Suporte composto de matriz extracelular microgel para impressão 3D incorporada de construções neurais humanas

A impressão 3D incorporada nos compósitos SHAPE supera as limitações tradicionais de biofabricação para permitir a padronização precisa de tecidos mecanicamente sensíveis dentro de hidrogéis que se assemelham ao ambiente extracelular nativo. A caixa de ferramentas SHAPE baseia-se no design modular de biomateriais, permitindo mudanças fáceis na formulação do suporte de impressão. Também utiliza materiais de baixo custo e equipamentos acessíveis para simples adaptação por outros grupos de pesquisa.

Essa abordagem pode ser aplicada para criar modelos de tecido neural humano espacialmente definidos para examinar o desenvolvimento neuronal e a comunicação em doenças neurodegenerativas, como Parkinson. Comece preparando a solução de carbonato de cálcio em água ultrapura na concentração de dois miligramas por mililitro. Misture com a solução de alginato numa proporção igual e agite-a magneticamente a 650 RPM durante uma hora à temperatura ambiente.

Em seguida, adicione ácido acético a esta mistura na proporção de um para 500 e mexa novamente durante a noite. No dia seguinte, fragmentar mecanicamente a solução de alginato gelatinoso em micropartículas a 15.000 RPM por 10 minutos usando um homogeneizador. Em seguida, centrifugar para obter as micropartículas.

Descarte cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as partículas no DMEM, contendo dois milimolares de hidróxido de sódio e 1% de estreptomicina de penicilina. A cor da suspensão deve mudar de volta para vermelho. Incube a suspensão durante a noite a quatro graus Celsius.

Após a incubação, homogeneizar a suspensão por três minutos a 15.000 RPM e centrifugar a 18.500 G por 10 minutos. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e observe o pellet para micropartículas de alginato bem embaladas. Para gerar o compósito SHAPE, misture o pellet de micropartículas de alginato com colágeno diluído e neutralizado na proporção de dois para um e pipete-o para cima e para baixo no gelo.

Transfira o material compósito gerado para uma placa resfriada de 24 poços. Antes da impressão, dissociar as células-tronco neurais humanas previamente cultivadas ou hNSCs usando uma solução de tripsina a 0,025% por cinco minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, neutralizar a tripsina com o meio de crescimento e centrifugar a suspensão celular a 400 G por cinco minutos à temperatura ambiente.

Após a remoção do sobrenadante, ressuspenda o pellet celular em dois a três mililitros de meio de crescimento. Usando uma agulha de metal rombo de calibre 21, carregue 100 microlitros de micropartículas de alginato bem embaladas na seringa. Em seguida, carregue a suspensão de células preparada em uma seringa.

Para impressão, substitua a agulha de carregamento por uma agulha metálica romba de calibre 27. Usando um software referenciado, uma vez que a estrutura para imprimir é projetada, clique em gerar para uma geração de código G. Insira a seringa carregada com célula em uma cabeça de extrusão volumétrica em uma bioimpressora baseada em extrusão e registre o comprimento da agulha clicando em iniciar o processo de medição do comprimento da agulha.

Em seguida, coloque a placa de 24 poços carregada com o composto SHAPE na impressora e clique em SHM para medir a altura da superfície do poço vazio. Selecione pH 2 seguido do símbolo da chave inglesa. Em seguida, sob o conjunto de parâmetros, altere a taxa de fluxo de volume para 3,6 microlitros por segundo e pressione Apply Parameter, seguido por Save and Done.

Carregue o código G na interface do usuário da impressora clicando em um ícone para abrir o código G. Selecione o ícone do programa de execução para iniciar o procedimento de impressão. Imediatamente após a impressão, incubar o gel SHAPE a 37 graus Celsius por 30 minutos para recozimento.

Em seguida, adicione suavemente o meio de crescimento ao suporte de gel SHAPE recozido. Para imunomarcação, remova o excesso de meio do gel e, usando uma espátula, transfira o gel para um recipiente contendo DPBS. Uma vez que a placa é colocada no exaustor, remova o DPBS.

Cobrir o gel com solução de formaldeído a 4% e incubar durante uma hora à temperatura ambiente. Após a lavagem com DPBS, adicione a solução de bloqueio ao gel. Agite a placa suavemente e incube por seis horas à temperatura ambiente para evitar ligações inespecíficas.

Uma vez removida a solução de bloqueio, adicione o anticorpo primário ao gel e agite-o suavemente. Incubar a placa por 48 horas a quatro graus Celsius. Após a lavagem da DPBS, trate o gel com a solução de anticorpos secundários por 24 horas.

Coloque o gel corado com uma espátula em uma placa de poço com um fundo de imagem fino antes da aquisição de imagens. No presente estudo, a tinta hNSC imprimiu um filamento de células com diâmetro em torno de 200 micrômetros. Os fios impressos foram ricos em células viáveis com morfologia ao redor.

Após 30 dias de impressão, as células exibiram morfologia neural com corpos celulares pequenos e processos longos e finos, o que indicou o sucesso da diferenciação das hNSCs. A coloração com tubulina beta três permitiu a visualização das redes neurais geradas com geometria mantida. E durante o processo de diferenciação, as células não migraram para fora dos fios impressos.

O composto SHAPE pode ser usado para produzir canais perfusíveis imprimindo tinta sacrificial em vez de células. Além disso, o suporte pode incluir esferas sensíveis ao oxigênio para monitorar a tensão de oxigênio em estruturas impressas em 3D ao longo do tempo e do espaço.