PH intracelular de quantificação de óptica em Drosophila melanogaster túbulo de Malpighi epitélios com um indicador de pH fluorescente geneticamente codificado

O objetivo geral deste protocolo de imagem é descrever a quantificação do pH intracelular, usando um indicador de pH codificado geneticamente e demonstrar como esse método pode ser usado para avaliar o transporte de prótons basolateral em um modelo de estrutura renal de inseto, o túbulo de Malpighi. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do transporte celular, como proteínas transportadoras específicas contribuem para o movimento epitelial do próton na regulação do pH intracelular. A principal vantagem dessa técnica é que o transporte celular pode ser avaliado de forma rápida e fácil em várias zonas funcionalmente distintas de epitelial intacto.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a regulação do pH e o epitélio do inseto, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como o néfron de mamíferos e as células epiteliais em cultura. Para iniciar este procedimento, posicione dois conjuntos de grampos de solda nas mãos auxiliares no estágio do microscópio de imagem, com um grampo de cada lado. Em seguida, insira os respectivos capilares de vidro dobrados e a linha de entrada e a linha de saída conectada a vácuo.

Em seguida, monte-o nas mãos amigas e alinhe-as com o estágio de imagem do microscópio. Espalhe graxa a vácuo na fita do teto e pressione o divisor de poço de profusão adesiva na fita para revestir o fundo com graxa. Retire o divisor de poço de perfusão adesiva e coloque-o com o lado da graxa voltado para baixo, em cima de uma lâmina revestida de poli l lisina.

Em seguida, remova o divisor do poço de perfusão para deixar poços específicos individuais traçados em graxa hidrofóbica. Depois disso, coloque 200 microlitros de IPBS à temperatura ambiente ou solução salina tampão fosfato de inseto no untado e circule bem na lâmina revestida de poli l lisina. Em seguida, coloque a lâmina sob o esteroscópio, despeje o meio de Schneider gelado no prato de dissecação e transfira uma única mosca fêmea anestesiada para ele.

Segure a mosca pelo tórax com um conjunto de pinças e use a outra para segurar suavemente a parte posterior do abdômen. Abra a extremidade posterior da braguilha em movimentos curtos e deliberados. Assim que a guarda traseira estiver visível, segure a extremidade distal e liberte o intestino e as antes das traqueias subjacentes, puxando a guarda traseira para longe do corpo por meio de puxões breves repetitivos.

Em seguida, retire as antes anteriores do ureter com uma pinça fina, uma vez que o segundo conjunto de antes esteja livre do abdômen. Pegue os antes anteriores livres com a haste de vidro do poste, deslizando a haste sob o ureter, de modo que os túbulos caiam para ambos os lados. Em seguida, levante as antes para cima, para fora da solução, depois gire a haste de vidro de forma que as antes e o ureter fiquem aderidos à parte inferior da haste.

Abaixe o ureter diretamente para baixo na lâmina e, em seguida, fixe o ureter e sele as extremidades distais das antes pressionando ainda mais o ureter na lâmina de vidro. Use a extremidade fina da haste de vidro para varrer suavemente cada túbulo pela superfície da corrediça. Raspe a haste contra a corrediça para evitar esmagar o túbulo e deslize a haste sobre a parte superior do túbulo, movendo-se de distal para proximal, para prender todo o comprimento de cada túbulo à superfície da lâmina revestida de poli l lisina.

O sucesso desta técnica depende inteiramente da identificação precisa e do manuseio cuidadoso dos túbulos anteriores de Malpighi. Túbulos danificados produzirão resultados inconsistentes. Em seguida, coloque o divisor de poço de profusão adesivo de volta na lâmina para formar um pequeno fluido preenchido bem sobre o túbulo montado.

Depois disso, coloque a amostra no microscópio stage. Posicione os capilares de entrada e saída sobre a abertura de entrada e saída do poço de profusão, respectivamente. Neste procedimento, ligue o microscópio, a fonte de luz e o sistema de imagem e, em seguida, abra o software de imagem.

Olhe através das oculares e ajuste manualmente o foco até que o lúmen dos antes seja claramente visível sob a luz transmitida. Em seguida, clique na guia de aquisição e selecione, 2x2 no menu suspenso de escurecimento, na seção de carga de aquisição. Insira um filtro de densidade neutra de 5% no caminho da luz, para reduzir a luz de iluminação e minimizar o fotobranqueamento.

Clique no canal GFP no menu de canais e, em seguida, clique ao vivo para observar o sinal fluorescente através da câmera. Depois disso, ajuste o controle deslizante de tempo para definir o tempo de exposição, de modo que os valores de pixel mais brilhantes no histograma de intensidade sejam aproximadamente 40% do valor máximo. Em seguida, clique em parar para interromper a iluminação.

