Name: Aplicação de codificados geneticamente fluorescente óxido nítrico (NO •) Sondas, as geNOps, para imagens em tempo real de NO • Os sinais em células individuais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprenda a usar sondas geNOps para imagem em tempo real de óxido nítrico em células individuais por microscopia de fluorescência. Este método permite visualizar sinais de NO• com alta resolução espacial e temporal em células endoteliais.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores agradecem a C.J. Edgell, Departamento de Patologia da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill, NC, EUA por fornecer as células EA.hy926. O autor E.E. é apoiado pela Nikon Áustria no Centro de Excelência da Nikon, Graz, e é membro do programa de Ph.D. em Medicina Molecular da Universidade Médica de Graz. Os pesquisadores também são apoiados pelo Ph.D. programa de Doenças Metabólicas e Cardiovasculares (DK-W1226) da Universidade Médica de Graz. Este trabalho também foi financiado pelo projeto FWF P 28529-B27. O equipamento microscópico faz parte do Centro de Excelência da Nikon, em Graz, que é apoiado pelo programa de infraestrutura austríaco 2013/2014, Nikon Austria Inc. e BioTechMed, Graz.

1. Preparação de tampões e soluções químicas <ol><li> Preparar um tampão de armazenamento contendo NaCl 135 mM, KCl 5 mM, CaCl 2 2 mM, MgCl 2 1 mM, HEPES 10 mM, 2,6 mM de NaHCO3, 0,44 mM de KH 2 PO 4, 2 mM de Na 0,34 HPO 4, 10 mM de D- glucose, 2 mM de L-glutamina, 1x MEM de vitaminas, ácidos aminados 1x MEM, 1% de pen strep a 1% e anfotericina B. Dissolve-se todos os componentes em água destilada e agita-se o tampão durante 20 min usando um agitador magnético, à temperatura ambiente. Ajustar o pH a 7,44 com NaOH 1 M. Após a adição gota a gota de NaOH, medir o pH com um medidor de pH, enquanto continuamente mexendo. </li><li> Preparar um tampão de Ca 2+ molecular contendo fisiológico que consiste de NaCl 140 mM, KCl 5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl 2 mM, D-glicose 10 mM, 1, e 10 mM de HEPES. Ajustar o pH para 7,4 utilizando NaOH como descrito na etapa 1.1. </li><li> Preparar um tampão livre de Ca 2+ que consiste dos mesmos ingredientescomo listado no passo 1.2. Use 1 mM EGTA em vez de 2 mM. </li><li> Solubiliza-se Fura-2:00 em DMSO para se obter uma solução de estoque 1 mM. Alíquota da solução estoque em tubos de ensaio hermeticamente fechado e armazenar a -20 ° C durante até um mês. Se congelado, permitir que a solução de reserva a equilibrar à temperatura ambiente durante pelo menos 1 hora ao abrigo da luz. Dilui-se a solução stock de Fura-2:00 em 1 mL de tampão de armazenamento (passo 1.1) para se obter uma concentração final de 3,3 uM. </li><li> Prepare 1 ml de uma solução de estoque de histamina 100 mM em água destilada (pH 7,0). Dilui-se a solução estoque 100 mM de histamina em 100 ml de Ca 2+ molecular contendo tampão fisiológico para uma concentração final de 100 pM de histamina. </li><li> Solubiliza-Nco-nitro-L-arginina (L-NNA) em 100 ml de tampão fisiológico contendo cálcio para se obter uma concentração final de 300 uM. Armazenar as soluções a 37 ° C banho de água durante pelo menos 1 hora até que a L-NNA esteja completamente dissolvido. </li><li> Solubiliza-se 10 mg de 7-NOC em WA destiladaTer (pH 7,0) para se obter uma solução de reserva 10 mM. Alíquota da solução estoque em pequenas alíquotas em frascos hermeticamente fechados e imediatamente a -70 ° C. Dilui-se a solução estoque CON-7 num tampão fisiológico para obter uma concentração final de 10 uM CON-7. NOTA: CON-7 é um composto químico pequeno que liberta espontaneamente NO, com uma meia-vida curta. Sempre preparar os buffers de trabalho que consiste apenas NOC-7 antes de cada experiência. </li><li> Adicione uma solução 1 mM de nitroprussiato de sódio (SNP) num tampão fisiológico de cálcio e preparar uma diluição de 10 uM. NOTA: Sempre preparar pequenas quantidades (~ 10 ml) de soluções de dador de NO, devido à taxa de degradação rápida. </li><li> Prepara-se uma solução de fosfato tamponada (PBS) que consiste em 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 9,2 mM de Na 2 HPO 4, 1,5 mM e KH 2 PO 4. Ajustar o valor de pH a 7,44 com NaOH / HCI. </li></ol> 2. Preparação de células NOTA: Em order para alcançar a uniformidade no desempenho de medição do óxido nítrico (NO •) em células individuais utilizando geNOps, as células têm de ser pré-incubada com o ferro (II) / vitamina C que contém tampão antes para experiências de imagiologia de modo a restaurar a Fe 2+ dentro do nO • domínio ligaï¿½o ao do nO • -probes. No caso de células EA.hy926 e HEK293, incubação durante 20 min com a solução de reforço de ferro (II) conduz a activação completa do NO • sensores. <ol><li> Semente de 5,5 x 10 5 EA.hy926 ou células HEK293 para o dia seguinte ou 3,5 x 10 5 células para o dia após dia seguinte, em 30 mm vidros de cobertura do microscópio em um poço de uma placa de 6 poços. Incubar as células a 37 ° C num ambiente humidificado com 5% de CO 2. NOTA: as informações detalhadas sobre a infecção adenoviral de células de mamíferos e construção de vírus foi descrito por Zhang et ai. 25. Esta etapa não se aplica para as células HEK 293 que expressam de forma estável G-geNOp. </li><li> Tome soro fetal de vitelo (FCS) e águia meio modificado por Dulbecco (DMEM) isento de antibiótico e adicionar adeno-associado tipo de vírus 5 (AAV5) vector que transporta o gene que codifica para o G-geNOp (MOI: 500 para células EA.hy926 produzem quase 100 % de células positivas; MOI: 1 é eficiente para células HEK293). NOTA: O uso de vetores virais adeno-associados é atribuído ao grupo de risco 2. Biossegurança confinamento de grau 2 é geralmente necessária para o trabalho com este vector. Se necessário, a infecção pelo vírus também pode ser realizado em FCS contendo meio. Alternativamente, as células podem ser transfectadas transientemente utilizando transportadores à base de lípidos 1. </li><li> Remover o meio de cultura e lavar as células com pré-aquecido (37 ° C) PBS. Adicionar 1 ml de meio DMEM / AAV5 em cada cavidade durante 1 hora. Esta etapa não se aplica para as células HEK 293 que expressam de forma estável G-geNOp. </li><li> Adicionar 1 ml de FCS a 20% contendo DMEM em cada poço a uma concentração final de 10% de FCS. Não remova a mídia AAV5 contendo a partir das células. cavalheiroLY oscilar a placa para homogeneizar o meio dentro dos poços. Incubar as células durante 48 h a 37 ° C num ambiente humidificado com 5% de CO 2. Esta etapa não se aplica às células HEK 293 que expressam de forma estável G-geNOp. </li><li> Após 48 horas, lavar as células com PBS pré-aquecido. Subsequentemente, adicionar 2 ml de tampão pré-aquecido de armazenamento (secção 1.1) a cada poço e incubar as células na sala TA durante pelo menos 1 hr protegido contra a radiação da luz. </li><li> Substituir o tampão de armazenamento com 1 ml / poço de a (II) de ferro de reforço solução à temperatura ambiente (RT). Incubar as células durante exactamente 20 min no escuro. NOTA: Não exceda ou reduzir o tempo de incubação ideal, pois isso pode afetar a capacidade de resposta dos não • sondas. </li><li> Lave as células uma vez com tampão de armazenamento e incubar cada poço com 2 ml de tampão de armazenamento durante pelo menos 2 horas à temperatura ambiente, a fim de permitir que as células se equilibre. </li><li> Substituir o tampão de armazenamento com 3,3 fiM de Fura-2:00 em tampão de armazenamento de 1 ml durante 45 min à temperatura ambiente, protegidada luz. </li><li> Lavar as células duas vezes com o tampão de armazenamento e incubar, mais uma vez durante pelo menos 30 minutos, a fim de permitir que as células se equilibre. </li></ol> 3. Imagens de células vivas de NO • e Ca 2+ Signals em células individuais <ol><li> Corrigir um 30 milímetros tampa de deslizamento revestido com células EAhy.926 ou HEK293 (do passo 2.1) em um compartimento metálico perfusão e colocá-lo no microscópio. Ligar o tubo de afluxo para os reservatórios de tampão e o efluxo de uma bomba de vácuo. Garantir um fluxo consistente e evitar a drenagem do lamela. </li><li> Inicie a perfusão conduzido por gravidade com tampão fisiológica de cálcio (a partir do passo 1.2), utilizando um sistema de perfusão semi-automático. NOTA: Este sistema consiste de reservatórios de tampão, os respectivos tubos, válvulas magnéticas que são controlados electronicamente e uma bomba de vácuo (ver Figura 1B). O caudal pode variar de 1 a 3 ml / min, dependendo da altura dos reservatórios de perfusão. Para apli drogas locais consistentescação, a taxa de fluxo de todos os reservatórios utilizados deve ser aproximadamente igual. Isto deve ser testado antes de experiências de imagiologia. Considere-se que células endoteliais responder a um aumento da tensão de corte, que pode ser induzida por perfusão rigorosa. </li><li> Ligue o sistema de imagem e permitir que o warm up de todos os dispositivos para 30 min. </li><li> Definir as configurações de imagem usando respectivo software. Select excitação comprimento de onda de 340 nm e 380 nm para o fura-2 de imagem e 480 nm para excitar G-geNOp. Para minimizar a fluorescência de branqueamento aumentar o binning câmera para 4 e reduzir a intensidade de excitação e tempos de exposição. Veja também os passos 3,6-3,8. NOTA: As configurações de imagem e parâmetros dependem dos dispositivos utilizados, fura-2 eficiência de carregamento e os níveis de expressão G-geNOp. </li><li> Selecione a região de imagem movendo-table xyz a do microscópio até várias células fluorescentes estão no foco. Em seguida, definir regiões de interesse (ROI) por meio da respectiva ferramenta de software. Desenhe regiões que abrangem diversos toda single células fluorescentes por campo de imagem manualmente. Além disso, definem uma região de fundo de tamanho semelhante. NOTA: Uma vez que as imagens tenham sido adquiridos e armazenados ROIs também pode ser definida recentemente, após o processo de imagem para análise posterior usando respectivo software de análise de imagem (veja Lista de Materiais). </li><li> Iniciar a recolha de dados sobre um microscópio de fluorescência invertida e avançado com uma fase de amostra motorizado, e uma fonte de luz monocromática. Alternadamente excita a 340 nm e 380 nm para Fura-02:00 e 480 nm para o G-geNOp, respectivamente. Definir os respectivos tempos de exposição de modo que para todos os canais, um sinal de fluorescência claro é detectável ao longo do tempo. Consulte também o passo 3.4. NOTA: Este depende da intensidade da luz de excitação e a criação de faixas de câmara. Por exemplo, usar 15% da intensidade da luz de excitação, um binning câmera de 4 e 150 ms para 340 nm, 50 ms para 380 nm, e 300 ms para 480 nm. Consulte também o passo 3.4. </li><li> Recolhe a luz emitida a 510 nm para o fura-2 / AM, 520 nm para o G-Genop utilizando um dispositivo de câmara de carga acoplada (CCD) com o conjunto de filtro apropriado que consiste na excitação 500 nm, uma dicróica 495 nm e um emissor de 510-520 nm. Gravar um quadro total de cada 3 s. </li><li> Registam-se os primeiros minutos (se necessário até 3 minutos) em tampão fisiológico de Ca2 + (1,2) para se obter a linha de base dos respectivos sinais de fluorescência ao longo do tempo. </li><li> Uma vez que uma linha de base estável de fluorescência é observado, alternar a 100 uM de histamina ou ATP (1? M ou 100? M) contendo tampão fisiológica de Ca 2+ para estimular as células durante 3 min. NOTA: As células EA.hy926 que respondem aos agonistas mostram um aumento acentuado do rácio de fura-2 (fluorescência excitada a 340 nm dividida pela fluorescência animado em 380 nm) e uma diminuição clara do sinal de fluorescência G-geNOp. </li><li> Voltar para o tampão fisiológico Ca 2+, sem histamina ou ATP e L-NNA por 5 min para remover os compostos a partir das células. Esta etapa pode ser prolongada até as FLUORESalterações cência são completamente recuperados. </li><li> Administrar 10 uM CON-7 em tampão fisiológico Ca 2+ durante 2 min utilizando o sistema de perfusão. O dador de NO afecta fortemente L-geNOp de fluorescência, que normalmente diminui por&gt; 20% em resposta a 10 uM CON-7. Em células EA.hy926 o efeito CON-7 é cerca de 3 vezes mais forte em comparação com a induzida por agonista L-geNOp fluorescência de têmpera. </li><li> Lavar o composto liberador de NO • por aproximadamente 10 min com Ca 2+ fisiológica tampão e parar a gravação, uma vez fluorescência basal é recuperado. </li></ol> Análise 4. Dados <ol><li> Exportação adquiridos dados de intensidade de fluorescência média de células individuais ao longo do tempo, para o software de análise de dados. </li><li> Subtrair respectivos valores de fundo e calcular o rácio de 340 nm, em 380 nm dos seus respectivos sinais de Fura-2 de cada única célula ao longo do tempo. </li><li> Subtrair os valores do canal L-geNOp fundo para obter o fl realuorescência intensidade da sonda NÃO (F) ao longo do tempo usando qualquer software de cálculo. </li><li> Aqui os valores da linha de base de fluorescência como F 0 (F 0 é a fluorescência da sonda de NO ao longo do tempo, sem estimulação). Veja também o passo 4.5 e Figura 1C. </li><li> Calcular uma função ao longo do tempo para que os efeitos de fluorescência de branqueamento utilizando a seguinte equação: F 0 = F inital • exp (K • Time) + F planalto. F inital: sinal de fluorescência máxima vez de imagem é iniciado; K: constante da taxa de fluorescência ao longo do tempo de branqueamento; Mínimo de fluorescência atingido por branqueamento ao longo do tempo;: plateau F Veja também as etapas de 4.3- 4.4 e Figura 1C. NOTA: Para o aproximação, todos os valores de fluorescência ao longo do tempo, antes e após a estimulação de células pode ser utilizado. Mais detalhes são especificados por Bentley et al. 27. </li><li> Para normalizar o sinal L-geNOp ao longo do tempo, calcular 1-F / F0 (Passos 4,3-4,5). Ver Figura 1C e 1D. </li></ol>

