Método otimizado de LC-MS/MS para a análise do elevado-throughput de amostras clínicas de Ivacaftor, seus principais metabolitos e Lumacaftor em fluidos biológicos de pacientes de fibrose cística

Este é o protocolo para o preparo da amostra para o ensaio de plasma. Observe que, para garantir sua integridade, todas as amostras e padrões devem ser mantidos a dois a oito graus Celsius durante a coleta e o processamento. Após a conclusão do manuseio, armazene todas as amostras a menos 20 graus.

Para o preparo padrão, prepare duas soluções-estoque independentes de cada anilida, ivacaftor, metabólito M1, metabólito M6 e lumacaftor em metanol a 100 microgramas por mililitro e 10 microgramas por mililitro. Observe que os compostos expiram após 10 dias em bancada. Para os padrões, transfira 100 microlitros de plasma humano para tubos de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mililitro.

Continue fazendo isso para todas as suas outras amostras. Em seguida, adicione o padrão interno a cada tubo. Por exemplo, escolhemos 0,01 micrograma por mililitro do padrão preparado.

Agora este tubo contém plasma com o padrão interno adicionado. Proceda da mesma forma com todos os demais padrões. Pegue seus padrões e centrifugue-os por alguns segundos para garantir que todo o líquido esteja na parte inferior do tubo.

Continue fazendo isso para todos os seus 40 padrões. Para as amostras dos pacientes, transfira 100 microlitros da amostra do paciente para o tubo de microcentrífuga. A amostra real do paciente não é adicionada com padrão interno.

Centrifugue a amostra do paciente por alguns segundos para garantir que todo o líquido esteja na parte inferior do tubo. Os próximos passos são projetados tanto para as amostras quanto para os padrões. Adicione 200 microlitros de ácido fórmico 0,1% em acetonitrila em cada tubo de amostra para precipitar as proteínas plasmáticas.

Continue fazendo isso para todos os padrões e amostras de pacientes. Agite vigorosamente cada amostra em vórtex por cerca de 15 segundos. Continue fazendo isso para todos os padrões e amostras obtidas.

Deixe repousar por 10 minutos na geladeira para facilitar a precipitação. Para fins demonstrativos, vou centrifugar apenas uma amostra e um padrão. Estamos centrifugando a 10.000 rpm por 10 minutos em uma centrífuga Eppendorf Centrifuge 5430 a quatro graus.

Agora filtraremos o sobrenadante nos frascos da Phenomenex. Para isso, estamos utilizando um filtro de seringa de 13 milímetros com filtros de náilon Grace de 0,45 micrômetros adquiridos dos EUA, e estamos filtrando nos frascos de HPLC que podem conter 1,5 mililitro. Após a filtração, transferiremos 100 microlitros do sobrenadante para os frascos de LC/MS para análise por LC/MS.

Esta amostra está agora pronta para análise. Basta colocar todas as suas amostras no suporte de frascos. Estamos utilizando um sistema LC/MS Shimadzu 8030, acoplado a um espectrômetro de massas com triplo quadrupolo.

Deixe o sistema equilibrar antes da análise. Após o equilíbrio, o que leva cerca de 15 minutos, basta pressionar o botão Iniciar. Para cada metabólito, construa uma curva de calibração plotando as razões das áreas dos picos das anilidas versus a concentração nominal dos padrões de calibração.

Utilize a equação de regressão da curva de calibração para calcular as concentrações de anilidas na amostra analisada. Um cromatograma típico é mostrado nesta figura. A resolução cromatográfica otimizada foi obtida utilizando uma fase móvel de acetonitrila 100% e ácido fórmico 0,1% em água, com eluição em gradiente em uma coluna Phenomenex Kinetex C8.

Os tempos de retenção na CL foram os seguintes. Para M6, um minuto. Para M1, 1,3 minutos.

Para ivacaftor, 1,55 minuto. Para lumacaftor, 2,3 minutos. Em todas as amostras de plasma em branco, nenhuma interferência com o tempo de retenção de qualquer um dos anilídeos foi observada, nem foi detectada interferência da combinação de ivacaftor com lumacaftor.

Por meio da análise de alto rendimento de um grande número de amostras de pacientes, otimizamos nosso método descrito anteriormente utilizando uma coluna de cromatografia em fase reversa com tamanho de poro menor, a coluna Phenomenex C8, e um sistema de solvente em gradiente, em vez da eluição isocrática atual. Isso reduz o tempo de análise para seis minutos por amostra, incluindo a fase de lavagem. Este método confiável e inovador oferece uma abordagem simples, sensível e rápida para o monitoramento terapêutico de ivacaftor e da combinação ivacaftor-lumacaftor em fluidos biológicos.

Dada a necessidade de desenvolver relações exposição-resposta para maximizar a eficácia dos medicamentos, bem como conter os custos com a saúde, ferramentas mais sensíveis precisam ser desenvolvidas e validadas para auxiliar os clínicos no uso de terapias baseadas em evidências e em técnicas analíticas de alto rendimento para pacientes com fibrose cística. Ao aplicar o método analítico proposto em estudos clínicos de farmacocinética e farmacodinâmica, surge a oportunidade de investigar mais a fundo os parâmetros farmacocinéticos do ivacaftor ou da combinação ivacaftor-lumacaftor em um grupo maior de pacientes.