Name: PH intracelular de quantificação de óptica em Drosophila melanogaster túbulo de Malpighi epitélios com um indicador de pH fluorescente geneticamente codificado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Aprenda a quantificar o pH intracelular em túbulos de Malpighi de Drosophila melanogaster usando o indicador pHerry. Este método permite avaliar o transporte de prótons basolateral em células epiteliais intactas por imagem ao vivo.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH DK092408 e DK100227 de Mfr. AJR foi apoiado por T32-DK007013. Os autores desejam agradecer Dr. Julian A.T. Dow de CapaR-GAL4 e c724-GAL4 estoques de Drosophila . Agradecemos também o Jacob B. Anderson para obter assistência manutenção cruzamentos experimentais de voar.

Os autores não têm nada para divulgar.

O sucesso da quantificação de pH em Drosophila MTs depende inteiramente da saúde de MTs extraídos e a qualidade da montagem e dissecação (Figura A – C). Assim, o tratamento cuidadoso do tecido como descrito é imperativo. Slides recém revestidos em PLL substancialmente ajuda MT montagem como eles tendem a ser muito mais adesivo do que os slides que anteriormente foram expostos a solução. Cuidado montagem também ajudarão na identificação de segmentos ...

O objetivo do presente protocolo é descrever a quantificação do pH intracelular (pHi) usando um geneticamente codificado-indicador de pH (GEpHI) e demonstrar como esse método pode ser usado para avaliar o transporte de H+ basolateral em um inseto modelo d (. melanogaster) estrutura renal, túbulos de Malpighi (MT). MTs servem como órgãos excretores da mosca da fruta e são funcionalmente semelhantes aos mamíferos néfron em vários aspectos chave1. MTs são arranjados como 2 pares de túbulos (anteriores e posteriores) no tórax e abdômen de uma mosca. O tubo de única célula epitelial de cada MT é composto por metabolicamente ativas células principais com distintas apicais (luminal) e polaridade basolateral (hemocoel), bem como células estreladas intercaladas. MTs anteriores são compostas de 3 morfologicamente, funcionalmente, e mentalmente distintos segmentos, nomeadamente a inicial dilatadas segmento, segmento de transição e secretora segmento principal, que se junta ao ureter2. Na escala celular transporte trans-epitelial íons no lúmen é realizado por uma membrana plasmática apical V-ATPase3 e um cambista do alcaloide-metal/H+ , bem como um basolateral at+-+K-ATPase4, aperfeiçoamento activo-retificador K+ canais5, at+-conduzido Cl−/HCO3− cambista (NDAE1)6e Na+-K+-2 Cl− cotransporter (NKCC; Ncc69)7, enquanto células estreladas mediam Cl– e transporte de água8,9. Este sistema fisiológico complexo mas acessível oferece excelentes oportunidades para a investigação de mecanismos de transporte de íon endógena quando combinado com diversos fatores genéticos e comportamentais conjuntos de ferramentas de Drosophila.
A justificativa para este protocolo foi descrever um sistema geneticamente maleável para estudar o transporte de íons epitelial com potencial para a integração do celular para o comportamento e exportação de ferramentas para outros sistemas de modelo. Expressão de pHerry10, uma GEpHI derivada de uma fusão de verdes sensíveis ao pH super eclíptica pHluorin11,12 (SEpH) e vermelho mCherry diferenciação de pH13, em MTs permite a quantificação de transporte H+ , em células únicas MT através da alta K+/nigericin calibração técnica14. Como muitos transportadores de iões mover equivalentes de H+ , quantificação de pH intracelular serve como uma representação funcional do movimento de iões através de uma variedade de transportadores. O modelo de sistema de Drosophila MT também oferece ferramentas poderosas de genéticas em tecido-específica do transgene15 e RNA interferência (RNAi)16 expressão, que pode ser combinado com o celular imagens e ensaios todo-órgão17 , 18 , 19 da função do túbulo para criar um conjunto de ferramentas robusto com integração vertical das moléculas de comportamento. Isto contrasta com muitos outros protocolos para avaliação biologia epitelial, como historicamente, tais medidas têm confiado na intrincada e assustadora micro-dissecção, sofisticado eletrodos íon-seletivos20,21, e sensíveis ao pH caro tinge22 com requisitos de carga restritiva e pobre especificidade celular em tecidos heterogêneos. GEpHIs têm sido utilizados para medir o pHeu em uma variedade de tipos de célula23extensivamente. Primeiros trabalhos exploraram a pH-sensibilidade inerente de proteína fluorescente verde (GFP) para monitorar o pHeu em culturas de células epiteliais24 mas nas duas últimas décadas viram GEpHIs usado em neurônios25, glia26, fungos27 , e células de plantas28. A combinação do potencial de segmentação celular de construções genéticas através da expressão de GAL4/UAS sistema15 e a acessibilidade fisiológica de MT a drosófila isto fazer uma preparação ideal para investigações de pHeu regulamento e transporte de íon epitelial.
pHeu regulamento tem sido estudado há décadas e é vital para a vida. A preparação de MT oferece um modelo robusto de ensinar fisiologia do Regulamento pHeu mas também realizar sofisticadas investigações de pHi Regulamento ex vivo e in vivo. Este protocolo descreve a quantificação do movimento H+ através da membrana basolateral das células epiteliais da drosófila MT usando o NH4Cl ácido de pulso técnica21a carregar, mas como o indicador de pH é geneticamente codificado, esses métodos e o seu enquadramento teórico podem ser aplicados a qualquer preparação passível de transgênese e geração de imagens ao vivo.

