Name: Uma estratégia de duas etapas que combina modificação epigenética e sinais biomecânicos para gerar células pluripotentes mamíferas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprenda a gerar células pluripotentes sem vetores virais combinando apagamento epigenético químico e estímulos biomecânicos em fibroblastos de mamíferos. Este método robusto oferece avanços para medicina regenerativa e terapia celular.

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Este trabalho foi financiado pela Fundação Carraresi e pelo MiND Foods Hub ID: 1176436. Todos os autores são membros do COST Action CA16119 In vitro 3D total cell guidance and fitness (CellFit).

Todos os estudos foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Milão. Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, publicado pelo Instituto Nacional de Saúde dos EUA (NIH). O isolamento de células humanas de indivíduos adultos saudáveis foi aprovado pelo Comitê de Ética do Ospedale Maggiore Policlinico, Milano. Todos os métodos do nosso estudo foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas.
1. Isolamento do fibroblasto de pele
NOTA: Todos os procedimentos descritos abaixo podem ser aplicados a fibroblastos isolados de diferentes espécies de mamíferos, incluindo camundongos, suínos e humanos. As células murinas foram isoladas de camundongos machos de 7 semanas de idade e tecido da pele suína foram coletados no matadouro local. As células humanas foram isoladas de pacientes adultos, após consentimento por escrito.
<ol><li>Prepare 0,1% solução de gelatina suína.<ol>
<li>Pesar 0,1 g de gelatina suína e dissolvê-la em 100 mL de água. Esterilizar a solução de gelatina por autoclaving antes de usar.</li>
		<li>Cubra placa de Petri de 35 mm com gelatina suína de 0,1%, adicionando 1,5 mL da solução preparada. Incubar por 2h em temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Corte biópsias de pele de mamíferos (camundongos, suínos e humanos) de aproximadamente 2-5 cm de comprimento e coloque-os na linha salina tamponada fosfato (PBS) de Dulbecco contendo 2% de solução antimíctica antimíctica antimíctica. Armazenar a + 4 °C até usar. NOTA: As coletas de biópsia devem ser realizadas de acordo e após a aprovação do Comitê de Ética, de acordo com as diretrizes estabelecidas.</li>
	<li>Lave extensivamente as biópsias coletadas três vezes em PBS fresco estéril contendo 2% de solução antimicomolética antibiótico.</li>
	<li>Coletar biópsias da última lavagem e colocá-las em uma placa de Petri estéril de 100 mm. Use um bisturi estéril para cortá-los em pedaços de aproximadamente 2 mmde tamanho 3 .</li>
	<li>Ao final da incubação de 2 h, remova o excesso de solução de gelatina da placa de Petri de 35 mm (descrita na etapa 1.1.2) e, usando uma pinça cirúrgica estéril, coloque imediatamente 5-6 fragmentos de pele em cada prato de cultura pré-revestido.</li>
	<li>Molhe os fragmentos adicionando 100 gotículas μL de meio de isolamento do fibroblasto (Tabela 1) sobre cada uma delas. Cultura a 37 °C em 5% incubadora de CO2 . NOTA: Para evitar que o meio se evase, coloque a placa de Petri de 35 mm dentro de uma placa de Petri de 100 mm ou maior contendo água estéril. Certifique-se de tampar ambas as placas de Petri.</li>
	<li>Após 24h de cultura, verifique a quantidade do meio na placa de Petri cultura de 35 mm. Se necessário, adicione 500 μL de meio de isolamento do fibroblasto para manter molhado os fragmentos.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o meio e atualize-o pelo menos a cada 2 dias de cultura usando uma pipeta.</li>
	<li>Quando os fibroblastos começam a crescer fora dos fragmentos de pele colocados na placa de Petri de 35 mm (descrita na etapa 1.5.) e começam a formar uma monocamada celular (geralmente 6 dias). Remova as peças da pele usando uma pinça cirúrgica estéril e cultura em 2 mL de meio de isolamento do fibroblasto.</li>
