Aplicação de codificados geneticamente fluorescente óxido nítrico (NO •) Sondas, as geNOps, para imagens em tempo real de NO • Os sinais em células individuais

O objetivo geral desta abordagem de imagem é monitorar os sinais de óxido nítrico em tempo real no nível de células individuais usando uma nova classe de sondas de óxido nítrico fluorescente geneticamente codificadas, as geNOps. Considerando a importância do óxido nítrico na biologia e fisiologia, uma visualização dessa molécula em nível celular ou mesmo subcelular tem sido desejada desde que foi descoberta. Visualizamos os sinais de óxido nítrico com novas sondas baseadas em proteínas fluorescentes de construção bastante simples, as geNOps.

Os geNOps respondem direta e imediatamente ao óxido nítrico por extinção de fluorescência. Isso significa que você pode monitorar a cinética em tempo real da geração, difusão e degradação do óxido nítrico em células individuais. A principal vantagem do geNOps é que você realmente pode observar sinais de óxido nítrico com alta resolução espacial e temporal usando um microscópio de fluorescência convencional.

Comece este procedimento substituindo o tampão de armazenamento da linha de células endoteliais ou células HEK293 por um mililitro por poço da solução de reforço de ferro (II) à temperatura ambiente. Incube as células por exatamente 20 minutos na escuridão. O procedimento de carregamento de ferro é essencial para obter total capacidade de resposta das sondas e pode ser adaptado para diferentes tipos de células e aplicações.

Depois, lave as células uma vez com tampão de armazenamento e incube cada poço com dois mililitros de tampão de armazenamento por pelo menos duas horas em temperatura ambiente para permitir que as células se equilibrem. Em seguida, substitua o buffer de armazenamento por 3,3 micromolares Fura-2AM em um mililitro de buffer de armazenamento. Proteja as células da luz e incube-as por 45 minutos.

Após 45 minutos, lave as células duas vezes com tampão de armazenamento e incube-as novamente por pelo menos 30 minutos para permitir que as células se equilibrem. Para iniciar o procedimento, primeiro fixe uma lamínula de 30 milímetros revestida com a linha de células endoteliais ou células HEK293 em uma câmara de perfusão de metal. Ligue o sistema de imagem e coloque a câmara de perfusão de metal no microscópio.

Conecte o tubo de influxo aos reservatórios tampão e, em seguida, ligue o sistema de perfusão. Agora conecte o efluxo a uma bomba de vácuo, garantindo um fluxo consistente e evitando a drenagem da lamínula. Inicie a perfusão por gravidade com tampão de cálcio fisiológico usando um sistema de perfusão semiautomático.

Em seguida, defina as configurações de imagem usando o respectivo software. Selecione os comprimentos de onda de excitação de 340 nanômetros e 380 nanômetros para imagens Fura-2 e 480 nanômetros para excitar G-geNOp. Em seguida, selecione a região de imagem movendo a tabela xyz do microscópio até que várias células fluorescentes estejam em foco.

Em seguida, defina as regiões de interesse. Desenhe as regiões que cobrem várias células fluorescentes inteiras para cada campo de imagem. Em seguida, defina uma região de fundo de tamanho semelhante.

Comece a coletar dados em um microscópio fluorescente invertido e avançado com um estágio de amostra motorizado e uma fonte de luz monocromática. Alternativamente, excite as células a 340 nanômetros e 380 nanômetros para Fura-2AM e 480 nanômetros para G-geNOp, respectivamente. Defina os respectivos tempos de exposição para que um sinal de fluorescência claro seja detectável ao longo do tempo para todos os canais.

Colete a luz emitida a 510 nanômetros para Fura-2AM, 520 nanômetros para G-geNOp usando uma câmera CCD com conjunto de filtros apropriado consistindo no excitador de 500 nanômetros, um dicróico de 495 nanômetros e um emissor de 510-520 nanômetros. Em seguida, grave um quadro total a cada três segundos. Registre os primeiros três minutos em tampão de cálcio fisiológico para obter a linha de base dos respectivos sinais de fluorescência.

Uma vez observada uma fluorescência basal estável, mude para histamina 100 micromolar ou tampão fisiológico de cálcio contendo ATP para estimular as células por três minutos. Posteriormente, volte para o tampão fisiológico de cálcio sem histamina ou ATP e L-NNA por cinco minutos para remover os compostos das células. Em seguida, administrar NOC-7 10 micromolares no tampão fisiológico de cálcio por dois minutos usando o sistema de perfusão.

O doador de óxido nítrico afeta fortemente a fluorescência de G-geNOp e geralmente diminui as células em mais de 20% em resposta ao NOC-7 de 10 micromolares. Nas células EA.hy926, o efeito NOC-7 é mais forte em comparação com a extinção de fluorescência G-geNOp induzida por agonista. Em seguida, lave o composto liberador de óxido nítrico por aproximadamente 10 minutos com o tampão de cálcio fisiológico e pare de registrar assim que a fluorescência basal for recuperada.

Aqui são mostradas as imagens representativas de fluorescência de campo amplo de células EA.hy926 que expressam G-geNOp que são carregadas com Fura-2AM. E aqui está o curso de tempo representativo das gravações simultâneas dos sinais Fura-2 e G-geNOp em resposta à histamina 100 micromolar. Conforme indicado, a histamina foi removida após três minutos usando um sistema de perfusão.

Essas curvas representam os registros simultâneos de sinais citosólicos de cálcio e óxido nítrico de uma única célula endotelial carregada com Fura-2AM expressando transitoriamente G-geNOp. As células foram estimuladas com histamina 100 micromolar por três minutos em um tampão contendo cálcio. E mostrados aqui, estão os sinais representativos de cálcio e óxido nítrico registrados simultaneamente ao longo do tempo de uma célula EA.hy926 que foi pré-tratada com L-NNA 500 micromolar antes da medição.

As células foram tratadas com histamina 100 micromolar na presença de cálcio dois milimolares. Esta figura mostra as curvas médias que representam sinais de óxido nítrico citosólico em resposta a ATP de um micromolar seguido por uma estimulação de segunda célula com ATP de 100 micromolares. Uma vez dominada, essa técnica permite visualizar sinais de óxido nítrico em tempo real com o mínimo de esforço.

Acredito que essa técnica abrirá caminho para os pesquisadores explorarem e reinvestigarem os sinais de óxido nítrico em vários modelos celulares. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a tecnologia geNOps para imagens em tempo real de óxido nítrico em seu sistema modelo.