<table><tbody><tr><td>Solução de Poli-L-Lisina (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td>Loja em 4 &deg; C, pode ser reutilizado.</td></tr><tr><td>Nigericina Sal de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>CUIDADO: Manuseie com luvas. Conservar em alíquotas da solução-mãe a 20 mM em DMSO a 4 °C.</td></tr><tr><td>Tampas adesivas da câmara de perfusão, tamanho do adesivo 1 mm, diâmetro da câmara e espessura 9 mm e vezes; 0,9 mm, diâmetro das portas 1,5 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL622105</td><td>Pode ser substituído conforme necessário para combinar com o sistema de perfusão.</td></tr><tr><td>Kit de Elastômero de Silicone Sylgard 184</td><td>Adesivos Ellsworth</td><td>184 KIT SIL ELAST 0.5KG</td><td>Disponível em vários fornecedores.</td></tr><tr><td>Suportes de Solda Helping Hands</td><td>Harbor Freight Tools</td><td>60501</td><td>Disponível de vários fornecedores.</td></tr><tr><td>Sistema de Perfusão Alimentado por Gravidade Aberto com Controlador de Válvula, Coletor 8 para 1 e Ferramentas</td><td>de Biociência</td><td>Reserviors PS-8S</td><td>Qualquer sistema de perfusão comparável pode ser usado.</td></tr><tr><td>Regulador de Fluxo</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0221</td><td>Pode ser substituído conforme necessário para combinar com o sistema de perfusão.</td></tr><tr>Loja <td>de 21720024</td><td>Científica Fisher Média</td> de <td>Schneider</td><td>em 4 & C em alíquotas estéreis.</td></tr><tr><td>#5 Pinça de Aço Inox</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11252-20</td><td>Pode ser substituído com base no conforto do experimentador.</td></tr><tr><td>Placa de Petri de poliestireno 35 x 10 mm</td><td>Corning Life Sciences</td><td>Fisher Scientific 08-757-100A</td><td>A marca e o tamanho exatos não são importantes.</td></tr><tr><td>75 x 25 milímetros Corning</td><td>Life Sciences</td><td>2949-75X25</td><td>Marcas e tamanhos exatos podem variar desde que os poços de perfusão sejam compatíveis.</td></tr><tr><td>Vidro capilar de borosilicato filimentado, ID 1,5 mm, OD 0,86 mm, espessura 0,32 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0796</td><td>Não é necessário, o vidro pode ser substituído para combinar com tubos de perfusão e poços de perfusão.</td></tr><tr><td>Tubulação Tygon, ID 1/16", OD 1/8", espessura 1/32"</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-171-129</td><td>Disponível em vários fornecedores, pode ser substituído para combinar com o sistema de perfusão.</td></tr><tr><td>Graxa de silicone a vácuo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td>Disponível em vários fornecedores.</td></tr><tr><td>Grampo de controle de fluxo de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-869</td><td>Disponível em vários fornecedores, esterilidade não necessária</td></tr><tr><td>Hastes de vidro, 5 mm de diâmetro</td><td>delphiglass.com</td><td>9198</td><td>O tamanho exato é a preferência pessoal, vários fornecedores disponíveis</td></tr><tr><td>Caneta hidrofóbica PAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td>Disponível em vários fornecedores.</td></tr><tr><td>Filme de vedação</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7668</td><td>Disponível em vários fornecedores.</td></tr><tr><td>Tubo Falcon de 15 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Disponível em vários fornecedores.</td></tr><tr><td>Tubo Falcon de 50 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Disponível em vários fornecedores.</td></tr><tr><td>HEPES; Ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanossulfônico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Disponível em vários fornecedores.</td></tr><tr><td>MES; Ácido 4-morfolineetanossulfônico monohidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69892</td><td>Disponível em vários fornecedores.