	<li>Continue a cultivar a monocamada celular a 37 °C em 5% de incubadora de CO2 até 80% de confluência e atualizar o meio a cada dois dias.</li>
</ol>2. Cultura da linha celular primária do fibroblasto
<ol><li>Quando os fibroblastos atingirem 80% de confluência, remova cuidadosamente as células de isolamento do fibroblasto e lave as células três vezes com 3 mL de PBS contendo 1% de solução antimicocótica antibiótico.</li>
	<li>Para desapego celular, adicione 600 μL de solução trypsin-EDTA de 0,25% no prato de cultura e incubar a 37 °C por 3-5 min.</li>
	<li>Adicione 5,4 mL de cultura fibroblasto para neutralizar a trippsina quando as células começarem a se desprender do prato de cultura (Tabela 1).</li>
	<li>Desalojar células por tubulação repetida e suave. Células de placas em novos pratos de cultura (sem gelatina), mantendo a razão de passagem entre 1:2 e 1:4 (dependendo da taxa de crescimento). NOTA: A centrifugação não é necessária.</li>
	<li>Manter as células na cultura e mudar de meio a cada 2 dias, até que elas tenham atingido 80% de confluência e passá-las. NOTA: Propagar fibroblastos duas vezes por semana para manter o crescimento vigoroso.</li>
</ol>3. Exposição do fibroblasto ao 5-aza-CR
<ol><li>Prepare a solução fresca de estoque 1 mM 5-aza-CR.<ol>
<li>Pese 2,44 mg de 5-aza-CR e dissolva-o em 10 mL de DMEM de alta glicose. Resuspend o pó por vórtice. Esterilize a solução com filtro de 0,22 μm. NOTA: A solução de estoque de 5 aza-CR deve ser preparada imediatamente antes do uso.</li>
		<li>Prepare a solução de trabalho de 5 aza-CR diluindo 1 μL de solução de estoque de 5 aza-CR (3.1.1.) em 1 mL de meio de cultura fibroblasto. NOTA: A concentração da solução de trabalho de 5 aza-CR é de 1 μM 1,2,3,8,9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Células de trypsinize como descrito anteriormente (2.1.-2.3.) e desalojam células repetidamente e suavemente.</li>
	<li>Pegue a suspensão da célula e transfira-a para um tubo cônico.</li>
	<li>Conte células usando uma câmara de contagem sob um microscópio óptico à temperatura ambiente. Calcule o volume de células médias necessárias para re suspendê-los para obter 4 x 104 células em 30 μL de cultura fibroblasto complementada com 1 μM 5-aza-CR (ver passo 3.1.2.). NOTA: A fórmula a ser utilizada depende do tipo específico de câmara. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61655/61655equ01v3.jpg">
</li>
	<li>Centrifugar a suspensão celular a 150 x g por 5 min a temperatura ambiente. Remova a pelota supernascedora e resuspend com o meio de cultura fibroblasto suplementado com 1 μM 5-aza-CR (ver passo 3.1.2.). Para que o volume do meio de cultura do fibroblasto seja utilizado, consulte o passo 3.4. NOTA: Como controle negativo, as células resuspend ad a mesma concentração no meio de cultura fibroblasto sem 5-aza-CR e proceder com encapsulamento celular em pó PTFE (passo 4.1.-4.13.).</li>
</ol>4. Encapsulamento de fibroblasto em micro-bioreatores PTFE
<ol><li>Encha uma placa de Petri de 35 mm com pó de politetrafluoroetileno (PTFE) para produzir uma cama (Figura 1A). NOTA: Use placas de Petri de bacteriologia de 35 mm para evitar a adesão ao mármore líquido. Para obter uma fina concha hidrofóbica e porosa, use um pó PTFE com um tamanho médio de partícula de 1 μm e produzido com uma moagem máxima de 2,0 NPIRI. Isso permite a criação de mármores líquidos permeáveis a gás. Além disso, o revestimento translúcido facilita a observação de processos de agregação celular em tempo real Tamanho de partícula maior leva a alta polidispersidade que pode causar evaporação elevada, deformidade e perda da forma esférica, e a dissolução prematura dos micro-bioreatores.</li>
	<li>Dispense 30 μL de gotícula única contendo 4 x 104 células (ver passos 3.4.- 3,5.) no leito de pó (Figura 1B).</li>
