcule as razões da posição de pico da região SAXS para descobrir a simetria cristalina dos lipídios (por exemplo, lamelar, hexagonal, cúbico).</li>
		<li>Use o pico de difração principal da região SAXS para quantificar a espessura do cristalito (D). Ajuste o pico em uma função gaussiana através de mínimos quadrados clássicos e obtenha o FWHM clicando em Análise, Picos e linhas de base, Analisador de pico, Caixa de diálogo Abrir.</li>
		<li>Na janela de saída, selecione a opção "Fit Peaks Pro". Selecione uma linha de base constante com y = 0 e selecione o pico de difração principal da região SAXS e clique em "Controle de ajuste" para selecionar os parâmetros de ajuste de pico.</li>
		<li>Escolha a função GaussAmp. Defina os parâmetros y_0, xc_1 e A_1 como fixos e obtenha o FWHM a partir do ajuste. Use a equação de Scherrer para calcular a espessura do cristalito.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Ensaios de dissolução
<ol><li>Liberação de API de sistemas multiparticulados revestidos<ol><li>Use o aparelho USP 2 (pá) para estudos de dissolução.</li>
		<li>Encher os recipientes de ensaio de dissolução com tampão fosfato pH 6,8 e aquecer a 37 °C.</li>
		<li>Pesar triplicados de amostras de partículas revestidas equivalentes a uma dose única de IFA e colocar as amostras em recipientes de ensaio de dissolução.</li>
		<li>Inicie a raquete a uma velocidade de 100 rpm.</li>
		<li>Ajuste o amostrador automático para coletar amostras de 1 mL nos seguintes pontos de amostragem: 30 min, 60 min, 90 min, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 18 h e 24 h.</li>
		<li>Analisar as amostras através de um método de HPLC adequado 5,7,17.</li>
		<li>Analise os dados plotando a versão cumulativa da API versus o tempo.</li>
		<li>Realizar os experimentos para amostras armazenadas em longo prazo (25 °C, 60% de umidade relativa) e acelerada (40 °C e 70% de umidade relativa).</li>
	</ol></li>
	<li>Liberação de API a partir de nanopartículas lipídicas sólidas (SLN)<ol><li>Preparar fluido pulmonar simulado (SLF) misturando 0,02% (p/p) de dipalmitoilfosfatidilcolina na solução salina tampão fosfato de Dulbecco (D-PBS), com a seguinte composição: KCl (2,683 mM), KH 2 PO 4(1,47 mM), NaCl (136,893 mM), Na2HPO4· 2H 2O (8.058 mM), CaCl2· 2H 2O (0,884 mM) e MgCl2· 6H2O (0,492 mM). Pré-aqueça-o a 37 °C.</li>
		<li>Use de diálise com um saco de membrana de celulose de um ponto de corte controlado de 7.000 Da em triplicado para cada amostra.</li>
		<li>Atribua um de diálise para cada tempo de amostragem: 0,5 h, 1,5 h, 3 h, 5 h, 7 h e 24 h. Hidrate as de diálise durante 2 minutos, imergindo-as em SLF. Em seguida, seque cuidadosamente sua superfície com toalhas de papel macias.</li>
		<li>Injetar 3 mL da amostra (nanosuspensão lipídica), equivalente a 600 μg de dexametasona, em cada.</li>
		<li>Mergulhe cada em 200 mL de SLF a 37 °C (condições de dissipação) e agite o sistema a 125 rpm.</li>
		<li>Colher 200 mg de amostras no interior do utilizando uma seringa em cada hora de amostragem determinada.</li>
		<li>Determine o conteúdo da API usando o método HPLC-MS desenvolvido18.</li>
		<li>Calcule a API liberada da SLN pelo balanço de massa, de acordo com18, brevemente como a diferença entre a quantidade total de API na SLN e a quantidade restante de API após a amostragem.</li>
		<li>Repita o processo para amostras armazenadas.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+behaviour+of+fats+and+lipids+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Engineering+Science%22%5BJournal%5D)">Crystallization behaviour of fats and lipids a review.</a> Chemical Engineering Science. 56 (7), 2255-2265 (2001).</li>
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</ol>

Os autores divulgam todo e qualquer conflito de interesse.