<ol><li>Eroglu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+novel+FP-based+probes+for+live-cell+imaging+of+nitric+oxide+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Development of novel FP-based probes for live-cell imaging of nitric oxide dynamics.</a> Nat Commun. 7, 10623(2016).</li>
<li>Bush, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+for+enhancer-dependent+assembly+and+activation+of+the+AAA+transcriptional+activator+NorR%5BTitle%5D)+AND+%22Mo.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The structural basis for enhancer-dependent assembly and activation of the AAA transcriptional activator NorR.</a> Mo. Microbiol. 95 (1), 17-30 (2015).</li>
<li>Cranfill, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 13 (7), 557-562 (2016).</li>
<li>D'Autréaux, B., Tucker, N., Spiro, S., Dixon, R. Characterization of the Nitric Oxide-Reactive Transcriptional Activator NorR. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Characterization+of+the+Nitric+Oxide-Reactive+Transcriptional+Activator+NorR">Globins and Other Nitric Oxide-Reactive Proteins, Part B</a>. Poole, ed.P. oole,R. .K. .,(ed)., 437, 1st edition, Elsevier textbooks, s.l. 235-251 (2008).</li>
<li>Strack, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sensors+and+probes%3A+Yes+to+genetically+encoded+NO%E2%80%A2+sensors">Sensors and probes: Yes to genetically encoded NO• sensors.</a> Nat Methods. 13 (4), 288(2016).</li>
<li>Auten, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+to+%27The+use+of+diaminofluorescein+for+nitric+oxide+detection%3A+Conceptual+and+methodological+distinction+between+NO+and+nitrosation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Response to 'The use of diaminofluorescein for nitric oxide detection: Conceptual and methodological distinction between NO and nitrosation.</a> Free Radic. Biol. Med. 50 (12), 1812(2011).</li>
<li>Sivaraman, G., Anand, T., Chellappa, D. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cplu.201402217/abstract">A Fluorescence Switch for the Detection of Nitric Oxide and Histidine and Its Application in Live Cell Imaging.</a> ChemPlusChem. 79 (12), 1761-1766 (2014).</li>
<li>Ye, X., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+nitric+oxide+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Detection of nitric oxide in single cells.</a> Analyst. 133 (4), 423-433 (2008).</li>
<li>Thyagarajan, B., Malli, R., Schmidt, K., Graier, W. F., Groschner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+inhibits+capacitative+Ca2%2B+entry+by+suppression+of+mitochondrial+Ca2%2B+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide inhibits capacitative Ca2+ entry by suppression of mitochondrial Ca2+ handling.</a> Br J Pharmacol. 137 (6), 821-830 (2002).</li>
<li>Germond, A., Fujita, H., Ichimura, T., Watanabe, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+development+of+genetically+encoded+fluorescent+sensors+to+monitor+intracellular+chemical+and+physical+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Biophy.+Rev%22%5BJournal%5D)">Design and development of genetically encoded fluorescent sensors to monitor intracellular chemical and physical parameters.</a> Biophy. Rev. 8, 121-138 (2016).</li>
<li>Malli, R., Eroglu, E., Waldeck-Weiermair, M., Graier, W. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Filling+a+GAP-An+Optimized+Probe+for+ER+Ca2%2B+Imaging+In+Vivo">Filling a GAP-An Optimized Probe for ER Ca2+ Imaging In Vivo.</a> Cell Chem Biol. 23 (6), 641-643 (2016).</li>
<li>Sato, M., Hida, N., Umezawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+nanomolar+range+of+nitric+oxide+with+an+amplifier-coupled+fluorescent+indicator+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging the nanomolar range of nitric oxide with an amplifier-coupled fluorescent indicator in living cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (41), 14515-14520 (2005).</li>
<li>Weidinger, A., Kozlov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Activities+of+Reactive+Oxygen+and+Nitrogen+Species%3A+Oxidative+Stress+versus+Signal+Transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Biological Activities of Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Oxidative Stress versus Signal Transduction.</a> Biomolecules. 5 (2), 472-484 (2015).</li>
<li>Paolo, S. Nitric Oxide in Human Health and Disease. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9780470015902.a0003390.pub2/abstract">Encyclopedia of life sciences</a>. , Wiley. Chichester. (2005).</li>
<li>Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+and+peroxynitrite+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease.</a> Physiol Rev. 87 (1), 315-424 (2007).</li>
<li>Bonafe, F., Guarnieri, C., Muscari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+regulates+multiple+functions+and+fate+of+adult+progenitor+and+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide regulates multiple functions and fate of adult progenitor and stem cells.</a> J Physiol Biochem. 71 (1), 141-153 (2015).</li>
<li>Forstermann, U., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthases%3A+regulation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthases: regulation and function.</a> Eur. Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).</li>
<li>Dudzinski, D. M., Igarashi, J., Greif, D., Michel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+and+pharmacology+of+endothelial+nitric+oxide+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The regulation and pharmacology of endothelial nitric oxide synthase.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 46, 235-276 (2006).</li>
<li>Zhou, L., Zhu, D. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+nitric+oxide+synthase%3A+structure%2C+subcellular+localization%2C+regulation%2C+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Neuronal nitric oxide synthase: structure, subcellular localization, regulation, and clinical implications.</a> Nitric Oxide. 20 (4), 223-230 (2009).</li>
<li>Aktan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iNOS-mediated+nitric+oxide+production+and+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation.</a> Life Sci. 75 (6), 639-653 (2004).</li>
<li>Ghafourifar, P., Cadenas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+nitric+oxide+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial nitric oxide synthase.</a> Trends Pharmacol Sci. 26 (4), 190-195 (2005).</li>
<li>Crane, B. R., Sudhamsu, J., Patel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+nitric+oxide+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Bacterial nitric oxide synthases.</a> Annu Rev Biochem. 79, 445-470 (2010).</li>
<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).</li>
<li>Kelm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+metabolism+and+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide metabolism and breakdown.</a> Biochim Biophys Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen-related+receptors+stimulate+pyruvate+dehydrogenase+kinase+isoform+4+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Estrogen-related receptors stimulate pyruvate dehydrogenase kinase isoform 4 gene expression.</a> J Biol Chem. 281 (52), 39897-39906 (2006).</li>
<li>Holzmann, S., Kukovetz, W. R., Windischhofer, W., Paschke, E., Graier, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+differentiation+between+endothelium-dependent+relaxations+sensitive+and+resistant+to+nitro-L-arginine+in+coronary+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic differentiation between endothelium-dependent relaxations sensitive and resistant to nitro-L-arginine in coronary arteries.</a> J Cardiovasc Pharmacol. 23 (5), 747-756 (1994).</li>
<li>Bentley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+calcium+regulates+coat+retention%2C+fusogenicity%2C+and+size+of+pre-Golgi+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Vesicular calcium regulates coat retention, fusogenicity, and size of pre-Golgi intermediates.</a> Mol Biol Cell. 21 (6), 1033-1046 (2010).</li>
<li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide%3A+a+unique+endogenous+signaling+molecule+in+vascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide: a unique endogenous signaling molecule in vascular biology.</a> Biosci Rep. 19 (2), 51-71 (1999).</li>
<li>Upreti, M., Kumar, S., Rath, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacement+of+198MQMDII203+of+mouse+IRF-1+by+197IPVEVV202+of+human+IRF-1+abrogates+induction+of+IFN-%CE%B2%2C+iNOS%2C+and+COX-2+gene+expression+by+IRF-1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Com%22%5BJournal%5D)">Replacement of 198MQMDII203 of mouse IRF-1 by 197IPVEVV202 of human IRF-1 abrogates induction of IFN-β, iNOS, and COX-2 gene expression by IRF-1.</a> Biochem Biophys Res Com. 314 (3), 737-744 (2004).</li>
<li>Lacin, E., Muller, A., Fernando, M., Kleinfeld, D., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Cell-based+Neurotransmitter+Fluorescent+Engineered+Reporters+%28CNiFERs%29+for+Optical+Detection+of+Neurotransmitters+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li>
<li>de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+gene+expression+in+response+to+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Na.+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Controlling gene expression in response to stress.</a> Na. Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).</li>
<li>Latchman, D. S. Transcriptional Gene Regulation in Eukaryotes. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9780470015902.a0002322.pub2/abstract">Encyclopedia of life sciences</a>. , Wiley. Chichester. (2005).</li>
<li>Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+cycle+transcription+during+G1+and+S+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of cell cycle transcription during G1 and S phases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).</li>
<li>Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+the+mitochondrial+proton+gradient+during+cytosolic+calcium+elevations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations.</a> J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).</li>
<li>Suarez, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+is+reduced+to+HNO+by+proton-coupled+nucleophilic+attack+by+ascorbate%2C+tyrosine%2C+and+other+alcohols.+A+new+route+to+HNO+in+biological+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide is reduced to HNO by proton-coupled nucleophilic attack by ascorbate, tyrosine, and other alcohols. A new route to HNO in biological media.</a> J Am Chem Soc. 137 (14), 4720-4727 (2015).</li>
<li>Kuropteva, Z. V., Kudryavtsev, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferrous-ascorbate+complexes+as+carriers+of+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Physiol+Biophys%22%5BJournal%5D)">Ferrous-ascorbate complexes as carriers of nitric oxide.</a> Gen Physiol Biophys. 16 (1), 91-96 (1997).</li>
<li>Vanin, A. F., Huisman, A., Stroes, E. S., Ruijter-Heijstek, F. C., Rabelink, T. J., van Faassen, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+capacity+of+mononitrosyl-iron-dithiocarbamate+complexes%3A+implications+for+NO+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Antioxidant capacity of mononitrosyl-iron-dithiocarbamate complexes: implications for NO trapping.</a> Free Radic Biol Med. 30 (8), 813-824 (2001).</li>
<li>Lindberg, R. A., Dewhirst, M. W., Buckley, B. J., Hughes, C. S., Whorton, A. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8760062">Ca2+-dependent nitric oxide release in endothelial but not R3230Ac rat mammary adenocarcinoma cells.</a> Am J Physiol. 271 (1), 332-337 (1996).</li>
<li>Campo, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SOD+mimic+MnTM-2-PyP%285%2B%29+reduces+hyaluronan+degradation-induced+inflammation+in+mouse+articular+chondrocytes+stimulated+with+Fe+%28II%29+plus+ascorbate%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The SOD mimic MnTM-2-PyP(5+) reduces hyaluronan degradation-induced inflammation in mouse articular chondrocytes stimulated with Fe (II) plus ascorbate.</a> Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1610-1619 (2013).</li>
<li>Waldeck-Weiermair, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/articles/23029314/">Spatiotemporal correlations between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signals using a novel red-shifted mitochondrial targeted cameleon.</a> PLOS ONE. 7 (9), 45917(2012).</li>
<li>Kuzkaya, N., Weissmann, N., Harrison, D. G., Dikalov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+peroxynitrite+with+uric+acid+in+the+presence+of+ascorbate+and+thiols%3A+implications+for+uncoupling+endothelial+nitric+oxide+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Interactions of peroxynitrite with uric acid in the presence of ascorbate and thiols: implications for uncoupling endothelial nitric oxide synthase.</a> Biochem Pharmacol. 70 (3), 343-354 (2005).</li>
<li>Liu, J., Hughes, T. E., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+35+amino+acids+and+fatty+acylation+sites+determine+the+molecular+targeting+of+endothelial+nitric+oxide+synthase+into+the+Golgi+region+of+cells%3A+a+green+fluorescent+protein+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The first 35 amino acids and fatty acylation sites determine the molecular targeting of endothelial nitric oxide synthase into the Golgi region of cells: a green fluorescent protein study.</a> J Cell Biol. 137 (7), 1525-1535 (1997).</li>
<li>Feron, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Endothelial+Nitric-oxide+Synthase-Caveolin+Regulatory+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Endothelial Nitric-oxide Synthase-Caveolin Regulatory Cycle.</a> J Biol Chem. 273 (6), 3125-3128 (1998).</li>
</ol>