	<li>Gire suavemente a placa de Petri de 35 mm em um movimento circular para garantir que o pó PFTE cubra inteiramente a superfície da gota líquida para formar um micro-bioreator de mármore líquido (Figura 1C).</li>
	<li>Pegue o micro-bioreator de mármore líquido usando uma ponta de pipeta de 1.000 μL, cortada na borda, para acomodar o diâmetro do mármore (Figura 1D,E). Coloque o micro-bioreator de mármore líquido em uma placa de Petri bacteriologia limpa para estabilizá-la (Figura 1F). NOTA: Para criar um atrito para segurar o mármore dentro da ponta, corte as pontas da pipeta com um diâmetro aproximadamente ligeiramente menor do que o diâmetro do mármore líquido.</li>
	<li>Transfira o micro-bioreator de mármore líquido da placa de Petri para uma placa de 96 poços (um mármore/bem) (Figura 1G).</li>
	<li>Adicione lentamente 100 μL de mídia da margem do poço. O micro-bioreator começa a flutuar em cima da mídia (Figura 1H). NOTA: O micro-bioreator quebra em contato líquido direto, devido ao rompimento da hidrofobiidade ptfe. Como abordagem alternativa, os micro-bioreatores de mármore líquido podem ser colocados individualmente em um prato de cultura bacteriologia de 35 mm. Neste caso, para evitar a evaporação líquida do mármore, a placa de Petri de 35 mm contendo o micro-bioreator deve ser inserida em uma placa de Petri de 100 mm, anteriormente aliquoed com água estéril</li>
	<li>Incubar micro-bioreator de mármore líquido por 18 h a 37 °C em incubadora de CO2 de 5% 1,2,3,8,9. NOTA: O tamanho da partícula PTFE de 1 μm pode garantir uma troca de gás ideal entre o líquido interior e o ambiente circundante.</li>
	<li>Após a incubação de 5 aza-CR por 18 h, colete o micro-bioreator de mármore líquido usando um corte de ponta de pipeta de 1.000 μL na borda (ver passo 4.5).</li>
	<li>Coloque o micro-bioreator em uma nova placa petriologia de 35 mm (Figura 1D-F).</li>
	<li>Use uma agulha para perfurar o mármore líquido e quebrá-lo.</li>
	<li>Recuperar esferoides formados com uma ponta de pipeta de 200 μL, cortada na borda, sob um estereomicroscope (Figura 1I,J). NOTA: Células epigeneticamente apagadas encapsuladas em PTFE formam uma estrutura esférica 3D (um agregado em cada mármore líquido).</li>
	<li>Para avaliar a aquisição de estado pluripotente em resposta ao 5-aza-CR, verifique o início da expressão genética relacionada à pluripotência, OCT4, NANOG, REX1 e SOX2, por PCR qualitativo (Tabela 2).</li>
	<li>Prossiga com a segunda etapa do protocolo, conforme descrito abaixo.</li>
</ol>5. Cultura em micro-bioreatores ptfe de células epigeneticamente apagadas
<ol><li>Prepare o meio de cultura ESC fresco (Tabela 1).</li>
	<li>Transfira organoides em uma placa de Petri contendo meio ESC para lavagem de resíduos de 5 aza-CR (ver etapas 5.1.-5.2.).</li>
	<li>Prepare uma nova placa petriologia de 35 mm contendo cama de pó PTFE (veja também o passo 4.1.).</li>
	<li>Dispense um organoide único em uma gotícula de 30 μL ESC meio de cultura no leito de pó usando uma ponta de pipeta de 200 μL, cortada na borda (ver passos 4.9.; 5.3.).</li>
	<li>Gire suavemente a placa de Petri de 35 mm em um movimento circular para formar um novo micro-bioreator de mármore líquido, pegue-a usando uma ponta de pipeta de 1.000 μL, corte na borda e coloque o micro-bioreator recém-formado em um poço de placa de 96 poços (um mármore/bem) (ver passos 4.3.-4.6.).</li>
	<li>Para flutuar os micro-bioreatores, adicione 100 μL de mídia da margem do poço para banhar lentamente o mármore (ver nota 4.7.).</li>
	<li>Micro-bioreatores de mármore líquido de cultura a 37 °C em incubadora de CO2 de 5% pelo tempo necessário. Troque de meio a cada dois dias, seguindo o procedimento descrito em 5.3.-5.7. NOTA: No presente manuscrito, são fornecidos resultados obtidos com cultura organoides durante 28 dias. No entanto, se necessário, um período de cultura mais longo pode ser realizado.</li>
</ol>