Difração de raios X em pó e DSC foram descritos neste manuscrito como padrão-ouro para a análise do estado sólido de LBEs. A difração de raios X em pó tem a excelente vantagem de processar as medições in situ, com o mínimo de manipulação de estado sólido das amostras durante as medições. Além disso, os capilares cheios de mesmo tipo podem ser armazenados em diferentes condições após as medições iniciais para investigar a alteração do estado sólido durante o armazenamento. Neste trabalho, nos concentramos nas reg...

Os lipídios são uma classe de materiais que contêm hidrocarbonetos alifáticos de cadeia longa e seus derivados. Abrangem uma ampla gama de estruturas químicas, incluindo ácidos graxos, acilgliceróis, esteróis e ésteres de esteróis, ceras, fosfolipídios e esfingolípidos1. O uso de lipídios como excipientes farmacêuticos iniciou-se em 1960 para incorporação de fármacos em uma matriz de cera para fornecer formulações de liberação sustentada2. Desde então, os excipientes à base de lipídios (LBEs) ganharam ampla atenção para diversas aplicações, como liberação modificada de medicamentos, mascaramento de sabor, encapsulamento de medicamentos e aumento da biodisponibilidade de medicamentos. Os LBEs podem ser aplicados em uma ampla gama de formas de dosagem farmacêutica através de processos de fabricação versáteis, a saber, revestimento a quente, secagem por pulverização, extrusão de lipídios sólidos, impressão 3D, comprimidos e homogeneização de alta pressão, entre outros. Formas de dosagem como comprimidos, filmes de desintegração oral, sistemas multiparticulados, nano e micropartículas, pellets e formas impressas em 3D são o resultado 2,3,4.
Os LBEs possuem o status "Geral Reconhecido como Seguro", baixa toxicidade, boa biocompatibilidade e melhor tolerância do paciente. Sua origem natural e ampla disponibilidade permitem que eles capacitem a fabricação farmacêutica verde e sustentável. No entanto, o uso de LBEs tem sido associado a formas de dosagem instáveis. Alterações nas propriedades de produtos à base de lipídios após o armazenamento têm sido amplamente relatadas. O estado sólido dos LBEs e a existência de polimorfismo lipídico são considerados os principais motivos para a instabilidade das formas de dosagem à base de lipídios 5,6,7,8.
As propriedades mecânicas e físicas dos lipídios estão intimamente relacionadas às suas propriedades de cristalização e à estrutura de sua rede cristalina, o que mostra hierarquias distintas de organização estrutural. Quando os lipídios são utilizados na fabricação de produtos farmacêuticos, a estrutura cristalina é afetada pelos parâmetros de processo aplicados, como temperatura, solventes orgânicos, cisalhamento e forças mecânicas, o que, por sua vez, afeta o desempenho do produto farmacêutico 5,7,9,10,11,12 . Para entender essa relação estrutura-função, é importante conhecer os fundamentos da cristalização lipídica e da estrutura cristalina e métodos analíticos para rastreá-los.
No nível molecular, a menor unidade de um cristal lipídico é denominada "célula unitária". Uma repetição tridimensional regular de células unitárias constrói as redes cristalinas, com interações moleculares mais fortes ao lado de suas direções laterais do que as longitudinais, explicando a construção em camadas de cristais lipídicos. O empacotamento transversal repetido das cadeias de hidrocarbonetos é conhecido como subcélula 1,12,13 (Figura 1). As lamelas são o empacotamento lateral das moléculas lipídicas. No pacote de cristais, as interfaces entre diferentes lamelas são feitas de grupos finais de metila, enquanto os grupos glicerol polar são colocados nas partes internas da lamela14. Para diferenciar cada cadeia de ácidos graxos na lamela, o termo folheto é empregado, que representa uma subcamada composta de cadeias únicas de ácidos graxos. Os acilgliceróis podem ser dispostos em comprimentos de cadeia de folheto duplos (2L) ou triplos (3L)14. A energia superficial das lamelas os leva a empilhar epitaxialmente uns aos outros, para fornecer nanocristalitos. Diferentes fatores de processamento, como temperatura e taxa de resfriamento, afetam o número de lamelas empilhadas e, portanto, a espessura do cristalito (~ 10-100 nm). A agregação de cristalitos leva à formação de esferulitos em microescala, e a agregação de esferulitos fornece à rede cristalina de LBEs um comportamento macroscópico definido13.
As transições de estado sólido começam no nível molecular. A transição geométrica de uma subcélula para outra é chamada de polimorfismo. Três polimorfos principais de forma α, β e β são geralmente encontrados em acilgliceróis, ordenados de acordo com o aumento da estabilidade. A inclinação da lamela em relação aos grupos finais ocorre durante as transições polimórficas 1,13. Transições polimórficas mediadas por armazenamento e fusão são experimentadas por LBEs. As transições de armazenamento ocorrem quando a forma metaestável é armazenada abaixo de sua temperatura de fusão, enquanto as transições mediadas por fusão acontecem à medida que a temperatura sobe acima do ponto de fusão de uma forma metaestável, provocando fusão e cristalização sucessiva da forma mais estável.
