Método otimizado de LC-MS/MS para a análise do elevado-throughput de amostras clínicas de Ivacaftor, seus principais metabolitos e Lumacaftor em fluidos biológicos de pacientes de fibrose cística

Este é o protocolo para a preparação da amostra para o ensaio de plasma. Observe que, para garantir sua integridade, todas as amostras e padrões devem ser mantidos de dois a oito graus Celsius durante a coleta e o processamento. Quando o manuseio estiver concluído, armazene todas as amostras a menos 20 graus.

Para a preparação-padrão, preparar duas soluções-mãe independentes de cada anilida, ivacaftor, metabolito M1, metabolito M6 e lumacaftor em metanol a 100 microgramas por mililitro e 10 microgramas por mililitro. Observe que os compostos expiram após 10 dias dias em bancada. Para os padrões, transfira 100 microlitros de plasma humano para os tubos de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mililitro.

Continue a fazer isso para todas as suas outras amostras. Em seguida, adicione o padrão interno a cada tubo. Por exemplo, escolhemos 0,01 micrograma por mililitros do padrão preparado.

Agora, este tubo contém plasma enriquecido com o padrão interno. Proceda assim com todos os outros padrões. Pegue seus padrões e gire-os por alguns segundos para garantir que todo o líquido esteja no fundo do tubo.

Continue a fazer isso para todos os seus 40 padrões. Para as amostras do paciente, transfira 100 microlitros do tubo de amostra do paciente para o tubo da microcentrífuga. A amostra real do paciente não é enriquecida com padrão interno.

Gire a amostra do paciente para baixo por alguns segundos para garantir que todo o líquido esteja no fundo do tubo. As próximas etapas são projetadas para as amostras e os padrões. Adicione 200 microlitros de ácido fórmico a 0,1% em acetonitrila em cada tubo de amostra para precipitar as proteínas plasmáticas.

Continue a fazê-lo para todos os padrões e amostras de pacientes. Vortex cada amostra vigorosamente por cerca de 15 segundos. Continue a fazê-lo para todos os padrões e amostras incorridas.

Deixe repousar por 10 minutos na geladeira para facilitar a precipitação. Para fins de demonstração, vou centrifugar apenas uma amostra e um padrão. Estamos centrifugando a 10.000 rpm por 10 minutos em uma centrífuga Eppendorf 5430 a quatro graus.

Vamos agora filtrar o sobrenadante nos frascos Phenomenex. Para isso, estamos usando um filtro de seringa de 13 milímetros com filtros Grace de náilon de 0,45 micrômetros comprados nos EUA e estamos filtrando os frascos de HPLC que podem conter 1,5 mililitros. Após a filtração, transferiremos 100 microlitros de sobrenadante para os frascos de LC/MS para análise de LC/MS.

Esta amostra agora está pronta para análise. Agora basta colocar todas as suas amostras no rack do frasco. Estamos usando um sistema Shimadzu 8030 LC / MS, acoplado a uma especificação de massa triplo-quadrupolo.

Deixe o sistema se equilibrar antes da análise. Uma vez equilibrado, o que leva cerca de 15 minutos, basta pressionar o botão Iniciar. Para cada metabolito, construir uma curva de calibração traçando graficamente as razões da área de pico das anilidas em relação à concentração nominal dos padrões de calibração.

Utilizar a equação de regressão para a curva de calibração para calcular as concentrações de anilides na amostra incorrida. Um cromatograma típico é mostrado nesta figura. A resolução cromatográfica otimizada foi obtida usando uma fase móvel de 100% de acetonitrila e 0,1% de ácido fórmico em água com uma eluição gradiente em uma coluna Phenomenex Kinetex C8.

Os tempos de retenção de LC foram os seguintes. Para M6, um minuto. Para M1, 1,3 minutos.

Para o ivacaftor, 1,55 minutos. Para lumacaftor, 2,3 minutos. Em todas as amostras de plasma em branco, não foi observada interferência com o tempo de retenção de qualquer um dos anilidades, nem foi detectada interferência na combinação de ivacaftor com lumacaftor.

Por meio da análise de alto rendimento de uma grande quantidade de amostras de pacientes, otimizamos nosso método relatado por meio do uso de uma coluna de cromatografia de fase reversa de tamanho de poro menor, coluna Phenomenex C8 e um sistema de solvente gradiente em vez da eluição isocrática atual. Isso reduz o tempo de execução para seis minutos por amostra, incluindo a fase de lavagem. Este método confiável e inovador oferece uma abordagem simples, sensível e rápida para o monitoramento terapêutico de medicamentos da combinação de ivacaftor e ivacaftor-lumacaftor e fluidos biológicos.

Dada a necessidade de desenvolver relações exposição-resposta para maximizar a eficácia do medicamento, bem como conter os custos de saúde, ferramentas mais sensíveis precisam ser desenvolvidas e validadas para ajudar os médicos a usar terapia baseada em evidências e técnicas analíticas de alto rendimento para pacientes que sofrem de CF.By aplicando o método analítico proposto a estudos clínicos farmacocinéticos e farmacodinâmicos, surge a oportunidade de investigar mais detalhadamente os parâmetros farmacocinéticos do ivacaftor ou Combinação de ivacaftor-lumacaftor em um coletivo maior de pacientes.