<ol><li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+demethylation+step+allows+the+conversion+of+adult+human+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+pig+dermal+fibroblast+into+insulin+secreting+cells+by+a+brief+exposure+to+5-aza-cytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).</li>
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<li>Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+azacytidine+step+allows+the+conversion+of+suspension+human+fibroblasts+into+neural+progenitor-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Journal%22%5BJournal%5D)">Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells.</a> Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).</li>
<li>Tan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+tissue+engineering+and+regeneration+through+epigenetic+reprogramming+and+scaffold+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation.</a> Scientific Reports. 5, 16333(2015).</li>
<li>Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+conversion+of+adult+dog+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).</li>
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<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+erasing+and+pancreatic+differentiation+of+dermal+fibroblasts+into+insulin-producing+cells+are+boosted+by+the+use+of+low-stiffness+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+reviews+and+reports%22%5BJournal%5D)">Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate.</a> Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+PTFE+micro-bioreactor+to+promote+3D+cell+rearrangement+and+maintain+high+plasticity+in+epigenetically+erased+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).</li>
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<li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1%2F2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li>
<li>Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Azacytidine%2C+DNA+methylation%2C+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).</li>
<li>Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5-azacytidine+and+its+2%27-deoxyderivative+on+cell+differentiation+and+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation.</a> Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).</li>
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<li>Varelas, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAZ+controls+Smad+nucleocytoplasmic+shuttling+and+regulates+human+embryonic+stem-cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).</li>
<li>Panciera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem%2FProgenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP%2FTAZ%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li>
<li>Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+signaling-directed+YAP%2FTAZ+regulation+encourages+3D+spheroid+colony+formation+and+boosts+plasticity+of+parthenogenetic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Durante as últimas décadas, diversos estudos se concentraram no desenvolvimento de estratégias para reverter uma célula terminalmente diferenciada para um estado permissivo menos comprometido e maior. O protocolo aqui descrito permite a geração e manutenção a longo prazo de células pluripotentes a partir de células adultas maduras terminais diferenciadas. O método combina duas etapas independentes que envolvem a indução de um estado permissivo elevado que é alcançado através de apagamento epigenético químico e sua manute...