Além disso, a separação de fases e o crescimento de cristais também podem ocorrer. A separação de fases é impulsionada pela cristalização multifásica inicial e pelo crescimento de uma fase ou mais. Interações partícula-partícula, incluindo sinterização, interações moleculares, características microestruturais e componentes estranhos, também podem desencadear o crescimento de cristais 1,5.
O monitoramento das transições de estado sólido dos LBEs e seu impacto no desempenho das formas de dosagem é de importância significativa. Entre outros, a calorimetria exploratória diferencial (DSC) e a difração de raios X, especificamente o espalhamento simultâneo de raios-X de pequeno e grande ângulo (SWAXS), são dois padrões ouro para avaliar o estado sólido lipídico.
O DSC é comumente usado para medir as mudanças de entalpia do material de interesse associado ao fluxo de calor em função do tempo e da temperatura. O método é amplamente utilizado para a triagem do comportamento térmico de lipídios, como possíveis vias de fusão e cristalização, temperatura e entalpia correspondentes de diferentes formas polimórficas, bem como frações menores e principais de composições lipídicas. Esses dados podem ser utilizados para descrever a heterogeneidade, as múltiplas fases e o polimorfismo lipídico 5,7,13.
As técnicas de difração de raios X são os métodos mais poderosos para a determinação de estruturas no estado sólido. Possuindo nanoestrutura ordenada com lamelas repetidas, a reflexão do feixe de raios-X de cristais lipídicos pode ser investigada usando a lei de Bragg:
d = λ/2sinθ (Equação 1)
onde λ é o comprimento de onda de raios-X de 1,542 Å, θ é o ângulo de difração do feixe disperso e d é o espaçamento interplanar de camadas repetidas, definido como comprimento de lamela em lipídios. A região de pequeno ângulo do raio-x pode ser perfeitamente usada para detectar o padrão de espaçamento longo e calcular o comprimento da lamela (d). Quanto maior a distância repetida d, menor o ângulo de dispersão (1-15°, região de ângulo pequeno), uma vez que d é inversamente proporcional ao pecado θ. O arranjo subcelular dos lipídios pode ser caracterizado como o padrão de espaçamento curto na região grande angular da difração de raios X. Ambos os padrões de espaçamento longo e curto dos lipídios (comprimento da lamela e arranjo subcelular) podem ser usados para indicar a transformação polimórfica monotrópica. Por exemplo, a forma α (hexagonal) pode ser alterada para β (triclínica) devido a uma mudança no ângulo de inclinação das correntes, com alterações no comprimento da lamela (padrão de espaçamento longo, na região de pequeno angular, 1-15°) e no modo de empacotamento transversal (padrão de espaçamento curto, na região grande angular, 16-25°) (Figura 2).
As informações obtidas da região SAXS podem ainda ser utilizadas para investigar o crescimento do cristal medindo sua espessura (D) através da equação de Scherrer15:
D = Kλ/FWHMcosθ (Equação 2)
Onde, FWHM é a largura em radianos do máximo de difração medido a uma altura intermediária entre o fundo e o pico, geralmente conhecido como largura total a meio máximo (FWHM); θ é o ângulo de difração; λ é o comprimento de onda de raios-X (1,542 Å) e K (constante de Scherrer) é um número adimensional que fornece informações sobre a forma do cristal (no caso da ausência de informações detalhadas sobre a forma K = 0,9 é uma boa aproximação). Por favor, note que a equação de Scherrer pode ser usada para estimar tamanhos médios de cristais de até cerca de 100 nm, uma vez que o pico de alargamento é inversamente proporcional ao tamanho do cristalito. Portanto, sua aplicação é útil para determinar a espessura das nanoplaquetas e, indiretamente, o número de lamelas agregadas. Exemplos de utilização dessa conhecida abordagem para triagem das propriedades cristalinas dos lipídios no desenvolvimento da formulação farmacêutica e da correspondente instabilidade no desempenho do produto podem ser encontrados em 5,12,16,17,18.
O monitoramento do estado sólido dos LBEs dentro de cada estágio de desenvolvimento por meio de técnicas analíticas bem estabelecidas fornece uma estratégia eficaz para projetar processos de fabricação de alto desempenho e produtos farmacêuticos estáveis à base de lipídios.
Esta publicação apresenta a aplicação crítica de uma análise abrangente do estado sólido dos LBEs para monitorar as mudanças no estado sólido e sua correlação com a alteração no perfil de liberação do ingrediente farmacêutico ativo (IFA) da forma farmacêutica farmacêutica. Sistemas multiparticulados baseados em cristais API revestidos de lipídios via revestimento a quente e suspensões nanolipídicas produzidas via homogeneização de alta pressão são tomados como estudos de caso. O foco desta publicação é a aplicação da difração de raios X em pó e do DSC como ferramentas analíticas. Os dois primeiros exemplos mostram o efeito da transformação polimórfica e do crescimento de cristais, respectivamente, sobre a alteração na liberação de API de amostras revestidas. O último exemplo revela a correlação entre o estado sólido estável dos lipídios e o desempenho estável do produto farmacêutico em sistemas multiparticulados revestidos de lipídios e em suspensões nanolipídicas.