EE, MW, RM e WFG, membros do pessoal da Universidade de Medicina de Graz, ter apresentado um pedido de patente do Reino Unido (número pedido de patente WO2015EP74877 20.151.027, número de prioridade GB20140019073 20.141.027) que descrevem partes da pesquisa neste manuscrito. Licenças relacionadas com esta patente são fornecidos para Next Generation Fluorescência de imagem (NGFI) GmbH ( <a href="http://www.ngfi.eu/" target="_blank">http://www.ngfi.eu/</a> ), uma empresa spin-off da Universidade de Medicina de Graz.

Desde a descoberta de NO • como uma importante molécula de sinalização em biologia 28, a medição em tempo real, específico do radical em células isoladas, tecidos e animais inteiros com alta resolução de uma forma viável e fiável foi aspirado. Aqui nós relatamos a aplicação de recentemente desenvolvidos geneticamente codificados fluorescentes Não • sondas (geNOps) que permitem exata de imagens ao vivo de células de NO • sinais usando microscopia de fluorescência de campo amplo 1. Para contornar procedimentos de transfecção elaborados e invasivos clone de células HEK que expressa de forma estável fluorescente verde G-geNOp foi utilizado para quantificar unicelulares exogenamente gerado não • perfis. Como as células HEK normalmente não produzem endogenamente • NO 29, este tipo de células é adequado para a geração de uma linha celular do sensor baseado no geNOp, que pode ser útil para muitas outras aplicações em condições de co-culturaSEM • produção de células primárias ou mesmo em animais 30 vivendo. No entanto, no presente estudo demonstram que a capacidade de vários compostos NÃO • -liberating, de diferentes concentrações e estabilidades, para evocar intracelulares não • sinais utilizando o modelo de células HEK expressando G-geNOp. Nossos dados revelaram que o NO • -donor concentração, qualidade e método de aplicação, eventualmente, determinar os padrões de não intracelulares • Perfis. Tal informação é indispensável para a caracterização in situ farmacocinético de diferentes Não • doadores, que são indicativos de várias doenças. Notavelmente, geNOps foram mostrados para responder de forma estável para aplicações múltiplas repetitivas de NO • -donor pulsos ao longo de um muito longo tempo 1. Assim, os experimentos utilizando NO • -liberating compostos aqui apresentados, permitem conclusões semi-quantitativos sobre as várias amplitudes e cinética da respectiva NO celular226; sinais (Figuras 1 e 2). Embora o clone de células HEK expressando de modo estável, provavelmente, tem origem a partir de uma única célula, uma grande heterogeneidade dos níveis de expressão G-geNOps foi observado (Figura 1). Esta é uma característica comum de clones celulares estáveis como a transcrição do gene (integrada no genoma) de interesse está sob o controlo de diversos factores, tais como diversas tensões ambientais 31 que influenciam taxas de crescimento da célula 32, e o estado do ciclo celular 33. Os únicos geNOps baseados em FP são sondas não-raciométrica e, portanto, a perda induzida NÃO • da intensidade de fluorescência aumenta com o nível de expressão geNOp 1. Por conseguinte, a normalização dos sinais geNOps é essencial para a quantificação celulares não • sinais particularmente no caso de uma análise comparativa. Como mostrado em nosso estudo recente, um rigoroso linear correlação bntre a intensidade de fluorescência basal de geNOps e a força da extinção de fluorescência induzida por NO • sobre uma ampla gama de intensidades de fluorescência foi encontrado um. Esta é uma característica importante do geNOps para a quantificação absoluta de celulares não • sinais. Como mostrado na Figura 1, a normalização dos sinais de G-geNOps em resposta a NOC-7 e SNP revelou homogéneos não • sinais em células HEK diferentes a partir da mesma placa, indicando que as células HEK não são diferentes no que diz respeito à sua capacidade para assumir e degradam o radical nO • que se origina a partir do nO • doador. Em contraste, usando geNOps em células HeLa demonstraram heterogeneidades claras de celulares não • sinais entre células diferentes em resposta a NOC-7. Estas diferenças apontam para não • taxas de metabolismo e decomposição de tipo específico de célula, que pode ter várias implicações na fisiologia celular e patologia, e pode ser descoberto usando o geNOps tecnologia. No entanto, duas características importantes de geNOps têm de ser cuidadosamente considerada para o uso correto dos sensores e interpretações de dados: i) geNOps exigem adequado de ferro (II) para responder plenamente à NO • 1 e ii) dependendo da variante FP, geNOps pode ser sensíveis ao pH 1. Descrevemos aqui um protocolo que foi encontrado para ser adequado para a suplementação de ferro não tóxico (II) de geNOps, as quais são expressas quer em células HEK, células HeLa ou células EA.hy926 (ver protocolo 2.6). Embora tenha sido demonstrado que o tratamento de células com ferro (II) / vitamina C não afectou a morfologia celular, a viabilidade celular e a actividade metabólica das células 1, que pode ser essencial para optimizar este passo importante para outros tipos de células e tecidos. No entanto, em algumas condições experimentais, o requisito de carga de ferro (II) pode limitar a aplicabilidade do geNOps. Notavelmente, tem sido mostrado que o ácido ascórbico pode reduzir NO • 35 e ascorbato de ferro (II) é capaz de limpar NO • 36, 37. Além disso, o excesso de ferro (II) e ascorbato pode induzir respostas inflamatórias 39 e eNOS desacoplar 41. Tais efeitos devem ser considerados quando se utiliza a tecnologia geNOps. Tem sido mostrado que, sob certas condições experimentais, o pH intracelular é afectada significativamente 34, que tem o potencial de influenciar o geNOps fluorescência 1. Notavelmente, as ciano e verde geNOps variantes são relativamente sensíveis ao pH que mostra uma diminuição da fluorescência após acidificação 1. Assim, alterações agudas do (sub) pH celular pode simular falsos NÃO • sinais ao usar os geNOps sensíveis ao pH. Como sugerido no nosso trabalho anterior, o uso paralelo de NÃO • geNOps insensíveis (geNOps mut) como contro negativols é recomendado para dissecar verdadeira celular NO • sinal do pH muda 1. Além disso alterações do pH celular pode ser inspeccionada utilizando sondas de pH, tais como Sypher 34. Além disso, o que visualizado enzimática endógena de NO • formação em resposta a um fisiológico Ca2 + -mobilizing agonista na célula endotelial EA.hy926 substituto. A linha de células EA.hy926 é um sistema modelo usado com freqüência consistentemente expressar eNOS 38. Uso de geNOps transitoriamente expressos em células EA.hy926, confirmou que a IP 3 mediada por sinais de Ca2 + evocar profunda NO • formação neste tipo de célula, que foi quase completamente bloqueada pelo L-NNA. Para correlacionar temporariamente Ca 2+ com NÃO • sinais, as células G-geNOp expressando foram carregados com o UV-excitável química Ca 2+ -Indicador fura-2 / AM. A separação espectral do Ca 2+ ligado e não ligado fura-2 fluo<html> rescência a partir do sinal L-geNOp pode ser facilmente conseguido com filtro comercialmente disponível 40 define. Imaging ambas as sondas revelou que o Ca 2+ Triggered enzimática NO • formação ocorre muito mais lento em comparação com aumento do Ca2 + citosólico neste tipo de células endoteliais. Cinética similar de uma única célula não • sinais em células endoteliais de artéria pulmonar bovina em cima do tratamento com células com a bradicinina agonista IP 3 -generating, bem como tensões de cisalhamento foram reportados utilizando NOA-1, um sensor altamente NO • sensível a indireta 12 . Por conseguinte, estes dados evidenciam que o Ca2 + -evoked derivado da eNOS NÃO • formação requer um certo tempo de partida até que a actividade enzimática completa seja alcançada. Embora a cinética celular de NO • formação, difusão e degradação pode ser extraído a partir de outros dados, por exemplo baseada em medições de tensão de NO induzida por relaxamento • vasoss = &quot;xref&quot;&gt; 26, o grande benefício de não fluorescentes • sondas é que convertem diretamente celulares não • flutuações em sinais visíveis em tempo real. Assim, imagiologia NÃO celular • sinais com geNOps proporciona alta resolução espacial e temporal, e oferece possibilidades únicas no (re) investigar a (sub) celular NO • homeostase. Por exemplo, a imagem latente da eNOS vaivém 42 em combinação com a tecnologia geNOps em células endoteliais individuais pode ser adequado para correlacionar NÃO • formação com a localização subcelular e translocação do NO • -producing enzima ou outras proteínas relevantes, tais como a calmodulina e caveolin 43. Aqui nós descrevemos a aplicação possível de G-geNOp expressando células HEK e EA.hy926 para visualizar exogenamente e endogenamente gerada celulares não • sinais no nível de uma única célula e em tempo real em um convencional amplo campo de fluorescência microscope. Os nossos dados implicam que geNOps são adequados para controlar especificamente celulares (sub) não • dinâmica sob várias condições experimentais utilizando todos os tipos de tipos celulares interessantes.