Durante as últimas décadas, o conceito amplamente aceito de progressão unidirecional em direção ao comprometimento e diferenciação celular foi completamente revisto. Foi demonstrado que a especificação celular pode ser revertida, e uma célula terminantemente diferenciada pode ser empurrada para um estado permissivo menos comprometido e mais alto, usando diferentes métodos.
Entre os vários métodos propostos, um dos métodos mais promissores envolve o uso de compostos químicos para induzir células em uma chamada pluripotência quimicamente induzida. As pequenas moléculas utilizadas nesta abordagem são capazes de interagir e modificar a assinatura epigenética de uma célula adulta madura, evitando a necessidade de qualquer vetor transgênico e/ou viral 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Inúmeros estudos têm mostrado recentemente que é possível mudar as células de um fenótipo para outro, fornecendo estímulos bioquímicos e biológicos específicos que induzem a reativação de genes hipermetilados 11,12,13,14,15. Esses eventos de desmetilação permitem a conversão de células terminais diferenciadas em um progenitor primitivo, um multipotente ou uma célula de alta plasticidade/pluripotente 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Paralelamente, muitos estudos têm se concentrado recentemente na compreensão de pistas relacionadas à mecanosensagem e, mais especificamente, na possibilidade de usar forças mecânicas para influenciar diretamente a plasticidade celular e/ou diferenciação 16,17,18,19. De fato, foi claramente demonstrado que a matriz extracelular (ECM) desempenha um papel fundamental no controle do destino celular. Em particular, os sinais biomecânicos e biofísicos produzidos pelo ECM regulam diretamente mecanismos moleculares e vias de sinalização, influenciando o comportamento celular e funções20,21. Esses dados recentes abriram caminho para o desenvolvimento de novos sistemas de cultura 3D que imitam mais de perto o microambiente de células in vivo, replicando estímulos mecânicos e físicos impulsionando o comportamento celular.
Descrevemos aqui um protocolo de duas etapas que combina o uso de apagamento epigenético químico com pistas relacionadas à mecanosensagem, para gerar células pluripotentes de mamíferos. No primeiro passo, as células são incubadas com a molécula desmetilante 5-aza-citidina (5-aza-CR). Este agente é capaz de induzir uma significativa desmetilação global de DNA através de um efeito combinado da translocação direta 2 (TET2)-mediada ação 8,10 e a inibição indireta das metiltransferases de DNA (DNMT)22,23. Esta etapa induz a remoção dos blocos epigenéticos com uma posterior reativação da expressão genética relacionada à pluripotency e, portanto, a geração de células de alta plasticidade 1,2,3,8,10, a partir de agora referidas como "células apagadas epigenéticas". Na segunda etapa, as células são encapsuladas em um sistema de cultura 3D. Para isso, o composto sintético hidrofóbico não reativo politetrafluoroetileno (PTFE; com tamanho de partícula de 1 μm) é usado como micro-bioreator, que permite a criação de um microambiente celular inalcançável através do uso de sistemas tradicionais de cultura 2D10. As partículas de pó PTFE aderem à superfície da gota líquida na qual as células são re-suspensas e isolam o núcleo líquido da superfície de suporte, permitindo a troca de gás entre o líquido interior e o ambiente circundante24. O "micro-bioreator PTFE" obtido, também conhecido como "Mármore Líquido", incentiva as células a interagir livremente entre si, promovendo o rearranjo de células 3D 25,26,27, e estende e mantém de forma estável o estado de alta plasticidade adquirido, embora a sinalização relacionada à bio-mecanosensing 10.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td>Componente do meio ESC</td></tr><tr><td>5-Azacitidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2385</td><td>5-aza-CR, para apagamento epigenético de fibroblastos</td></tr><tr><td>Adenosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>Componente da mistura de nucleosídeos para meio ESC</td></tr><tr><td>Solução antibiótica antibiótica (100 vezes;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>Componente de fibroblastos e meios ESC</td></tr><tr><td>CFX96 PCR em tempo real</td><td>Bio-Rad</td><td>Laboratories NA</td><td>Termociclador para PCR quantitativo</td></tr><tr><td>Citidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4654</td><td>Componente da mistura de nucleosídeos para meio ESC</td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, piruvato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41966052</td><td>Para isolamento de fibroblastos e meio</td></tr> <tr><td>de culturaDMEM, baixa glicose, piruvato</td><td>31885023 científico de Thermo Fisher</td><td></td><td>para o meio</td></tr><tr><td>Dulbecco do ESC ' s Fosfato Tampolado Salino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td>PBS; para biópsia e lavagem de células e para preparação de solução</td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61021</td><td>mRNA estração</td></tr><tr><td>ESGRO Recombinante Mouse LIF Proteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ESG1106</td><td>Componente do meio ESC</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino, qualificado, inativado por calor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td>Componente de fibroblastos e meios ESC</td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA10-155) Proteína Humana Recombinante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0024</td><td>Componente do meio ESC</td></tr><tr><td>Gelatina de pele suína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>Para revestimento de pratos</td></tr><tr><td>Sistema de PCR GeneAmp 2700</td><td>Applied Biosystems</td><td>NA</td><td>Termociclador para PCR</td></tr><tr><td>qualitativo Metilação global do DNA ELISA Kit</td><td>CELL BIOLABS</td><td>STA-380 Estudo de</td><td>metilação</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA Polimerase</td><td>Promega</td><td>M7801</td><td>PCR qualitativo</td></tr><tr><td>Guanosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6264</td><td>Componente da mistura de nucleosídeos para meio ESC</td></tr><tr><td>Mistura de nutrientes F-10 do presunto</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 31550031</td><td>para meio ESC</td></tr><tr><td>KnockOut Substituição de soro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>Componente do meio ESC</td></tr><tr><td>KOVA lâmina vítrea 10 com grades</td><td>Hycor Biomedical</td><td>87144</td><td>Para contagem de células</td></tr><tr><td>Leica MZ APO Stereo Microscope</td><td>Leica</td><td>NA</td><td>Para observação organoide</td></tr><tr><td>Solução de L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>Componente de fibroblastos e mídia ESC</td></tr><tr><td>MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td>Componente do meio ESC</td></tr><tr><td>Millex-GS 0.22 &micro; m filtros de poros</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td>Para esterilização de solução</td></tr><tr><td>M-MLV Transcriptase Reversa, RNase H Minus, Ponto Mutante</td><td>Promega</td><td>M3681</td><td>mRNA transcrição reversa</td></tr><tr><td>Multiskan FC Microplate Fotômetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51119000</td><td>Para leitura de placas ELISA</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE300 Microscópio de contraste de fase invertida</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>Para célula observação</td></tr><tr><td>Perkin Elmer Termociclador 480</td><td>Perkin Elmer</td><td>NA</td><td>Termociclador para transcrição reversa</td></tr><tr><td>Poli(tetrafluoretileno) 1 &mu; m tamanho de partícula</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>430935</td><td>Para geração de micro-biorreator</td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K182001</td><td>Estração de DNA genômico</td></tr><tr><td>TaqMan Células de expressão gênica para CT Kit Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM1728</td><td>PCR quantitativo</td></tr><tr><td>Timidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td>Componente da mistura de nucleosídeos para meio ESC</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos 100X20 mm,</td><td>833902</td><td>Sarstedt</td> padrão <td>Para isolamento de fibroblastos</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos 35X10 mm, Sarstedt padrão</td><td></td><td>833900</td><td>Para isolamento de fibroblastos</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos 35X10 mm, Suspensão</td><td>Sarstedt</td><td>833900500</td><td>Placa de Petri de bacteriologia para cultura de mármore líquido</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos 96 Well, Standard, F</td><td>Sarstedt</td><td>833924005</td><td>Para cultura de mármore líquido</td></tr><tr><td>Solução de tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924</td><td>Para dissociação de fibroblastos</td></tr><tr><td>Tubo 15ml, 120x17mm, PS</td><td>Sarstedt</td><td>62553041</td><td>Para centrifugação em suspensão celular</td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td>Componente da mistura de nucleosídeos para meio ESC</td></tr></tbody></table>