<table><tbody><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>com um saco de membrana de celulose com um corte de 7000 Da, Thermo Scientific Slide-A-Lyzer 7K</td><td>Fisher Scientific Inco, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de controle do sistema de raios X</td><td>Equipamento</td><td></td><td></td>doméstico dedicado HECUS</tr><tr><td>Unidade de controle do sistema de raios X</td><td>Equipamento</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>doméstico dedicado HECUSCalorímetro exploratório diferencial (DSC) cadinhos e tampas de alumínio</td><td>Netzsch, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calorímetro exploratório diferencial DSC 204 F1 Phoenix (NETZSCH, Alemanha).</td><td>Netzsch, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>850355P</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de pá de dissolução II, Erweka DT 828 LH</td><td>Erweka GmbH, Langen, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynasan 116</td><td>IOI OLEO</td><td></td><td>Tripalmitin</td></tr><tr><td>Geleol</td><td>Gattefosse</td><td></td><td>Glyceryl monosterarate&nbsp;</td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>529552</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Kolliphor P 188</td><td>BASF Chem Trade</td><td></td><td>Poloxamer 188&nbsp;</td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Netzsch DSC 204F1 Software Version 8.0.1</td><td>Netzsch, Germany</td><td>6.239.2-64.51.00</td><td></td></tr><tr><td>Origin Pro (OriginLab, Northampton, MA) (software estatístico</td><td>OriginLab, Northampton, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de Análise de Proteínas</td><td>Netzsch, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 65</td><td></td><td></td><td>Polissorbato 65</td></tr><tr><td>Witepsol PMF 1683</td><td>IOI OLEO</td><td></td><td>Éster de triglicerol de ácido estearático/palmítico (parcialmente esterificado)</td></tr><tr><td>Witepsol PMF 282</td><td>IOI OLEO</td><td></td><td>Éster diglicerol de ácido esteárico&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema HECUS de raios X composto por uma câmera de foco pontual e dois detectores sensíveis posicionados linearmente Equipamento</td><td></td><td></td> <td>doméstico dedicado HECUS</td></tr></tbody></table>

um pacote de ferramentas analíticas estabelecidas para investigar a alteração do estado sólido de excipientes à base de lipídios