Recentemente, desenvolvemos uma nova classe de fluorescentes geneticamente codificados não • sondas, chamou os geNOps 1. Estes sensores consistir simplesmente de um construído, bactérias derivadas, NÃO • domínio de ligação 2, que é conjugado com uma proteína fluorescente distinto (FP) variante 3 (ciano, verde ou laranja FP). NÃO • se ligar ao centro de ferro não heme (II) 4 dentro dos geNOps reduz instantaneamente a intensidade de fluorescência 1. É importante ressaltar que a fluorescência geNOps recupera rápida e plenamente quando intracelulares não • níveis diminuem 1. Assim, geNOps permitem imagens em tempo real de (sub) celulares não • flutuações. Embora o NO • detecção mecanismo de geNOps permanecem obscuras até agora, eles provaram ser excelentes Não • repórteres, e, portanto, têm a potência para abrir uma nova era de policromático, quantitativa NO • bioimaging com altas resoluções espaciais e temporais 1, 5. Outros disponível fluorescentes NÃO • sondas são baseadas em compostos químicos pequenos, que têm de ser carregados em células, e são irreversivelmente modificadas por NO • 6. Desvantagens adicionais de NO • pequenas fluoróforos sensíveis são a sua citotoxicidade potencial e especificidade relativamente baixa o que torna difícil para usá-los de forma fiável, analítico e conclusivo 7, 8, 9. Embora o uso eficaz de sondas fluorescentes geneticamente codificados requer técnicas eficientes de transferência de genes, baseados em FP sensores geneticamente codificados surgiram como ferramentas indispensáveis que revolucionaram a nossa compreensão do funcionamento interno de células 10, 11. Antes do desenvolvimento das geNOps individuais baseados em FP, um Förster transferência de energia de ressonância (FRET) -based NÃO • sensor, referido como um NOA-12, foi construído. Sato et al. concebida esta sonda sofisticado, que consiste em duas subunidades do NO • sensível a guanilato ciclase solúvel (GCs), ambos conjugados sensores baseados em FRET para relatórios guanosina monofosfato cíclico (cGMP) níveis 12. Como esta sonda responde a cGMP, só indiretamente sente intracelulares não • flutuações 12. Embora NOA-1 responde a não • elevações na faixa de nano-molar, esta ferramenta não tem sido utilizado com frequência, até agora, provavelmente devido a limitações quanto à disponibilidade e viabilidade de este sensor bipartite volumoso. Funções versáteis de NO •, que impacto fundamental processos biológicos têm sido bem caracterizados 13, 14. Muitos estudos provaram que o NO • Concentraçãn dentro das células e subdomínios determina o destino celular na saúde e doenças 14, 15, 16. Em mamíferos, NÃO • é gerado principalmente enzimaticamente em vários tipos de células pela família bem caracterizada sintase de óxido nítrico (NOS) 17. Até agora, três isoformas de NOS foram descritos 18, 19, 20; estes são o Ca 2+ endotelial / dependente de calmodulina-NOS (eNOS ou NOS-3) 18 e neuronal NOS (nNOS ou NOS-1) 19, eo Ca2 + / calmodulina-independente constitutivamente ativa NOS induzível (iNOS ou NOS- 2) 20. Além disso, a existência de mitocondrial NOS (mtNOS) também tem sido sugerida 21. No entanto, mtNOS é considerado como uma variante de splicing de nNOS, e, por conseguinte não é classificado separadamente<html> como uma isoforma de 21. Outra isoforma, para além daqueles em células de mamífero, é o chamado NOS bacteriana (bNOS), encontra-se principalmente em bactérias gram-positivas 22. A produção enzimática de NO • é altamente controlada e depende da disponibilidade de vários co-factores, tais como fosfato de dinucleótido nicotinamida adenina (NADPH), flavina adenina dinucleótido (FAD), tetra-hidrobiopterina (BH4), oxigénio molecular e L-arginina 17. O aminoácido L-arginina é o substrato catiónico que é convertido em L-citrulina em cima NÃO • produção 17. Para além da geração enzimática altamente regulada • de NO, tem sido postulado que o radical pode ser reduzido não enzimaticamente a partir de misturas de nitritos por mitocôndrias sob condições de hipoxia 23. Uma vez NO • é produzido dentro de uma célula, que pode se difundir livremente através biomembranes 14,ref &quot;&gt; 15. No entanto, a meia-vida muito curta deste radical é determinada principalmente pelas condições ambientais, e vários caminhos e reações químicas degradar de forma eficiente não • níveis 24. Eventualmente, a formação, difusão e degradação de NO • depende em diversos parâmetros ambientais que determinar a concentração eficaz da molécula altamente biologicamente activa 24. A tecnologia geNOps permite a detecção directa de (sub) NO celular • flutuação 1 e é, portanto, adequado para investigar novamente, e recentemente descobrir os mecanismos responsáveis pelo acúmulo e decomposição de celulares não • sinais. Aqui, nós fornecemos protocolos simples e resultados representativos para o uso de geNOps para visualizar exogenamente evocado e endogenamente gerados NO • Perfis, sobre o nível de células individuais. Além disso, a tecnologia geNOps pode ser adaptado para application em outros sistemas modelo celular para estudar os padrões complexos de NO • formação, difusão e degradação em resposta a diversos estímulos celulares e tensões.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>3957.20</td><td>cloreto de sódio</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>6781.1</td><td>cloreto de potássio</td></tr><tr><td>CaCl2&#183; 2H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>T885.1</td><td>cloreto de cálcio di-hidratado</td></tr><tr><td>MgCl2&#183; 6H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>2189.2</td><td>cloreto de magnésio hexa-hidratado</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>9105.3</td><td>Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfónico</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>8551.1</td><td>hidrocarbonato de sódio</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>104873</td><td>dihidrogenofosfato</td></tr><tr><td>de potássio Na2HPO4&#183; 2H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>4984.1</td><td>hidrogenofosfato de sódio di-hidratado</td></tr><tr><td>D(+)-Glicose monohidratada</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>6780.1</td><td>>99.5%; para cultura de células, livre de endotoxinas</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>3054.2</td><td>etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N&#8288;,&#8288; N&#8288;,&#8288; N&#8288; &prime; &#8288;,&#8288; N&#8288; &prime; &#8288; ácido -tetracético; agente quelante de cálcio</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>6771.1</td><td>hidróxido de sódio</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>4625.1</td><td>ácido clorídrico, fumegante, 37% (~10 N)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>4720.1</td><td>dimetilsulfóxido; &nbsp; solvente orgânico altamente polar, aprótico</td></tr><tr><td>cloridrato de ácido L-glutâmico&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich, Viena, Áustria</td><td>G2128</td><td>(S)-2-Ácido aminoglutárico</td></tr><tr><td>DMEM, baixo teor de glicose</td><td>Sigma Aldrich, Viena, Áustria</td><td>D5523</td><td>Dulbecco» s Águia Modificada' s Média - baixa glicose; com 1.000 mg/L de glicose e L-glutamina, sem bicarbonato de sódio, em pó, adequado para cultura de células&nbsp;</td></tr><tr><td>MEM Solução de vitamina (100x)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td>11120037</td><td>100x as vitaminas encontradas no meio essencial mínimo padrão (MEM)</td></tr><tr><td>MEM Solução de aminoácidos (50x)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td>11130036</td><td>50x os aminoácidos essenciais (exceto L-glutamina) encontrados no meio essencial mínimo padrão (MEM)</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>15140122.00</td><td>antibióticos para prevenir a contaminação bacteriana de culturas celulares</td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td>15290026.00</td><td>Gibco A anfotericina B contém 250 &micro; g de anfotericina B (Fungizone) e 205 &micro; g de desoxicolato de sódio; previne a contaminação de culturas celulares por leveduras e fungos multicelulares</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td>10270106</td><td>Soro Fetal Bovino, qualificado, aprovado pela UE, origem da América do Sul</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td>10010031.00</td><td>solução salina tamponada com fosfato</td></tr><tr><td>Fura-2 (AM)</td><td>Teflabs, Austin, TX, EUA</td><td>102</td><td>indicadores fluorescentes de cálcio citosólico</td></tr><tr><td>Di-cloridrato de histamina</td><td>Sigma Aldrich, Viena, Áustria</td><td>H7250</td><td>Dicloridrato de 2-(4-Imidazolil)etilamina; Agonista gerador de IP3</td></tr><tr><td>N&omega;-Nitro-L-arginina</td><td>Sigma Aldrich, Viena, Áustria</td><td>N5501 Ácido</td><td>N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanóico; L-NNA; &nbsp; inibidor da óxido nítrico sintase</td></tr><tr><td>NOC-7</td><td>Calbiochem/Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>487952</td><td>3-(2-Hidroxi-1-metil-2-nitroso-hidrazino)-N-metil-1-propanamina; doador de óxido nítrico (NO) meia-vida curta de liberação de NO</td></tr><tr><td>Nitroprussiato de sódio di-hidratado</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Texas, EUA</td><td>sc-203395A</td><td>nitroferricianeto de sódio (III) di-hidratado; composto liberador de óxido nítrico</td></tr><tr><td>30 mm</td><td>Karl Hecht, Sondheim v. d. Rh&ouml; n, Alemanha</td><td>41001130</td><td>lamínulas de vidro, HECHT "Assistent", tamanho 1, redondo, 30 mm, (VE: 100 unid.)&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução de reforço de ferro (II)</td><td>Imagem fluorescente de próxima geração (NGFI), Graz, Áustria</td><td>n.a.Ferro</td> <td>(II) contendo tampão fisiológico para carga de ferro (II) não tóxico de células; &nbsp; http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/</td></tr> <tr><td>G-geNOp plasmídeo</td><td>Next generation fluorescente imaging (NGFI), Graz, Áustria</td><td>n.a.plasmid</td> <td>DNA codificando sonda sensível verde&nbsp;NO (G-geNOp); &nbsp; http://www.ngfi.eu/product/g-genop/</td></tr> <tr><td>G-geNOp AAV5</td><td>Imagem fluorescente de próxima geração (NGFI), Graz, Áustria</td><td>n.a.adenovírus</td> <td>que codifica sonda verde sensível a NO (G-geNOp); &nbsp; http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/</td></tr> <tr><td>Linha celular do sensor G-geNOp</td><td>Imagem fluorescente de próxima geração (NGFI), Graz, Áustria</td><td>n.a.</td> <td>Linha celular renal embrionária humana (HEK293) expressando de forma estável a sonda verde sensível ao NO (G-geNOp); &nbsp; http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/</td></tr> <tr><td>HEK293A linha celular</td><td>Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td>R70507</td><td>subclone da linha celular renal embrionária humana (HEK293)&nbsp;</td></tr><tr><td>Linha celular EA.hy926</td><td>American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Alemanha</td><td>CRL-2922</td><td>clone híbrido de células somáticas da linha celular da veia umbilical humana com um clone resistente à tioguanina de A549</td></tr><tr><td>TILL iMIC</td><td>Till Photonics, Graefling, Alemanha</td> <td>microscópio digital</td><td>n.a.monocromador</td></tr> <tr><td>policromado V Till</td><td>Photonics, Graefling, Alemanha</td><td>n.a.comutação</td> <td>ultra rápida</td></tr><tr><td>AVT Stingray F145B</td><td>Allied Vision Technologies, Stadtroda, Alemanha</td><td>n.a.Câmera</td> <td>CCD versátil com sensor Sony ICX285 EXview HAD, IEEE 1394b</td></tr><tr><td>alpha Plan Fluar 40</td><td>Zeiss, G&ouml; ttingen, Alemanha</td><td>n.a.40X</td> <td>filtros</td></tr><tr><td>dicróicos</td> objetivos <td>Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, EUA</td><td>n.a.GFP</td> <td>emissor 514/3 nm (515dcxr)</td></tr><tr><td>ValveBank8 Controller</td><td>AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, Califórnia, EUA</td><td>01-08</td><td>unidade de controle de sistema de perfusão programável</td></tr><tr><td>BVC control</td><td>Vacuubrand, Wertheim, Alemanha</td><td>727200</td><td>Bomba de diafragma química ME 1C; bomba de vácuo para sistema de perfusão</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td> Imagem NIH&nbsp;</td><td></td><td>Programa de processamento de imagem Java inspirado no NIH Image. http://imagej.net/Welcome</td></tr></tbody></table>