Repita os procedimentos no canal RFP e confirme a presença do segmento inicial dilatado da ante anterior e a ausência de agregados citossólidos m cereja, o que indica dano tecidual ou superexpressão. Depois, habilite um protocolo de imagem de lapso de tempo clicando na caixa de seleção da série temporal. Ajuste a duração no menu suspenso, na seção de séries temporais para 10 minutos, e o controle deslizante de intervalo para zero, para definir o tempo total de captura com a aquisição máxima de imagem.

Em seguida, marque as caixas GFP e RFP na seção de canal. Abra a linha IPBS do sistema de profusão ativando o controlador de válvula apropriado e inicie o protocolo de imagem clicando em iniciar experimento. Após um minuto, mudar para a solução de cloreto de amónio durante 20 segundos, abrindo a válvula adequada e fechando a linha IPBS.

Em seguida, retorne ao IPBS fechando a linha de cloreto de amônio e reabrindo a válvula IPBS. Para realizar uma calibração de dois pontos, remova o divisor do poço retirando-o da lâmina subjacente e remova os capilares de profusão em grampos do poço de imagem. Em seguida, aplique 200 microlitros de tampão IPBS de calibração a pH 7,4.

Em seguida, remova a solução do poço de imagem e substitua-a por mais 200 microlitros de solução de calibração. Repita esse processo quatro vezes para garantir a troca completa da solução. Em seguida, incube a solução de preparação e calibração por 30 minutos antes da imagem.

Repita o protocolo de imagem usando os mesmos parâmetros determinados anteriormente, com a modificação de apenas um minuto de captura de imagem. Em seguida, adicione 200 microlitros de tampão IPBS de calibração a pH nove. Remova a solução do poço de imagem e substitua-a por outros 200 microlitros de solução de calibração.

Em seguida, incubar a preparação na segunda solução de calibração durante 10 minutos antes da imagem e repetir o protocolo de imagem. Depois disso, revise a imagem capturada empilhada no software de análise de imagem para confirmar se nenhum pixel em nenhum dos canais está saturado, clicando em MeanROI e se nenhum valor relatado no histograma de intensidade atingiu o valor máximo detectável, enquanto rola pela pilha de imagens com o controle deslizante de quadro. Em seguida, analise a pilha de imagens plotando a intensidade fluorescente e a taxa de fluorescência em função do tempo, aqui, vemos a resposta fluorescente esperada ao pulso de cloreto de amônio nos canais sensíveis e insensíveis ao pH do indicador.

A proporção desses sinais revela a transitoriedade do pH intracelular. Para realizar essa análise, primeiro clique em meanROI e selecione a ferramenta de forma livre. Mantenha o botão esquerdo do mouse para traçar um MT de 50 micrômetros e clique com o botão direito para terminar de desenhar o ROI.

Em seguida, repita isso em uma área adjacente ao MT, para definir o ROI em segundo plano. Em seguida, clique em intensidade média em medições, crie uma tabela de valores de intensidade clicando em exportar, tabela de dados, criar. Clique no ícone da roda do relógio de configuração e desmarque todos os parâmetros, exceto tempo e intensidade média.

Clique com o botão direito do mouse na guia da tabela de dados recém-criada, selecione salvar como e exporte os dados como um arquivo csv. Aqui é mostrada uma imagem de campo amplo, uma fluorescência de flúor super-elíptica nas células principais da ante anterior e células estreladas da ante anterior. Observe que as células estreladas são em forma de barra no segmento inicial, variáveis no segmento de transição e exibem projeções celulares distintas no segmento principal.

Este gráfico mostra as mudanças de pH intercelular calibradas em resposta a 20 segundos, 40 milimolares de cloreto de amônio As curvas tracejadas denotam ajustes exponenciais únicos aplicados à fase de recuperação ácida, após a retirada do cloreto de amônio. A partir do qual, os valores constantes decaídos são derivados.

Este gráfico mostra a taxa de extrusão ácida plotada em função do pH intracelular e este gráfico mostra o fluxo ácido plotado em função do pH intracelular, derivado dos ajustes exponenciais da figura anterior. Uma vez dominada, a extração do túbulo de Malpighi pode ser feita em 10 minutos, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o sucesso depende inteiramente da qualidade da dissecção e da calibração precisa do indicador de pH.

Esta preparação pode ser combinada com outros biossensores geneticamente codificados, como indicadores fluorescentes de cálcio e haleto para estudar o movimento do soluto e a sinalização intracelular em células epiteliais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar túbulos drosophila malpighian saudáveis, obter imagens de um indicador de pH geneticamente codificado e quantificar o movimento de prótons nas células epiteliais. Não se esqueça que trabalhar com nitroizeno pode ser perigoso e danificar os preparativos e, portanto, devem ser tomadas precauções ao realizar este procedimento, para garantir que não contamine nenhum equipamento que seja reutilizado.