</td></tr><tr><td>Torneiras; Ácido N-[Tris(hidroximetil)metil]-3-aminopropanossulfônico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5130</td><td>Disponível em vários fornecedores.</td></tr><tr><td>Objetiva de ar 10X/0,45</td><td>Zeiss</td><td>000000-1063-139</td><td>Objetivas comparáveis podem ser substituídas. As objetivas de 40X podem ser usadas para imagens de célula única.</td></tr><tr><td>Estereoscópio de dissecação</td><td>Zeiss</td><td>Discovery.V8</td><td>Qualquer estereoscópio de dissecação pode ser usado.</td></tr><tr><td>UAS-pHerry transgênico Drosophila melagnogaster</td><td>Disponível no Romero Lab</td><td></td><td>Publicado pela primeira vez: Citation 10</td></tr><tr><td>capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td><td>Disponível no Romero Lab</td><td></td><td>Publicado pela primeira vez: Citation 32</td></tr><tr><td>c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td><td>Disponível no Romero Lab</td><td></td><td>Publicado pela primeira vez: Citation 2</td></tr><tr><td>Câmera Digital Monocromática de Alta Sensibilidade</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam 506 mono</td><td>A marca e o modelo exatos podem variar, podem ser substituídos por qualquer câmera monocromática de alta sensibilidade adequada para imagens celulares ao vivo.</td></tr><tr><td>Conjunto de filtros GFP/FITC, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dicróico</td><td>Chroma</td><td>CZ909</td><td>Qualquer conjunto de filtros GFP/FITC pode ser substituído.</td></tr><tr><td>Conjunto de filtros RFP/TRITC, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dicróico</td><td>Chroma</td><td>CZ915</td><td>Qualquer conjunto de filtros GFP/FITC pode ser substituído.</td></tr><tr><td>Microscópio Epifluoescente Invertido</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z.1</td><td>Qualquer microscópio comparável com comutação de filtro motorizado pode ser usado. Os microscópios verticais podem ser usados com banhos de perfusão abertos e objetivas de imersão em água.</td></tr><tr><td>Software de Análise Estatística</td><td>Microcal</td><td>Origin 6.0</td><td>Qualquer software com funcionalidade comparável pode ser substituído por</td></tr><tr><td>Software de Análise de Imagem</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ 1.50i</td><td>Qualquer software com funcionalidade comparável pode ser substituído Software</td></tr> de <tr><td>Aquisição de Imagem</td><td>Zeiss</td><td>Zen 1.1.2.0</td><td>Qualquer software com funcionalidade comparável pode ser substituído</td></tr><tr><td></td><td>Microscopia Eletrônica</td> de Lâmina de Barbear de Aço Carbono de Um Lado <td>71960</td><td>Disponível em vários fornecedores.</td></tr><tr><td>Pasta de Lâminas de Microscopia</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-04</td><td>Disponível em vários fornecedores.</td></tr><tr><td>Bico de Bunsen</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-110-1231</td><td>Disponível de vários fornecedores.</td></tr><tr><td>Frascos de criação de Drosophila de poliestireno com Flugs</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-109BF</td><td>Itens comparáveis podem ser substituídos.</td></tr><tr><td>Balde de Gelo de Laboratório de 2,5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-129</td><td>Disponível em vários fornecedores.</td></tr><tr><td>NMDG; N-Metil-D-glucamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>Disponível em vários fornecedores.</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta de barreira de 200 uL</td><td>MidSci</td><td>AV200</td><td>Disponível em vários fornecedores.</td></tr><tr><td>200 &#956; L pipeta de volume variável</td><td>Gilson Incorporated</td><td>PIPETMAN P200</td><td>Disponível em vários fornecedores.</td></tr></tbody></table>