A Package of Established Analytical Tools to Investigate the Solid-State Alteration of Lipid-Based Excipients

Os excipientes à base de lipídios (LBEs) são de baixa toxicidade, biocompatíveis e de base natural, e sua aplicação suporta a sustentabilidade da fabricação farmacêutica. No entanto, o grande desafio é o seu estado sólido instável, afetando a estabilidade do produto farmacêutico. As propriedades físicas críticas dos lipídios para seu processamento - como temperatura de fusão e viscosidade, reologia, etc. - estão relacionadas à sua estrutura molecular e sua cristalinidade. Os aditivos, bem como o estresse térmico e mecânico envolvido no processo de fabricação, afetam o estado sólido dos lipídios e, portanto, o desempenho dos produtos farmacêuticos dos mesmos. Portanto, compreender a alteração no estado sólido é crucial. Neste trabalho, a combinação de difração de raios X em pó e calorimetria exploratória diferencial (DSC) é introduzida como padrão-ouro para a caracterização do estado sólido dos lipídios. A difração de raios X é o método mais eficiente para rastrear o polimorfismo e o crescimento de cristais. O arranjo polimórfico e o comprimento da lamela são caracterizados nas regiões de grande e pequeno ângulo da difração de raios X, respectivamente. A região de espalhamento de raios X de pequeno ângulo (SAXS) pode ser usada para investigar o crescimento de cristais. A transição de fase e a separação podem ser indicadas. O DSC é usado para rastrear o comportamento térmico dos lipídios, estimar a miscibilidade de aditivos e/ou ingredientes farmacêuticos ativos (IFA) na matriz lipídica e fornecer diagramas de fase. Quatro estudos de caso são apresentados em que os LBEs são usados como material de revestimento ou como matriz de encapsulamento para fornecer sistemas multiparticulados revestidos de lipídios e nanosuspensões lipídicas, respectivamente. O estado sólido lipídico e sua potencial alteração durante o armazenamento são investigados e correlacionados com a alteração na liberação do IFA. Métodos microscópicos qualitativos, como microscopia de luz polarizada e microscopia eletrônica de varredura, são ferramentas complementares para investigar a cristalização em nível micro. Devem ser acrescentados outros métodos analíticos com base no processo de fabrico seleccionado. A relação estrutura-função-processabilidade deve ser entendida cuidadosamente para projetar produtos farmacêuticos robustos e estáveis à base de lipídios.

Correlação entre a transição polimórfica de lipídios e a liberação de API em cristais de API revestidos de lipídios: Os cristais API revestidos com monoestearato de glicerol são medidos via DSC e raio-x diretamente após o revestimento e após 3 meses de armazenamento em condições aceleradas (40 °C, 75% de umidade relativa)7. O monoestearato de glicerila é um sistema multifásico contendo 40%-55% de monoglicerídeos, 30%-45% de diglicerídeos e 5%-15% de glicerídeos, princi...

Esta publicação mostra a aplicação da difração de raios X e da calorimetria exploratória diferencial como padrão-ouro para investigar o estado sólido de excipientes à base de lipídios (LBEs). Compreender a alteração do estado sólido em LBEs e seu efeito sobre o desempenho de produtos farmacêuticos é o fator-chave para a fabricação de formas de dosagem robustas à base de lipídios.

Um pacote de ferramentas analíticas estabelecidas para investigar a alteração do estado sólido de excipientes à base de lipídios

Lipid-based excipients (LBEs) are low-toxic, biocompatible, and natural-based, and their application supports the sustainability of pharmaceutical ...