aplicação de codificados geneticamente fluorescente óxido nítrico (no •) sondas, as genops, para imagens em tempo real de no • os sinais em células individuais

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

O óxido nítrico (NO •) é um pequeno radical, que medeia múltiplas funções celulares importantes em mamíferos, bactérias e plantas. Apesar da existência de um grande número de métodos para a não detecção de • in vivo e in vitro, a monitorização em tempo real de NO • ao nível de uma única célula é um grande desafio. Os efeitos fisiológicos ou patológicos de NO • são determinadas pela concentração real e o tempo de paragem deste radical. Assim, os métodos que permitem a detecção de uma única célula de NO • são altamente desejáveis. Recentemente, ampliamos a palete de NO • indicadores, introduzindo única fluorescente óxido nítrico geneticamente codificado à base de proteínas sondas (NO •) (geNOps) que respondem diretamente para celulares não • flutuações e, portanto, atende a essa necessidade. Aqui demonstramos o uso de geNOps para avaliar intracelulares não • sinais em resposta a dois química diferente NO • moléculas -liberating. Nossos resultados alsO confirmam que recentemente preparada 3- (2-hidroxi-1-metil-2-nitrosohydrazino) -N-metil-1-propanamina (CON-7) tem um potencial muito mais elevado para evocar mudança na intracelulares não • níveis, em comparação com o inorgânica NO • nitroprussiato doador de sódio (SNP). Além disso, duas cores de imagem de células vivas usando os geNOps verde (G-geNOp) eo indicador químico Ca 2+ fura-2 foi realizada para visualizar a regulação apertada de Ca2 + dependente de NO • formação em células endoteliais individuais. Estas experiências representativas demonstram que geNOps são ferramentas adequadas para investigar a geração em tempo real e degradação de uma única célula não • sinais em diversas montagens experimentais.