ph intracelular de quantificação de óptica em drosophila melanogaster túbulo de malpighi epitélios com um indicador de ph fluorescente geneticamente codificado

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Transporte de íons epitelial é vital para a homeostase do íon sistêmica, bem como a manutenção dos gradientes eletroquímicos celulares essenciais. PH intracelular (pHeu) é influenciado por muitos transportadores de íons e assim monitoramento de pH, é uma ferramenta útil para avaliar a atividade de transporte. Moderna geneticamente codificado-indicadores de pH (GEpHIs) fornecem óptica quantificação de pH em células intactas na escala celular e subcellular. Este protocolo descreve em tempo real quantificação do pH celulareu regulamento em túbulos de Malpighi (MTs) de Drosophila melanogaster através de ex vivo ao vivo-imagem latente de pHerry, um pseudo-ratiometric GEpHI com pKum adequado para controlar as alterações do pH no citosol. Extraído de mosca adulta MTs são compostos de seções morfologicamente e funcionalmente distintas de epitélios de célula única camada e podem servir como um modelo acessível e geneticamente tractable para investigação de transporte epitelial. GEpHIs oferecem diversas vantagens sobre os convencionais sensíveis ao pH de corantes fluorescentes e eletrodos íon-seletivos. GEpHIs pode rotular populações de células distintas, desde elementos promotor apropriados estão disponíveis. Esse rótulo é particularmente útil em ex vivo, in vivoe em situ preparações, que são inerentemente heterogêneas. GEpHIs também permitem quantificação de pHi em tecidos intactos ao longo do tempo, sem necessidade de exteriorização de tratamento ou tecido de tintura repetidas. A principal desvantagem de GEpHIs atual é a tendência de agregar no citosol inclusões em resposta ao dano tecidual e sobre-expressão de construir. Estas deficiências, suas soluções e as vantagens inerentes de GEpHIs são demonstradas neste protocolo através de avaliação do transporte de protões (H+) basolateral nas células principais e estreladas funcionalmente distintas de mosca extraída MTs. As técnicas e a análise descrita são facilmente adaptáveis a uma grande variedade de preparações de vertebrados e invertebradas, e a sofisticação do ensaio pode ser dimensionada de ensino labs para intrincados determinação do fluxo de iões através de transportadores específicos.

Tecidos saudáveis e identificação adequada de MTs anteriores são vitais para o sucesso do presente protocolo. Durante a dissecção, deve ter cuidado para não diretamente toque os MTs e identificador único-los pelo ureter como segurando os MTs diretamente conduzirá à quebra (Figura 4A– B). Quando MTs são varridos plana para o slide, túbulos devem ser tocados o mínimo possível e movimento em excesso evitado como isto irá danifi...

Transporte de iões celular muitas vezes pode ser avaliado pelo monitoramento pH intracelular (pHeu). Geneticamente codificado-indicadores de pH (GEpHIs) fornecem óptica quantificação do pH intracelular em células intactas. Este protocolo detalha a quantificação do pH intracelular através de celular ex vivo ao vivo-imagens de túbulos de Malpighi de Drosophila melanogaster com pHerry, um pseudo-ratiometric geneticamente codificado indicador de pH.

PH intracelular de quantificação de óptica em Drosophila melanogaster túbulo de Malpighi epitélios com um indicador de pH fluorescente geneticamente codificado