A combinação de calorimetria exploratória diferencial e difração de raios X é um padrão-ouro para alterações investigadas no estado sólido de produtos farmacêuticos à base de lipídios. A metodologia combinada é uma forte ferramenta para o rastreamento do polimorfismo, crescimento cristalino e transição facial de lipídios combinados com a triagem, o comportamento terminal e a visibilidade do fármaco com matriz lipídica. Essa metodologia pode ser utilizada para compreender a interação entre o estado sólido do lipídio e o desempenho de seu produto farmacêutico.Tais produtos podem ser variados, desde formulações nanolipídicas até comprimidos matriciais. O procedimento será realizado por Gerfried Luschin-Ebengreuth. Gerfried é um cientista do nosso laboratório.Para começar, ligue o fornecimento de gás nitrogênio e defina a pressão entre 0,2 e 0,5 bar. Ligue o instrumento de calorimetria exploratória diferencial ou DSC e o trocador automático de amostras. Abra o software e clique no botão sim para ativar o modo de espera e, em seguida, clique em exibir sinais.Aguarde uma calibração do dispositivo por pelo menos uma hora. Purgar o forno com azoto. Clique no ícone do novo método e vá para a definição do método.Quando a janela de visão geral for aberta, ative a opção de modulação de temperatura. Vá para a guia de cabeçalho e selecione o método clicando em exemplo. Vá para o programa de temperatura da guia.Selecione purgar dois MFC e MFC protetor ambos a 50 mililitros por minuto. Definir o modo de espera a 20 graus Celsius, ciclo de aquecimento a cinco kelvin por minuto de 20 graus Celsius acima da temperatura de fusão da retenção isotérmica lipídica a esta temperatura durante cinco minutos. Ciclo de resfriamento a zero grau Celsius a cinco Kelvin por minuto.Defina a temperatura final de redefinição de emergência a uma temperatura de 10 graus Celsius acima da temperatura mais alta do programa e a temperatura final de espera a 20 graus Celsius. Vá para a guia calibração e selecione o arquivo de temperatura e sensibilidade apropriado. Salve o método.Pesar três a quatro miligramas de cada amostra em cadinhos de alumínio e registar o peso exacto carregado em cada cadinho. Sele o cadinho de alumínio com uma tampa perfurada. Coloque os cadinhos na bandeja do amostrador automático e ative o modo de amostrador automático no software e no método relacionado de carga para cada amostra.Preencha a posição da amostra, o nome e o peso da amostra de cada amostra, bem como a posição do cadinho de referência na janela de visualização do tabuleiro de amostras. Inicie a medição. Abra os dados brutos usando o software para análise de dados e plante a temperatura versus o fluxo de calor clicando no botão X tempo, X temperatura.Na janela exibida, clique em ocultar segmentos isotérmicos. No lado esquerdo da tela, selecione apenas as curvas a serem analisadas. Verificar o comportamento térmico dos lipídios como eventos endotérmicos e exotérmicos de energia absorvida ou liberada na forma de calor, respectivamente, em função da temperatura.Clique na curva seguida de avaliação e área. Para calcular a entalpia de fusão como a área sob a curva de endotermas. Selecione os limites de integração movendo as linhas verticais em torno de dois a três graus Celsius antes e depois do início e do ponto final do pico.Selecione uma linha de base linear para a integração de pico. A área entre a curva e a linha de base é proporcional à mudança na entalpia. Clique em aplicar para concluir o cálculo.Da mesma forma, calcule a entalpia de cristalização como a área sob a curva de exotérmicos. Determine o início da temperatura de fusão ou do início em T clicando na curva a ser analisada. E depois na avaliação e no início.Selecione os limites de quantificação movendo as linhas verticais para a seção mais reta da curva. Isso geralmente é em torno de cinco a 10 graus Celsius antes e depois do pico. Em seguida, determine a temperatura de fusão ou TM clicando na curva a ser analisada.Seguido de avaliação e pico, o valor obtido é o pico máximo. Use um sistema de espalhamento de raios-X composto por uma câmera de foco de ponto fixada a um gerador de raios-X de tubo selado e equipada com uma unidade de controle e software relacionado. Use dois detectores sensíveis posicionados linearmente para cobrir regiões de dispersão de raios-X pequenas e grandes angulares.Ligue o sistema de água de arrefecimento na unidade de controlo, na bomba de vácuo, nas válvulas de gás e no sistema de controlo de potência e segurança. Em seguida, ligue as válvulas de controle de tensão e purga para os detectores em um fluxo de gás entre 10 a 20 mililitros por minuto. Ligue o tubo de raios X e a opção de espera e aguarde aproximadamente 10 minutos.Desligue o modo de espera e ligue o tubo de raios-X para a potência máxima, que é maior que 50 quilovolts. Aguarde pelo menos 30 minutos. Inicie o software de controle e clique em redefinir TPF.Em seguida, escolha o filtro de tungstênio e defina a posição. Vá para a posição para fixar a posição do filtro de tungstênio. Encher as amostras em