uma estratégia de duas etapas que combina modificação epigenética e sinais biomecânicos para gerar células pluripotentes mamíferas

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

O fenótipo celular pode ser invertido ou modificado com diferentes métodos, com vantagens e limitações específicas para cada técnica. Aqui descrevemos uma nova estratégia que combina o uso de apagamento epigenético químico com pistas relacionadas à mecanosensagem, para gerar células pluripotentes de mamíferos. Dois passos principais são necessários. Na primeira etapa, as células adultas maduras (terminantemente diferenciadas) são expostas à borracha epigenética 5-aza-cytidina para levá-las a um estado pluripotente. Esta parte do protocolo foi desenvolvida, com base na compreensão crescente dos mecanismos epigenéticos que controlam o destino e a diferenciação celular, e envolve o uso do modificador epigenético para apagar o estado diferenciado celular e, em seguida, dirigir para uma janela transitória de alta plasticidade.
Na segunda etapa, as células apagadas são encapsuladas em micro-bioreatores de politetrafluoroetileno (PTFE), também conhecidos como Mármores Líquidos, para promover o rearranjo celular 3D para estender e manter a alta plasticidade adquirida. O PTFE é um composto sintético hidrofóbico não reativo e seu uso permite a criação de um microambiente celular, que não pode ser alcançado em sistemas tradicionais de cultura 2D. Este sistema incentiva e aumenta a manutenção da pluripotência, embora as pistas relacionadas à bio-mecanosensing.
Os procedimentos técnicos aqui descritos são estratégias simples para permitir a indução e manutenção de um estado de alta plasticidade em células somáticas adultas. O protocolo permitiu a derivação de células de alta plasticidade em todas as espécies de mamíferos testadas. Uma vez que não envolve o uso de transfecção genética e é livre de vetores virais, pode representar um notável avanço tecnológico para aplicações de medicina translacional. Além disso, o sistema micro-bioreator fornece um notável avanço na tecnologia organoide de células-tronco, recriando in vitro um microambixo específico que permite a cultura de longo prazo de células de alta plasticidade, ou seja, como ESCs, iPSCs, células epigeneticamente apagadas e MSCs.

O presente protocolo descreve todas as etapas a serem executadas para gerar e manter as células pluripotentes dos mamíferos a partir de células somáticas adultas. Este método tem sido bem sucedido com fibroblastos isolados de diferentes espécies de mamíferos, ou seja, camundongos, suínos e humanos. Os resultados representativos aqui relatados são obtidos de todas as linhas celulares, independentemente da espécie de origem.
Análises morfológicas mostram que, após a incubação de 18 h com o agent...

Apresentamos aqui um método que combina o uso de apagamento epigenético químico com pistas relacionadas à mecanosensagem para gerar eficientemente células pluripotentes de mamíferos, sem a necessidade de transfecção genética ou vetores retrovirais. Essa estratégia é, portanto, promissora para a medicina translacional e representa um notável avanço na tecnologia organoide de células-tronco.