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

O objetivo geral deste protocolo de imagem é descrever a quantificação do pH intracelular, utilizando um indicador de pH codificado geneticamente, e demonstrar como este método pode ser usado para avaliar o transporte de prótons na região basolateral de um modelo de estrutura renal de inseto, o túbulo de Malpighian. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de transporte celular, como, por exemplo, de que forma proteínas transportadoras específicas contribuem para o movimento de prótons epiteliais na regulação do pH intracelular. A principal vantagem desta técnica é que o transporte celular pode ser rapidamente e facilmente avaliado em múltiplas zonas funcionalmente distintas de epitélios intactos.Embora este método possa fornecer informações sobre a regulação de pH e o epitélio de insetos, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como o néfron de mamíferos e células epiteliais em cultura. Para iniciar este procedimento, posicione dois conjuntos de grampos auxiliares de solda na platina do microscópio de imagem, com um grampo em cada lado. Em seguida, insira as respectivas micropipetas de vidro curvadas e a linha de entrada, e a linha de saída conectada ao vácuo.Em seguida, posicione-os no suporte de ajuda e alinhe-os com a platina de imagem do microscópio. Espalhe graxa de vácuo sobre a fita adesiva do teto e pressione o divisor de poço de perfusão adesivo sobre a fita para revestir a base com graxa. Remova o divisor de poço de perfusão adesivo e coloque-o com o lado da graxa voltado para baixo, sobre uma lâmina revestida com poli-L-lisina.Em seguida, remova o divisor do poço de perfusão para deixar poços individuais delimitados com graxa hidrofóbica. Depois disso, adicione 200 microlitros de PBS-T ou tampão fosfato salino para insetos à temperatura ambiente no poço delineado com graxa na lâmina revestida com poli-L-lisina. Então, posicione a lâmina sob o estereoscópio, despeje meio de Schneider gelado na placa de dissecação e transfira uma única mosca fêmea anestesiada para o meio.Segure a mosca pelo tórax com um par de pin&ccedil;as e use a outra para segurar suavemente o abd&ocirc;men posterior. Abra a extremidade posterior da mosca com movimentos curtos e precisos. Assim que o guarda-posterior ficar vis&iacute;vel, segure sua extremidade distal e libere o intestino e os intestinos anteriores das traqueias subjacentes, puxando o guarda-posterior para longe do corpo por meio de pequenos pux&otilde;es repetitivos.Em seguida, separe cuidadosamente a extremidade anterior do ureter com pinça fina, assim que o segundo conjunto de extremidades estiver livre do abdômen. Segure a extremidade anterior solta com a haste de vidro, deslizando a haste sob o ureter, de modo que os túbulos caiam para cada um dos lados. Após isso, levante a extremidade diretamente para cima, para fora da solução; em seguida, gire a haste de vidro de forma que a extremidade e o ureter adiram à superfície inferior da haste.Posicione o ureter diretamente sobre a lâmina, depois fixe o ureter e selle as extremidades distais dos antes pressionando ainda mais o ureter contra a lâmina de vidro. Use a extremidade fina da haste de vidro para suavemente mover cada túbulos ao longo da superfície da lâmina. Deslize a haste contra a lâmina para evitar esmagar o túbulos e passe a haste por cima do túbulos, movendo-se da extremidade distal para a proximal, a fim de aderir todo o comprimento de cada túbulos à superfície da lâmina revestida com poli-L-lisina.O sucesso dessa técnica depende inteiramente da identificação precisa e do manuseio cuidadoso dos túbulos de Malpighi anteriores. Túbulos danificados produzirão resultados inconsistentes. Em seguida, coloque novamente o divisor de poço adesivo sobre a lâmina para formar um pequeno poço preenchido com fluido sobre o túbulo montado.Em seguida, coloque o espécime sobre a platina do microscópio. Posicione os capilares de entrada e saída sobre as aberturas de entrada e saída do poço de perfusão, respectivamente. Neste procedimento, ligue o microscópio, a fonte de luz e o sistema de imageamento e, então, abra o software de imageamento.Olhe através das oculares e ajuste manualmente o foco até que a luz transmitida mostre claramente a luz do lúmen dos antes. Em seguida, clique na aba de aquisição e selecione 2x2 no menu suspenso de atenuação, na seção de carga de aquisição. Insira um filtro neutro de densidade de 5% no trajeto da luz, para reduzir a iluminação e minimizar o fotoenvelhecimento.Clique no canal GFP no menu de canais e, em seguida, clique em "live" para observar o sinal fluorescente através da câmera. Ajuste então o controle deslizante de tempo para definir o tempo de exposição, de modo que os valores de pixel mais brilhantes no histograma de intensidade sejam aproximadamente 40% do valor máximo. Em seguida, clique em "stop" para interromper a iluminação.Repita os procedimentos no canal RFP e confirme a presença do segmento inicial dilatado do ante anterior e a ausência de agregados de m-cherry citossólico, o que indica dano tecidual ou superexpressão. Em