capilares de vidro especiais com um diâmetro externo de aproximadamente dois milímetros, evitando qualquer aprisionamento de ar nos capilares.Sele o capilar de vidro com cera e coloque-o cuidadosamente no suporte capilar. Ligue o motor para a rotação da amostra e feche a válvula de vácuo e aguarde até que a pressão esteja abaixo de cinco milibares. No software, selecione uma resolução de posição de 1024 para ambos os detectores e defina o tempo de exposição para 1.200 segundos.Clique nas ferramentas de toque para configurar os limites de energia, clique em definir limites de energia e resoluções e reinicie. Defina os limites de energia para uma faixa adequada entre 400 e 900. Abra o obturador de segurança e inicie a medição.Certifique-se de que a janela de medição mostre um máximo de 80 contagens por segundo. Se isso não for dado, adapte a posição do filtro. Exporte os dados como arquivos P00.Os dados consistem na intensidade de transmissão e absorção versus o número do canal. Transfira os dados para avaliação para um software estatístico e corrija os dados normalizando as intensidades usando a massa de dispersão medida com o filtro de tungstênio. Crie um gráfico de intensidade normalizada versus duas vezes o ângulo de difração.Use a função de leitor de tela para encontrar picos de difração em ambos os ângulos de dispersão de raios-X de pequeno ângulo ou SAXS e espalhamento de raios-X de amplo alcance ou regiões WAXS. Aplique a equação de brags para calcular os picos de difração para os quais a intensidade máxima foi alcançada em interação ou espaçamentos. Calcule as razões da posição de pico da região SAXS para descobrir a simetria cristalina dos lipídios e use o pico de difração principal da região SAXS para quantificar a espessura cristalina.Encaixe o pico em uma função gaussiana através de quadrados alugados clássicos e obtenha a largura total na metade máxima clicando em picos de análise e linhas de base, analisador de pico, diálogo aberto. Na janela exibida, selecione a opção Ajustar Picos Pro. Selecione uma linha de base constante com Y igual a zero.Selecione o pico de difração principal da região SAXS. Clique no controle de ajuste para selecionar os parâmetros de ajuste de pico. Escolha a função Gauss Amp.Defina os parâmetros Y zero XC1 e A1 como fixos e ajuste os dados. Obtenha a largura total na metade máxima do ajuste. Finalmente, use a equação mais segura para calcular a espessura cristalina.As configurações de bifurcação e cadeira de uma molécula de triacilglicerol, a subcélula, a Lamela e a plaqueta cristalina são mostradas aqui. A imagem representativa mostra os padrões de espaçamento curto e longo da forma alfa das regiões Tripalmitin e WAXS e SAXS. O mesmo para o formulário beta é mostrado nesta imagem.O ingrediente farmacêutico ativo ou cristais API codificados com monoestearato de glicerol são medidos via DSC e raios-x diretamente após o revestimento e após três meses de armazenamento em condições aceleradas. Os dados de DSC de amostras após três meses de armazenamento sob aceleração mostram que uma endoterma no início T é igual a 55,7 graus Celsius com dois eventos sobrepostos a 60,2 graus Celsius para o derretimento da forma alfa restante e na MT é igual a 63,8 graus Celsius como o principal evento para o derretimento da forma beta. A transição polimórfica é confirmada com os dados de raios-x, detectando os espaçamentos D curtos típicos da forma beta combinados com a redução da espessura da Lamela devido à inclinação molecular.Alteração significativa nos perfis de liberação também foi observada, o que pode ser explicado pela evidente transformação polimórfica da forma alfa para a forma beta com um arranjo subcelular mais denso, resultando em uma superfície repelente à água. Dados de DSC, dados de raios-X e um perfil de liberação de API de Cristais de API codificados com PG13C16C18 parcial diretamente após a codificação e após três meses de armazenamento em condições aceleradas são mostrados aqui. A análise do DSC das amostras armazenadas revelou termogramas inalterados, que não apresentam polimorfismo e separação de fases.O estado sólido estável de PG3C16C18 parcial foi confirmado pelos padrões radiográficos. A região WAXS mostra um pico correspondente a um espaçamento curto de D igual a 4,15 angstrom e T0 em amostras armazenadas associadas à forma alfa. A região SAXS revelou um pico principal inalterado em um longo espaçamento D de D igual a 63,7 angstrom correspondendo a uma estrutura de lamela com duas configurações L.O estado sólido estável da matriz lipídica resulta no perfil de liberação estável de API da codificação. Para fornecer dados de raios-X de alta qualidade, é importante evitar o aprisionamento entre as partículas ao preencher os capilares. Também para selecionar um tempo de exposição que é baseado no tipo de amostra e no equipamento disponível.Durante o desenvolvimento de novos produtos farmacêuticos, a triagem do estado sólido dos lipídios e sua interação com o IFA é usada para selecionar o processo de fabricação adequado e prever a estabilidade do produto.

