Multimer-PAGE para separação de complexos de proteínas nativas: uma técnica de separação híbrida que consiste em Blue Native-PAGE e SDS-PAGE para separar proteínas multiméricas intactas do lisado tecidual

Os complexos proteicos multiméricos são essenciais para vários processos biológicos.

Para separar os complexos de proteínas em seu estado nativo por multímero-PAGE, pegue lisado de tecido contendo os complexos desejados. Carregue o lisado em um conjunto de gel para PAGE nativo azul.

Encha o sistema com um tampão alcalino contendo corante aniônico azul e conecte-o à fonte de alimentação. Em um pH alcalino, as moléculas de corante se ligam ao complexo proteico, conferindo-lhe uma carga negativa geral sem desnaturar. Este complexo proteico intacto e carregado negativamente migra através do gel como uma faixa azul.

Após uma corrida mínima e permitindo que a proteína intacta migre para o gel de resolução, excise a tira que contém o complexo. Incubar a tira em uma solução contendo um agente de reticulação para permitir que seus grupos reativos interajam com os grupos amina da proteína proximal, estabilizando o complexo multimérico.

Substitua a solução de reticulação por um reagente de têmpera para diminuir a atividade dos reticuladores não reagidos. Adicione SDS - um detergente aniônico - que confere uma carga negativa uniforme ao complexo proteico intacto, preservando seu tamanho e composição nativos.

Coloque a tira tratada em um novo e reformule-a em um novo gel SDS-PAGE. Durante a eletroforese, o complexo de proteínas reticuladas carregadas negativamente migra em direção ao ânodo positivo e aparece como uma banda de alto peso molecular no gel.

Para iniciar este procedimento, prepare-se para a eletroforese em gel de poliacrilamida nativa azul, conforme descrito no protocolo de texto. Conecte os eletrodos à fonte de alimentação e eletroforse as proteínas no gel a 150 volts, até que a banda de corante progrida aproximadamente 2 centímetros na camada de resolução. Neste ponto, pare e desconecte a fonte de alimentação.

Depois de desmontar o aparelho de eletroforese, separe os painéis de vidro do de gel. Remova e descarte a camada de empilhamento.

Corte cuidadosamente o gel, logo abaixo da borda inferior da frente do corante, tomando cuidado para que esse corte seja o mais liso e reto possível. Em seguida, descarte o pedaço de gel não utilizado. Apare todas as porções não utilizadas ao longo das bordas da tira de gel.

Coloque cuidadosamente a tira em 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato em um pequeno recipiente e misture delicadamente por nutação por 30 minutos para equilibrar. Após o equilíbrio, descarte e substitua o PBS por mais 10 mililitros.

Pipete 500 microlitros de DSP 25 milimolares dissolvidos em dimetilsulfóxido no PBS e continue misturando como antes, por 30 minutos. Após 30 minutos, despeje a solução DSP. Adicione 10 mililitros de Tris-HCl 0,375 molar, pH 8,8, contendo 2% de dodecil sulfato de sódio, para extinguir o DSP não reagido. Continue a nutação por 15 minutos.

Enquanto a tira de gel está resfriando, prepare as soluções de gel SDS-PAGE de acordo com os métodos padrão. Não adicione os reagentes de polimerização. Após a têmpera, retorne a tira de gel nativo azul à temperatura ambiente e funda a tira em um novo de gel.

Para fazer isso, pegue cuidadosamente o gel e coloque-o em uma placa espaçadora de de gel limpa. Oriente a tira de forma que ela seja invertida de sua orientação anterior e a parte inferior da frente da tinta fique mais próxima da parte superior do novo.

Coloque a tira de forma que sua borda superior fique nivelada com a borda superior da placa de cobertura. Certifique-se de que a frente da tinta esteja paralela às bordas horizontais da placa de vidro. Empurre um lado da tira excisada contra uma das paredes espaçadoras, deixando espaço do outro lado para que o gel seja derramado e um padrão de proteína ou escada seja carregado. Se a borda inferior da tira de gel contiver áreas irregulares ou irregulares, corte-as com cuidado.

Assim que a tira de gel estiver posicionada corretamente, coloque a placa de cobertura sobre a placa espaçadora. Aplique uma leve pressão para empurrar para fora as bolhas de ar presas. Continue a montar o aparelho de vazamento de gel, de acordo com as instruções do fabricante.

A tira de gel às vezes se desloca quando a placa superior está sendo colocada. Ajuda a deixar a tira pendurada um pouco na borda da placa superior, para que possa ser ajustada com uma espátula para corrigir quaisquer deslocamentos.

Adicione reagentes de polimerização ao tampão de gel de resolução e despeje-o no de gel preparado usando uma pipeta sorológica. Encha o de gel até aproximadamente 2 centímetros abaixo da tira de gel nativa azul excisada PAGE para deixar espaço para a camada de empilhamento. Em seguida, adicione 100 microlitros de butanol por cima do gel derramado e aguarde 30 minutos para a polimerização da camada de resolução antes de despejar o butanol.

Em seguida, adicione os reagentes de polimerização à solução de gel de empilhamento. Usando uma pipeta sorológica, despeje a camada de empilhamento para preencher todos os espaços vazios restantes no de gel. Incline o de gel à medida que a camada de empilhamento é derramada, para que ele preencha o espaço abaixo da tira de gel e as bolhas de ar não fiquem presas.

À medida que o buffer de gel de empilhamento preenche o espaço vazio abaixo da tira de gel, retorne gradualmente o de gel para o nível da base. Continue a preencher o espaço vazio ao lado da tira de gel excisada com o tampão de gel de empilhamento, até que quase transborde. Em seguida, deixe a camada de empilhamento polimerizar por 30 minutos.

Após a polimerização da camada de empilhamento, remova o de gel do aparelho de vazamento, enxágue com água destilada e monte o aparelho de eletroforese, de acordo com as instruções do fabricante.

Encha a câmara interna completamente com 1X SDS-PAGE buffer de corrida. Em seguida, encha a câmara externa até o nível indicado pelo fabricante. Carregar o espaço junto à tira de gel excisada com uma escada de peso molecular ou com o padrão proteico adequado.

Conecte os eletrodos à fonte de alimentação e eletroforese as amostras a 120 volts. Quando o corante Coomassie sair do gel, pare a corrida e desconecte a fonte de alimentação. Analise o gel usando métodos padrão de eletroblotting e detecção de proteínas baseada em anticorpos.