seguida, ative um protocolo de aquisição de imagens em timelapse marcando a caixa de seleção série temporal. Ajuste a duração no menu suspenso, na seção série temporal, para 10 minutos, e o controle deslizante de intervalo para zero, para definir o tempo total de captura com a aquisição máxima de imagens.Em seguida, marque as caixas GFP e RFP na seção de canais. Abra a linha de IPBS do sistema de perfusão ativando o controlador de válvula apropriado e inicie o protocolo de imagem clicando em "start experiment". Após um minuto, mude para a solução de cloreto de amônio por 20 segundos, abrindo a válvula apropriada e fechando a linha de IPBS.Em seguida, retorne ao IPBS fechando a linha de cloreto de amônio e reabrindo a válvula de IPBS. Para realizar uma calibração de dois pontos, remova o divisor do poço destacando-o da lâmina subjacente e remova as capilares de perfusão com grampos do poço de imagem. Em seguida, aplique 200 microlitros de tampão IPBS de calibração a pH 7,4.Em seguida, remova a solução do poço de imagem e substitua por outros 200 microlitros de solução de calibração. Repita este processo quatro vezes para garantir a troca completa da solução. A seguir, incube a preparação e a solução de calibração por 30 minutos antes da aquisição de imagens.Repita o protocolo de aquisição de imagens utilizando os mesmos parâmetros determinados anteriormente, com a modificação de apenas um minuto de captura de imagem. Em seguida, adicione 200 microlitros de tampão IPBS de calibração para pH 9. Remova a solução do poço de imagem e substitua por outros 200 microlitros de solução de calibração.Posteriormente, incubar a preparação na segunda solução de calibração por 10 minutos antes da aquisição de imagens e repetir o protocolo de aquisição. Em seguida, revisar as imagens capturadas empilhadas no software de análise de imagens para confirmar que nenhum pixel em qualquer canal está saturado, clicando em MeanROI, e que nenhum valor relatado no histograma de intensidade atingiu o valor máximo detectável, enquanto se navega pelo empilhamento de imagens com o controle deslizante de quadros. Em seguida, analisar o empilhamento de imagens plotando a intensidade fluorescente e a razão de fluorescência como função do tempo; aqui, observamos a resposta fluorescente esperada ao pulso de cloreto de amônio nos canais sensível e insensível ao pH do indicador.A razão entre esses sinais revela a transitoriedade do pH intracelular. Para realizar esta análise, clique primeiro em médiaROI e selecione a ferramenta de forma livre. Mantenha pressionado o botão esquerdo do mouse para traçar um MT de 50 micrômetros e clique com o botão direito para finalizar o desenho da ROI.Em seguida, repita isso em uma área adjacente ao MT, para definir a ROI de fundo. Depois, clique em intensidade média em medições, crie uma tabela de valores de intensidade clicando em exportar, tabela de dados, criar. Clique no ícone do relógio de configuração e desmarque todos os parâmetros, exceto tempo e intensidade média.Clique com o botão direito na guia da tabela de dados recém-criada, selecione salvar como e exporte os dados como um arquivo csv. É mostrada aqui uma imagem de campo amplo, uma fluorescência superelíptica da fluorina nas células principais do antro anterior e nas células estreladas do antro anterior. Observe que as células estreladas têm formato de bastão no segmento inicial, são variáveis no segmento de transição e exibem projeções celulares distintas no segmento principal.Este gráfico mostra as alterações no pH intracelular calibrado em resposta a um pulso de 20 segundos de cloreto de amônio 40 milimolar em regiões de interesse. As curvas tracejadas indicam ajustes exponenciais simples aplicados à fase de recuperação ácida, após a retirada do cloreto de amônio. A partir desses ajustes, são derivados os valores da constante de decaimento.Este gráfico mostra a taxa de extrusão de ácido representada como uma função do pH intracelular, e este gráfico mostra o fluxo ácido representado como uma função do pH intracelular, derivado dos ajustes exponenciais da figura anterior. Uma vez dominada, a extração dos túbulos de Malpighi pode ser realizada em até 10 minutos, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o sucesso depende inteiramente da qualidade da dissecação e da calibração precisa do indicador de pH.Este preparo pode ser combinado com outros biossensores geneticamente codificados, como indicadores fluorescentes de cálcio e de haleto, para estudar o movimento de solutos e a sinalização intracelular em células epiteliais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar túbulos de Malpighian saudáveis de drosófila, imagens de um indicador de pH geneticamente codificado e quantificar o movimento de prótons em células epiteliais. Não se esqueça de que trabalhar com nitroizene pode ser perigoso e danificar os preparos; portanto, precauções devem ser tomadas durante este procedimento, para garantir que ele não contamine nenhum equipamento que será reutilizado.

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Biologia

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