Desenvolvendo um modelo 3D baseado em seda e colágeno projetado de tecido neural polarizado

Coloque andaimes de seda porosa em forma de rosquinha, revestidos de poli-D-lisina e em uma placa de vários poços.

Adicione meios de cultura para hidratar os andaimes, facilitando a fixação celular.

Aspire o excesso de meio. Semeie os andaimes com uma suspensão de células neuronais e incuba.

A superfície revestida e os poros do andaime fornecem uma grande área de superfície para a fixação de células de alta densidade e facilitam a difusão eficiente de nutrientes e resíduos.

Remova as células não anexadas e adicione colágeno, uma proteína da matriz extracelular.

Incubar para polimerização de colágeno. Esse processo incorpora as células dentro de uma matriz 3D semelhante a um gel no andaime poroso.

Adicione mídia. Cultive e substitua regularmente metade dos meios de cultura para repor os nutrientes sem perturbar as células.

Dentro da cultura, os corpos celulares neuronais permanecem ancorados ao andaime de seda enquanto os axônios crescem através da matriz de colágeno, formando redes axonais 3D.

Esse corpo celular compartimentado e a localização axonal resultam na formação de um modelo de tecido neural polarizado semelhante ao cérebro 3D.

Dentro de uma capa de cultura de células, coloque um par de pinças esterilizadas, meios de cultura de células e os andaimes autoclavados. Remova uma placa de 96 poços de sua embalagem e coloque dentro. Para semear os andaimes, primeiro, coloque um andaime estéril por poço na placa de 96 poços. Adicione meio de cultura de células para imergir os andaimes e incube a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecidos para equilibrá-los por pelo menos 30 minutos.

Após a incubação, aspirar o excesso de meio dos andaimes. Em seguida, adicione 2 vezes 10 às 6 células neuronais corticais de rato em 100 microlitros de meio neurobasal por andaime. Retorne a placa para a incubadora e deixe durante a noite para permitir que as células se prendam ao andaime. Na manhã seguinte, aspire cuidadosamente as células não aderidas e substitua por 200 microlitros de meio de cultura de células frescas. Incube a 37 graus Celsius por um breve período.

Em seguida, aspire o meio dos poços. Usando uma pinça estéril, transfira os andaimes contendo células para poços vazios da placa de 96 poços. Em seguida, a cada andaime, adicione 100 microlitros de 3 miligramas de solução de colágeno de cauda de rato gelada recém-diluída e diluída.

Retorne as células para a incubadora de 37 graus Celsius para permitir a polimerização do colágeno por 30 minutos. Remova a placa da incubadora e adicione 100 microlitros de meio de cultura de células pré-aquecido por poço. Retorne a placa à incubadora pelo período desejado de crescimento celular, substituindo metade do meio de cada poço por meio fresco todos os dias por até uma semana.