Visualização de uma única célula NÃO • Perfis em resposta a transitoriamente Aplicada NO Doadores Foi utilizado um clone de células HEK que expressam estavelmente L-geNOp (Figura 1A), a fim de visualizar NÃO • sinais sobre o nível de uma única célula em resposta a dois pequenos compostos químicos que libertam NO diferentes, NOC-7 e SNP. Os não • doadores foram consecutivamente aplicado e removido a partir de células durante a imagem utilizando um sistema de perfusão à base de gravidade que garantiu fluxo contínuo (Figura 1B). Todas as células que expressam G-geNOp com diferentes intensidades mostrou uma clara redução da fluorescência em resposta a NOC-7 e SNP (Figura 1C), indicando rápido NO • acumulação nas células com a adição dos não • doadores. Sinais de fluorescência normalizados (1-F / F 0) demonstraram que tanto Não • doadores evocado cellula homogênear NÃO • elevações que completamente recuperados após a lavagem dos compostos liberador de não • (Figura 1D). No entanto, 10 uM de SNP induziu apenas 50% do NO celular • sinal (9.63 ± 1.05%, n = 3/38), que foi alcançado de 10 uM CON-7 (18,10 ± 1,20%, N = 3/38, p &lt; 0,0001). A fim de atingir iguais intracelulares não • níveis com dois doadores NO •, foi necessária uma concentração de 1 mM de SNP (Figuras 1C, 1D). Em seguida, testamos a capacidade dos recém-preparados contra expirado NOC-7 para elevar intracelulares não • níveis em células HEK. Para esta finalidade, preparou quatro buffers experimentais contendo 5 uM CON-7. O NO • dador foi adicionado de fresco, quer apenas antes da medição, ou mantidos em reservatórios durante 1 h, 2 h e 3 h à temperatura ambiente antes da medição. Os diferentes tampões foram consecutivamente aplicados e removidos from as células que expressam G-geNOp utilizando um sistema de perfusão (Figura 2B). Esta abordagem revelou a estabilidade de NOC-7 soluções aquosas que, como esperado, houve diminuição da capacidade ao longo do tempo para elevar os níveis intracelulares não • (Figuras 2A, 2C). Curiosamente, NÃO • Os sinais de recuperação significativamente mais rápida após a remoção de tampões expirados, em comparação com o intracelular NÃO • resposta que foi evocado por fresco CON-7 (Figura 2C), talvez indicando adesão das moléculas intactas NÃO • -liberating em componentes celulares . A visualização simultânea de Ca 2+ e NÃO • Os sinais nas células endoteliais individuais A fim de estudar Ca 2+ Triggered NÃO • formação em células endoteliais, as células endoteliais imortalizadas de células-substituto comumente utilizado, linha de células EA.hy926, foi transiently transfectadas com G-geNOp e carregado com Fura-2 / AM (ver protocolo 2.8). A transfecção produziram aproximadamente 10% de células endoteliais positivas L-geNOp (n = 6, Figura 3A), o que é suficiente para gravar Ca 2+ -evoked NÃO • produção do nível de células endoteliais individuais. No entanto, obtivemos quase 100% de L-geNOp células EA.hy926 positiva utilizando um vector viral adeno-associado (n = 6; ver protocolo 2.2). Antes das medições de vários canais, as células foram incubadas durante 20 min à temperatura ambiente em tampão de armazenagem que consiste de L-NNA, um potente inibidor irreversível SOE-26. As células de controlo foram mantidos no mesmo tampão de armazenamento sem L-NNA (ver Protocolo de 1,1) (Figura 3B). O tratamento de células de controlo com histamina, um potente inositol 1,4,5-trifosfato (IP 3) -generating agonista, instantaneamente elevados níveis citosólica de Ca2 +, seguido de um aumento gradual de intracelular NÃO • até que o agonista era removerd (Figuras 3C, 3D). As células pré-tratadas com o inibidor NOS-mostrou citosólicos de Ca2 + sinais semelhantes, enquanto o intracelular NO • nível manteve-se praticamente inalterado em resposta à histamina (Figura 3E). EA.hy926 células que expressam G-geNOp também foram tratadas com 1? M e 100? M de PI 3 -generating agonista de ATP a fim de testar se ou não geNOps são adequados para monitorar NÃO • sinais em resposta a ambos baixa fisiológica e supra-fisiológica As concentrações de agonista (Figura 3F). Na linha celular endotelial 1 uM ATP evocada uma clara citosólica NÃO • sinal, que era cerca de metade do sinal obtido por 100 uM de ATP (Figura 3F). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55486/55486fig1.jpg" /> Figura 1: Perfis de NO intracelular em resposta a diferentes NO-Liberati<html> ng moléculas. (A) imagens de campo largo de células HEK expressando estavelmente citosólica G-geNOp. Barra de escala = 20 mm. (B) Ilustração esquemática de um sistema semi-automático com base gravidade de perfusão para a aplicação e remoção controlada de NOC-7 e SNP. (C) representativas (de 3 experiências independentes) não normalizada intensidade da fluorescência de uma única célula traça em unidades arbitrárias em função do tempo de células HEK que expressam estavelmente citosólica L-geNOp em resposta a 10 uM CON-7, 10 uM de SNP, e 1 mM de SNP. Preto curva em negrito representa a curva média de 26 traços de uma única célula (leves curvas cinza). Curva preta pontilhada representa F 0, o qual foi utilizado para normalização. (D) os traços individuais normalizadas e invertido (1-F / F 0, luz curvas de cinza), e significa curva (curva em negrito preto) ao longo do tempo em resposta a 10 mM NOC-7, 10 mM SNP, e SNP 1 mM extraído de painel C.es / ftp_upload / 55486 / 55486fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55486/55486fig2.jpg" /> Figura 2: Teste de estabilidade de NOC-7 utilizando células HEK de forma estável que expressam G-geNOp. (A) Representante NO • curva de resposta concentração ao longo do tempo de estavelmente G-GeNOps expressando células HEK a pedido da NOC-7 soluções tampão frescos e velhos. Todos os tampões que contenham NOC-7 foram preparados inicialmente com uma concentração final de 5 uM, utilizando a mesma solução estoque (50 mM). O tempo decorrido das respectivas soluções após a preparação, até valores de imagem para 1 hora, 2 horas e 3 horas, como indicado. (B) Ilustração esquemática de um sistema de perfusão meia-automático baseado gravidade para adicionar e remover consecutivamente soluções NOC-7 contendo durante a imagem. (C) correlações temporais decelular não • sinais em resposta ao recém-preparados e velhos NOC-7 buffers. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55486/55486fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55486/55486fig3.jpg" /> Figura 3: imagem multicanal simultânea de NO • e Ca 2+ sinais em células EA.hy926 individuais. (A) representativos imagens de fluorescência de todo o campo de células que expressam G-EAhy.926 geNOp (painel esquerdo) que são carregadas com fura-2 / AM (média e painéis da direita). Barra de escala = 20 mm. (B) Ilustração esquemática do tratamento de células com 500 uM EAhy.926 Nco-nitro-L-arginina (L-NNA), durante 20 minutos dentro de uma placa de seis poços antes da medição. (C) curso de tempo Representante de um registro simultâneo de fura-2 (excitação: 340 nm / 380 nm Emissde iões: 510 nm) e os sinais de L-geNOp (excitação: 480 nm; emissão: 520 nm), em resposta a 100? M de histamina. Como indicado histamina foi removido após 3 min utilizando um sistema de perfusão. (Linha de Fura-2 sinais de relação, F 340 / F 380 é sólido cinzento) (D) Curvas representam gravações simultâneas de Ca citosólico 2 + e NO • (curva normalizada e invertida, 1-F / F 0 é a linha verde sólido) sinais ao longo do tempo de um único Fura-2 / aM carregado de células endoteliais que expressam transitoriamente L-geNOp. As células foram estimuladas com 100? M de histamina durante 3 min numa Ca2 + (2 mM CaCl2) contendo tampão (n = 8/3). (E) representativas gravado simultaneamente Ca 2+ (linha cinzenta sólida) e NO • (linha sólida verde) sinais ao longo do tempo de uma célula EA.hy926 que foi pré-tratadas com 500 uM Nco-nitro-L-arginina (L-NNA) antes a medição (n = 12/3). As células foram tratadas com 100 uM de histamina na presença de 2 mMCa 2+. (F) representam curvas médias citossólicos não • sinais em resposta a um ATP? M seguido de uma segunda estimulação das células com ATP 100 uM. As barras representam valores médios ± SD de sinais máximas G-geNOp em resposta a um ATP? M (barra branca) e ATP 100? M (barra verde) de 4 experiências independentes; P &lt;0,001 em comparação com 1 uM de ATP. P-valor foi calculado usando um teste t não pareado. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55486/55486fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este manuscrito apresenta protocolos para a aplicação de novas sondas de óxido nítrico (NO•) geneticamente codificadas (geNOps) para monitorar flutuações de NO• de célula única em tempo real usando microscopia de fluorescência. A formação de NO• desencadeada por Ca2+ no nível de células endoteliais individuais foi visualizada combinando geNOps com um sensor químico de Ca2+.

Aplicação de codificados geneticamente fluorescente óxido nítrico (NO •) Sondas, as geNOps, para imagens em tempo real de NO • Os sinais em células individuais