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Química

Nós introduzimos um ensaio de fluorescência baseada rápido que monitora a taxa de extinção de fluorescência como uma medida da atividade do canal gramicidin. Os canais gramicidin são usados ​​como transdutores de força molecular para monitorar as mudanças nas propriedades bicamada lipídica como sentiu por proteínas bicamada de expansão.

Gramicidina baseado em Ensaio de fluorescência; para determinar Moléculas Pequenas Potencial para Modificação de Propriedades bicamada lipídica

Este vídeo demonstra uma técnica de microgravimetria dissipativa para investigar a ligação de proteínas a bicamadas lipídicas. Pequenas vesículas unilamelares são adicionadas para revestir a superfície do sensor de quartzo de uma microbalança. Utilizando a ligação dependente de íons cálcio da proteína alvo de ligação a fosfolipídios à bicamada, as mudanças na frequência de oscilação do sensor e a dissipação da oscilação são monitoradas para determinar a natureza da ligação da bicamada...

Técnica de Microgravimetria Dissipativa para Estudo da Interação Proteína-Bicamada Lipídica

O uso de fluoróforos para imagens in vivo pode ser bastante limitado por opsonização, depuração rápida, baixa sensibilidade de detecção e efeitos citotóxicos no hospedeiro. O encapsulamento de fluoróforos em lipossomas por hidratação e extrusão de filme leva à extinção e proteção de fluorescência, o que permite imagens in vivo com alta sensibilidade de detecção.

Fluorescência-têmpera de um Fluoróforo encapsulado em lipossomas Near-infrared como ferramenta para In Vivo Imageamento óptico

Descrevemos um protocolo para preparação de bicamadas lipídicas suportadas e sua caracterização usando microscopia de força atômica e espectroscopia de força.

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Muitas (fosfo)lipases previstas são mal caracterizadas em relação às suas especificidades de substrato e funções fisiológicas. Aqui fornecemos um protocolo para otimizar as atividades enzimáticas, procurar substratos naturais e propor funções fisiológicas para essas enzimas.

Definindo substrato Especificidades para a lipase e fosfolipase candidatos

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Este artigo descreve os protocolos de preparação de amostras, redução de dados e análise de dados em estudos de eco de giro de nêutrons (NSE) de membranas lipídicas. A rotulagem criteriosa de deutério de lipídios permite o acesso a diferentes dinâmicas de membrana em comprimento mesoscópico e escalas de tempo, sobre as quais ocorrem processos biológicos vitais.

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Este protocolo descreve a formação de células imitando vesículas uni-lipídicas e multi-lipídicas, bicamadas lipídicas suportadas e bicamadas lipídicas suspensas. Estes modelos in vitro podem ser adaptados para incorporar uma variedade de tipos lipídes e podem ser usados para investigar várias interações de moléculas e macromoléculas.

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Um pacote de ferramentas analíticas estabelecidas para investigar a alteração do estado sólido de excipientes à base de lipídios (Vídeo) | JoVE Journal

Um pacote de ferramentas analíticas estabelecidas para investigar a alteração do estado sólido de excipientes à base de lipídios

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