Uma estratégia de duas etapas que combina modificação epigenética e sinais biomecânicos para gerar células pluripotentes mamíferas

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

O protocolo mostrado neste vídeo combina pela primeira vez o uso de apagamento epigenético químico com pistas biomecânicas para induzir e manter a pluripotência em células adultas terminalmente diferenciadas. O principal ponto forte deste protocolo é que ele não requer vetores transgênicos ou virais. Além disso, é robusto, altamente reprodutível e flexível.Esta técnica não requer o uso de transfecção gênica e, portanto, representa um avanço tecnológico notável para a medicina translacional e terapia celular, ao mesmo tempo em que suporta a cultura de longo prazo de células de alta plasticidade. Demonstrando o procedimento estarão Georgia Pennarossa, professora assistente, e Teresina De Iorio, estudante de doutorado do meu laboratório. Comece preparando uma solução estoque fresca de 5-aza-CR de um milimolar.Pese 2,44 miligramas de 5-aza-CR e dissolva-o em 10 mililitros de DMEM com alto teor de glicose. Ressuspenda o pó por vórtice e esterilize a solução com um filtro de 0,22 micrômetro. Preparar a solução de trabalho 5-aza-CR diluindo um microlitro da solução-mãe num mililitro de meio de cultura de fibroblastos.Tripsinize as células conforme descrito no manuscrito do texto e desaloje-as com pipetagem suave. Em seguida, colete a suspensão celular e transfira-a para um tubo cônico. Conte as células usando uma câmara de contagem sob um microscópio óptico.Centrifugar a suspensão celular a 150 vezes G durante cinco minutos. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet para obter 40.000 células em 30 microlitros de meio de cultura de fibroblastos suplementado com 5-aza-CR de um micromolar. Encha uma placa de Petri de 35 milímetros com pó de PTFE para produzir um leito e dispense os 30 microlitros de células no leito de pó.Gire suavemente a placa de Petri em movimentos circulares para garantir que o pó de PTFE cubra totalmente a superfície da gota de líquido para formar um microbiorreator de mármore líquido. Pegue o microbiorreator de mármore líquido usando uma ponta de pipeta de 1000 microlitros que foi cortada para acomodar o diâmetro do mármore. Coloque o microbiorreator em uma placa de Petri bacteriológica limpa para estabilizá-lo.Em seguida, transfira o microbiorreator da placa de Petri para uma placa de 96 poços. Adicione lentamente 100 microlitros de mídia da margem do poço. O microbiorreator deve flutuar sobre o meio.Incube o microbiorreator de mármore líquido por 18 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, colete o microbiorreator de mármore líquido usando uma ponta de pipeta de 1000 microlitros e coloque-o em uma nova placa de Petri bacteriológica de 35 milímetros. Use uma agulha para perfurar o mármore líquido e quebrá-lo.Recupere os esferóides formados com uma ponta de pipeta de 200 microlitros que foi cortada na borda sob um estereomicroscópio. Para lavar os resíduos de 5-aza-CR, transfira os organoides para uma placa de Petri contendo meio ESC. Prepare uma nova placa de Petri de 35 milímetros contendo o leito de pó de PTFE e dispense um único organoide em uma gota de 30 microlitros de meio de cultura ESC sobre o pó usando uma ponta de pipeta cortada de 200 microlitros.Gire suavemente o prato em movimentos circulares para formar um novo microbiorreator de mármore líquido e transfira-o para um poço de uma placa de 96 poços. Adicione 100 microlitros de mídia da margem do poço para banhar lentamente o mármore. Cultive os microbiorreatores de mármore líquido a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.As análises morfológicas mostram que após uma incubação de 18 horas com o agente desmetilante 5-aza-CR, fibroblastos de três espécies de mamíferos encapsulados em microbiorreatores de PTFE se agregaram e formaram estruturas esféricas 3D com uma geometria de tamanho uniforme. Em condições 3D, 86,31% das células encapsuladas modificaram notavelmente seu fenótipo. Em contraste, as células pós-5-aza-CR cultivadas em condições padrão 2D eram consideravelmente menores em tamanho, com núcleos granulados e mantinham uma distribuição de monocamada.As alterações morfológicas foram acompanhadas pelo início da expressão gênica relacionada à pluripotência, tanto em células 3D quanto em 2D pós-5-aza-CR. A transcrição foi observada para POU classe cinco homeobox um, NANOG homeobox, proteína dedo de zinco ZFP42 e região determinante do sexo Ybox2, que estão ausentes em fibroblastos não tratados. Uma regulação positiva significativa da molécula de adesão de células epiteliais de translocação 10-11 2 e dos genes da caderina 1 também foi observada em células 3D pós-5-aza-CR em comparação com células cultivadas em placas de plástico padrão 2D.Paralelamente, a regulação negativa do antígeno de superfície celular Thy1 marcador específico de fibroblastos foi detectada em células 3D e 2D pós-5-aza-CR. Uma diminuição significativa dos níveis de metilação em células 3D e 2D pós-5-aza-CR foi confirmada com ELISA. Os níveis de metilação do DNA foram significativamente menores em células 3D pós-5-aza-CR em comparação com as células cultivadas em condições 2D.Além disso, as células 3D pós-5-aza-CR retiveram a estrutura esférica 3D adquirida, altos níveis de expressão de genes relacionados à pluripotência e baixos níveis de metilação do DNA por 28 dias, momento em que a cultura foi interrompida. Os microbiorreatores também podem ser usados para manter as condições ideais para culturas de células progenitoras, bem como para aumentar a eficiência da diferenciação terminal.