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

O objetivo geral dessa abordagem de imagem é monitorar em tempo real os sinais de óxido nítrico no nível de células individuais, utilizando uma nova classe de sondas fluorescentes codificadas geneticamente para óxido nítrico, os geNOps. Considerando a importância do óxido nítrico na biologia e na fisiologia, deseja-se desde sua descoberta a visualização dessa molécula em nível celular ou mesmo subcelular. Nós visualizamos os sinais de óxido nítrico com sondas novas e relativamente simples em sua estrutura, baseadas em proteínas fluorescentes, os geNOps.Os geNOps respondem diretamente e imediatamente ao óxido nítrico por meio do quenching de fluorescência. Isso significa que você pode monitorar a cinética em tempo real da geração, difusão e degradação do óxido nítrico em células individuais. A principal vantagem dos geNOps é que você realmente pode observar os sinais de óxido nítrico com alta resolução espacial e temporal utilizando um microscópio de fluorescência convencional.Inicie este procedimento substituindo o tampão de armazenamento da linhagem de células endoteliais ou das células HEK293 por um mililitro por poço da solução de reforço de ferro(II) à temperatura ambiente. Incube as células por exatamente 20 minutos no escuro. O procedimento de carregamento de ferro é essencial para obter a plena resposta dos sondas e pode ser adaptado para diferentes tipos celulares e aplicações.Posteriormente, lave as células uma vez com o tampão de armazenamento e incube cada poço com dois mililitros de tampão de armazenamento por pelo menos duas horas à temperatura ambiente para permitir que as células se equilibrem. Em seguida, substitua o tampão de armazenamento por Fura-2AM 3,3 micromolar em um mililitro de tampão de armazenamento. Proteja as células da luz e incube-as por 45 minutos.Após 45 minutos, lave as células duas vezes com o tampão de armazenamento e, novamente, incube-as por pelo menos 30 minutos para permitir que as células se equilibrem. Para iniciar o procedimento, fixe primeiro uma lamínula de 30 milímetros revestida com a linhagem de células endoteliais ou células HEK293 em uma câmara de perfusão metálica. Ligue o sistema de imagem e, em seguida, coloque a câmara de perfusão metálica no microscópio.Conecte o tubo de entrada aos reservatórios de tampão e, em seguida, ligue o sistema de perfusão. Agora conecte o efluxo a uma bomba de vácuo, garantindo um fluxo constante e evitando o esvaziamento da lamínula. Inicie a perfusão por gravidade com tampão fisiológico de cálcio utilizando um sistema de perfusão semi-automático.Em seguida, defina as configurações de imagem usando o software apropriado. Selecione os comprimentos de onda de excitação de 340 nanômetros e 380 nanômetros para a imagem com Fura-2 e de 480 nanômetros para excitar o G-geNOp. Em seguida, selecione a região de imagem movendo a mesa xyz do microscópio até que várias células fluorescentes estejam em foco.Em seguida, defina as regiões de interesse. Desenhe as regiões cobrindo várias células fluorescentes inteiras e individuais para cada campo de imagem. Após isso, defina uma região de fundo de tamanho semelhante.Inicie a coleta de dados em um microscópio fluorescente invertido e avançado com estágio de amostra motorizado e fonte de luz monocromática. Alternativamente, excite as células em 340 nanômetros e 380 nanômetros para Fura-2AM e em 480 nanômetros para G-geNOp, respectivamente. Ajuste os tempos de exposição respectivos para que um sinal de fluorescência claro seja detectável ao longo do tempo em todos os canais.Colete a luz emitida em 510 nanômetros para Fura-2AM e em 520 nanômetros para G-geNOp, utilizando uma câmera CCD com conjunto de filtros apropriado, composto por um excitador de 500 nanômetros, um dicróico de 495 nanômetros e um emissor de 510-520 nanômetros. Em seguida, registre um quadro completo a cada três segundos. Grave os primeiros três minutos em tampão fisiológico de cálcio para obter a linha de base dos respectivos sinais de fluorescência.Após observar uma fluorescência de linha de base estável, mude para o tampão fisiológico de cálcio contendo histamina ou ATP a 100 micromolar para estimular as células durante três minutos. Em seguida, retorne ao tampão fisiológico de cálcio sem histamina ou ATP e sem L-NNA por cinco minutos para remover os compostos das células. Posteriormente, administre NOC-7 a 10 micromolar no tampão fisiológico de cálcio por dois minutos utilizando o sistema de perfusão.O doador de óxido nítrico afeta fortemente a fluorescência do G-geNOp, e geralmente diminui as células em mais de 20% em resposta ao NOC-7 a 10-micromolar. Em células EA.hy926, o efeito do NOC-7 é mais acentuado em comparação com o quenching da fluorescência do G-geNOp induzido por agonistas. Em seguida, remova o composto liberador de óxido nítrico lavando por aproximadamente 10 minutos com o tampão fisiológico de cálcio e interrompa o registro assim que a fluorescência basal for recuperada.Mostradas aqui estão imagens representativas de fluorescência de campo amplo de células EA.hy926 expressando G-geNOp que foram carregadas com Fura-2AM. E aqui, o curso temporal representativo dos registros simultâneos dos sinais de Fura-2 e G-geNOp em resposta à histamina 100-micromolar. Conforme indicado, a histamina foi removida após três minutos utilizando um sistema de perfusão.Essas curvas representam os registros simultâneos de sinais de cálcio citosólico e óxido nítrico de uma única célula endotelial carregada com Fura-2AM e expressando transitoriamente G-geNOp. As células foram estimuladas com histamina 100-micromolar por três minutos em um tampão contendo cálcio. E aqui são mostrados os sinais representativos de cálcio e óxido nítrico registrados simultaneamente ao longo do tempo em uma célula EA.hy926 que foi pré-tratada com L-NNA 500-micromolar antes da medição.As células foram tratadas com histamina 100-micromolar na presença de cálcio 2-milimolar. Esta figura mostra as curvas médias que representam os sinais de óxido nítrico citosólico em resposta ao ATP 1-micromolar seguido por uma segunda estimulação celular com ATP 100-micromolar. Uma vez dominada, esta técnica permite visualizar os sinais de óxido nítrico em tempo real com esforço mínimo.Acredito que esta técnica abrirá caminho para que pesquisadores explorem e reavaliem os sinais de óxido nítrico em diversos modelos celulares. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender bem como utilizar a tecnologia geNOps para o imageamento em tempo real do óxido nítrico em seu sistema modelo.

application-genetically-encoded-fluorescent-nitric-oxide-no-probes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Lacin, E., et al. Construção de Repórteres de Engenharia Fluorescente de Neurotransmissores Baseados em Células (CNiFERs) para Detecção Óptica de Neurotransmissores In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra uma técnica para obter imagens da liberação de neurotransmissores in vivo usando repórteres de engenharia fluorescente de neurotransmissores baseados em células (CNiFERs), células repórter especializadas pré-injetadas no córtex de camundongo. Posicionado sob um microscópio de...

Liberação de neurotransmissores de imagem usando repórteres de engenharia fluorescente de neurotransmissores baseados em células

Beacons bimoleculares proporcional (RBMBs) pode ser usado para imagens simples transcrições de RNA projetados em células vivas. Aqui, nós descrevemos a preparação e purificação de RBMBs, entrega de RBMBs em células de formação de microporos e de imagem fluorescente de transcritos de ARN em tempo real.

Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

Este artigo irá demonstrar como monitorar a dinâmica de glutamina em células vivas usando FRET. Sensores geneticamente codificados permitir o monitoramento em tempo real de moléculas biológicas em uma resolução subcelular. O delineamento experimental, os detalhes técnicos das configurações experimentais, e considerações para análises pós-experimentais serão discutidos para sensores de glutamina codificados geneticamente.

Glutamina Flux imagem usando sensores codificados geneticamente

Este manuscrito descreve uma nova técnica que permite a detecção da expressão gênica intracelular após a endocitose de nanopartículas marcadas com fluorescência diretamente em células vivas. O método não requer manipulação das células e não é restrito em relação ao gene ou espécie alvo.

Detecção de intracelular Expressão Gênica em células vivas de murino, humano e porcino Origem Usando nanopartículas marcados com fluorescência

Nós apresentamos um protocolo para criar baseada em células neurotransmissor fluorescentes repórteres modificadas (CNiFERs) para a detecção óptica de liberação do neurotransmissor volumétrica.

Construção de-base celular Neurotransmissores fluorescentes Engineered Repórteres (CNiFERs) para detecção óptica de neurotransmissores<em&gt; In Vivo</em

As alterações morfológicas ocorrem em células de fibroblastos imunes responsivos após a ativação e promovem alterações no recrutamento celular. Utilizando a imagem latente do Photon 2 conjuntamente com uma proteína fibroblástica-específica geneticamente projetada 1 (FSP1)-CRE; tdtomato floxed-parar-floxed (TB/TB) linha do mouse e verde cDNAs Tagged lipopolissacarídeo-FITC, podemos ilustrar a captação altamente específica de lipopolissacaríno em fibroblastos dérmicos e alterações morfológicas in...

In vivo duas cores 2-Photon Imaging de células de repórter geneticamente marcadas na pele

Células de tronco neural/progenitor apresentam várias dinâmicas de expressão de componentes de sinalização notch que levam a diferentes resultados de eventos celulares. Essa expressão dinâmica pode ser revelada pelo monitoramento em tempo real, não pela análise estática, usando um sistema de imagem de bioluminescência altamente sensível que permite a visualização de mudanças rápidas nas expressões gênicas.

Imagens de bioluminescência em tempo real da dinâmica de sinalização de notch durante a neurogênese de Murine

Multiplex in situ hibridização (ISH) foi empregado para visualizar simultaneamente as transcrições de dois receptores acoplados à proteína G e um fator de transcrição em todo o complexo gônico vagal do camundongo adulto. Este protocolo poderia ser usado para gerar mapas precisos dos perfis transcritivos de neurônios aferentes vagal.

Detecção de expressão receptora acoplada à proteína G em neurônios aferentes do mouse vagal usando multiplex in situ hibridização

Este protocolo descreve como configurar e realizar com eficiência análises automatizadas de dados de imagem de células vivas obtidos do rastreamento do transporte nucleocitoplasmático por meio de ferramentas optogenéticas.

Usando ferramentas de optogenética LEXY e LINuS e análise automatizada de imagens para quantificar a dinâmica de transporte nucleocitoplasmático em células vivas

O objetivo deste protocolo é possibilitar a medição quantitativa da vida útil da fluorescência das sondas Riboglow para fluxos de trabalho de imagem de RNA reprodutíveis in vitro, em células vivas de mamíferos e em modelos celulares tridimensionais. Descrevemos os fluxos de trabalho de preparação de amostras, entrega de sondas, aquisição de dados e análise quantitativa para extração de medições de vida útil de fluorescência imparciales.

Caracterização das Sondas de Riboglow In Vitro como Base para Imagens de Vida Fluorescente em Células Vivas de Mamíferos e Modelos Celulares Tridimensionais

Aprenda a usar sondas geNOps para imagem em tempo real de óxido nítrico em células individuais por microscopia de fluorescência. Este método permite visualizar sinais de NO• com alta resolução espacial e temporal em células endoteliais.

Aplicação de codificados geneticamente fluorescente óxido nítrico (NO •) Sondas, as geNOps, para imagens em tempo real de NO • Os sinais em células individuais (Vídeo) | JoVE Journal

Aplicação de codificados geneticamente fluorescente óxido nítrico (NO •) Sondas, as geNOps, para imagens em tempo real de NO • Os sinais em células individuais

Explorar mais vídeos