Uma estratégia de duas etapas que combina modificação epigenética e sinais biomecânicos para gerar células pluripotentes mamíferas

O protocolo mostrado neste vídeo combina pela primeira vez o uso de apagamento epigenético químico com pistas biomecânicas para induzir e manter a pluripotência em células adultas terminalmente diferenciadas. O principal ponto forte deste protocolo é que ele não requer vetores transgênicos ou virais. Além disso, é robusto, altamente reprodutível e flexível.

Esta técnica não requer o uso de transfecção gênica e, portanto, representa um avanço tecnológico notável para a medicina translacional e terapia celular, ao mesmo tempo em que suporta a cultura de longo prazo de células de alta plasticidade. Demonstrando o procedimento estarão Georgia Pennarossa, professora assistente, e Teresina De Iorio, estudante de doutorado do meu laboratório. Comece preparando uma solução estoque fresca de 5-aza-CR de um milimolar.

Pese 2,44 miligramas de 5-aza-CR e dissolva-o em 10 mililitros de DMEM com alto teor de glicose. Ressuspenda o pó por vórtice e esterilize a solução com um filtro de 0,22 micrômetro. Preparar a solução de trabalho 5-aza-CR diluindo um microlitro da solução-mãe num mililitro de meio de cultura de fibroblastos.

Tripsinize as células conforme descrito no manuscrito do texto e desaloje-as com pipetagem suave. Em seguida, colete a suspensão celular e transfira-a para um tubo cônico. Conte as células usando uma câmara de contagem sob um microscópio óptico.

Centrifugar a suspensão celular a 150 vezes G durante cinco minutos. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet para obter 40.000 células em 30 microlitros de meio de cultura de fibroblastos suplementado com 5-aza-CR de um micromolar. Encha uma placa de Petri de 35 milímetros com pó de PTFE para produzir um leito e dispense os 30 microlitros de células no leito de pó.

Gire suavemente a placa de Petri em movimentos circulares para garantir que o pó de PTFE cubra totalmente a superfície da gota de líquido para formar um microbiorreator de mármore líquido. Pegue o microbiorreator de mármore líquido usando uma ponta de pipeta de 1000 microlitros que foi cortada para acomodar o diâmetro do mármore. Coloque o microbiorreator em uma placa de Petri bacteriológica limpa para estabilizá-lo.

Em seguida, transfira o microbiorreator da placa de Petri para uma placa de 96 poços. Adicione lentamente 100 microlitros de mídia da margem do poço. O microbiorreator deve flutuar sobre o meio.

Incube o microbiorreator de mármore líquido por 18 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, colete o microbiorreator de mármore líquido usando uma ponta de pipeta de 1000 microlitros e coloque-o em uma nova placa de Petri bacteriológica de 35 milímetros. Use uma agulha para perfurar o mármore líquido e quebrá-lo.

Recupere os esferóides formados com uma ponta de pipeta de 200 microlitros que foi cortada na borda sob um estereomicroscópio. Para lavar os resíduos de 5-aza-CR, transfira os organoides para uma placa de Petri contendo meio ESC. Prepare uma nova placa de Petri de 35 milímetros contendo o leito de pó de PTFE e dispense um único organoide em uma gota de 30 microlitros de meio de cultura ESC sobre o pó usando uma ponta de pipeta cortada de 200 microlitros.

Gire suavemente o prato em movimentos circulares para formar um novo microbiorreator de mármore líquido e transfira-o para um poço de uma placa de 96 poços. Adicione 100 microlitros de mídia da margem do poço para banhar lentamente o mármore. Cultive os microbiorreatores de mármore líquido a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

As análises morfológicas mostram que após uma incubação de 18 horas com o agente desmetilante 5-aza-CR, fibroblastos de três espécies de mamíferos encapsulados em microbiorreatores de PTFE se agregaram e formaram estruturas esféricas 3D com uma geometria de tamanho uniforme. Em condições 3D, 86,31% das células encapsuladas modificaram notavelmente seu fenótipo. Em contraste, as células pós-5-aza-CR cultivadas em condições padrão 2D eram consideravelmente menores em tamanho, com núcleos granulados e mantinham uma distribuição de monocamada.

As alterações morfológicas foram acompanhadas pelo início da expressão gênica relacionada à pluripotência, tanto em células 3D quanto em 2D pós-5-aza-CR. A transcrição foi observada para POU classe cinco homeobox um, NANOG homeobox, proteína dedo de zinco ZFP42 e região determinante do sexo Ybox2, que estão ausentes em fibroblastos não tratados. Uma regulação positiva significativa da molécula de adesão de células epiteliais de translocação 10-11 2 e dos genes da caderina 1 também foi observada em células 3D pós-5-aza-CR em comparação com células cultivadas em placas de plástico padrão 2D.

Paralelamente, a regulação negativa do antígeno de superfície celular Thy1 marcador específico de fibroblastos foi detectada em células 3D e 2D pós-5-aza-CR. Uma diminuição significativa dos níveis de metilação em células 3D e 2D pós-5-aza-CR foi confirmada com ELISA. Os níveis de metilação do DNA foram significativamente menores em células 3D pós-5-aza-CR em comparação com as células cultivadas em condições 2D.

Além disso, as células 3D pós-5-aza-CR retiveram a estrutura esférica 3D adquirida, altos níveis de expressão de genes relacionados à pluripotência e baixos níveis de metilação do DNA por 28 dias, momento em que a cultura foi interrompida. Os microbiorreatores também podem ser usados para manter as condições ideais para culturas de células progenitoras, bem como para aumentar a eficiência da diferenciação terminal.