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Biology

Biologia

Este vídeo mostra o procedimento para gerar células-tronco pluripotentes induzidas usando lentivírus induzível que expressam Oct4, Sox2, c-Myc e KLF4.

Geração de iPS a partir de células MEFS através da expressão forçada de Sox-2, Oct-4, c-Myc e KLF4

O Stemgent induzível Dox Mouse Set Lentivirus TF pode reprogramar fibroblastos embrionárias de camundongos (MEFs) para pluripotentes induzidas da haste (iPS) células. Aqui demonstramos o protocolo para DOX induzível-expressão de fatores de reprogramação em ratos transcrição Oct4, Sox2, KLF4 e c-Myc para gerar colônias iPS que expressam marcadores comuns MES pluripotência.

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos de rato embrionárias com um fator de transcrição Quatro, Doxiciclina induzível Sistema de Transdução Lentivirus

Gerando pluripotentes induzidas de células-tronco (IPSC) produz linhas de linhas de diferentes potencial de desenvolvimento, mesmo quando eles passam por testes padrão pluripotência. Aqui nós descrevemos um protocolo para produzir ratos derivadas inteiramente de iPSCs, que define as linhas iPSC como possuindo pluripotência...

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

Aqui nós descrevemos um protocolo para gerar células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem a partir do sangue periférico usando uma estratégia de reprogramação episome base e inibidores da histona deacetilase.

Eficiente Geração células iPS a partir de sangue, utilizando epissomas e HDAC Inibidores

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Uma enzima de Split-TET2 projetado para Hydroxymethylation de DNA químico-inducible e remodelação epigenéticas

Regulamento do ambiente da cromatina é um processo essencial, necessário para a expressão do gene apropriado. Aqui, descrevemos um método para controlar a expressão do gene através do recrutamento de cromatina-modificando máquinas de forma gene-específico e reversível.

Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas

Aqui nós descrevemos um método clinicamente relevante, alta eficiência, livre de alimentador para reprogramar fibroblastos humanos primários em células-tronco pluripotentes induzidas usando modificados mRNAs codificação fatores reprogramação e imita o microRNA madura-367/302. Também está incluídos métodos para avaliar a eficiência de reprogramação, expanda iPSC clonal colônias e confirmar a expressão do marcador pluripotência TRA-1-60.

Baseado em RNA reprogramação de fibroblastos humanos primários em células-tronco pluripotentes induzidas

Aqui, descrevemos um método detalhado para edição de genes sem costura em células-tronco pluripotentes humanas usando um plasmídeo doador baseado em piggyBac e o mutante Cas9 nickase. Duas mutações pontuais foram introduzidas no éxon 8 do locus do fator nuclear 4 alfa do hepatócito (HNF4α) em células-tronco embrionárias humanas (hESCs).

Introduzindo mutações pontuais em células-tronco pluripotentes humanas usando edição de genoma contínua

Como células atingir confluência, eles devem ser repicadas ou várias passagens. Este vídeo vai demonstrar um procedimento para a subcultura ambos os aderentes e células em suspensão.

Trypsinizing e Subcultura células de mamíferos

Este protocolo descreve como imunoprecipitação da cromatina (chip) é usado para estudar as alterações dinâmicas ao modelo de cromatina que regulam a transcrição induzida por uma via de transdução de sinal.

Cromatina imunoprecipitação (chips) para a Modificação do ensaio dinâmico Histone na expressão dos genes ativados em células humanas

Aprenda a gerar células pluripotentes sem vetores virais combinando apagamento epigenético químico e estímulos biomecânicos em fibroblastos de mamíferos. Este método robusto oferece avanços para medicina regenerativa e terapia celular.

Uma estratégia de duas etapas que combina modificação epigenética e sinais biomecânicos para gerar células pluripotentes mamíferas (Vídeo) | JoVE Journal

Uma estratégia de duas etapas que combina modificação epigenética e sinais biomecânicos para gerar células pluripotentes mamíferas

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