Na Vivo Rastreamento de adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas em um modelo de osteoartrite do joelho de rato com corante fluorescente membrana lipofílico

Este protocolo descreve uma maneira eficiente para monitorar a persistência de célula e biodistribuição do adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas (haMSCs) por fluorescência far-red rotulagem em um modelo de osteoartrite (KOA) de joelho do rato através de injeção intra-articular de (IA).

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a eficácia da persistência celular e biodistribuição de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano em uma osteoartrite de joelho de rato, ou um modelo KOA, usando imagens fluorescentes in vivo. O rastreamento de células-tronco in vivo pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da matemática regenerativa sobre irritação e distribuição de tecido adiposo humano derivado de células-tronco mesenquimais em modelos animais KOA. A principal vantagem do uso do DiD é que seu espectro de emissão deslocado por rato permite imagens de tecidos profundos em animais vivos sem efeitos citóticos ou danos funcionais às células marcadas com corante.

Comece colocando um rato Sprague Dawley macho anestesiado de 250 a 300 gramas, de oito a 12 semanas de idade, na posição lateral esquerda em uma almofada aquecida. Use uma navalha para depilar completamente o joelho direito e desinfete a área cirúrgica com solução de iodopovidona a 10% e etanol a 70%. Cubra a área não cirúrgica com uma almofada cirúrgica.

E use um bisturi para fazer uma incisão de dois centímetros lateralmente ao longo do tendão patelar para expor as cápsulas articulares. Em seguida, use um bisturi cirúrgico para transeccionar o ligamento colateral medial, refletindo o menisco em direção ao fêmur, e segure o menisco medial com uma pinça. Use um bisturi para cortar o menisco em seu ponto mais estreito da fixação tibial.

Para obter um início de OAJ confiável e viável, o lado do fêmur do menisco deve ser completamente cortado em cada animal experimental. Em seguida, feche a cápsula articular com uma sutura observável de quatro O e monitore o rato até que esteja totalmente recuperado. Oito semanas após a cirurgia, desprenda as células mesenquimais derivadas do tecido adiposo humano de uma cultura a 80% de confluência com dois mililitros de tripsina mais EDTA por três minutos a 37 graus Celsius.

Após alguns minutos, neutralizar a tripsina com quatro mililitros de meio de cultura completo e recolher as células por centrifugação. Ressuspenda o pellet em uma concentração de uma vez 10 elevado à sexta células por mililitro em cinco mililitros de meio de cultura sem soro. E rotule as células com 50 microlitros de solução de marcação de células DiD por 50 minutos a 37 graus Celsius.

No final da incubação, colete as células por centrifugação e lave-as duas vezes em cinco mililitros de PBS por lavagem. Após a última centrifugação, dilua as células para 2,5 vezes 10 elevado à sexta células viáveis por 100 microlitros de concentração de PBS e carregue as células em uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 26. Em seguida, raspe novamente o joelho artrítico do primeiro animal experimental para expor a área articular e desinfete a pele exposta com etanol a 70%.

Injete as células marcadas no centro do triângulo formado pelo lado medial do ligamento patelar, o côndilo femoral medial e o côndilo tibial medial e abra o software de imagem. Inicialize o sistema de imagem de bioluminescência in vivo e posicione os animais em decúbito dorsal dentro do estágio central do sistema de imagem. Com a porta da câmara fechada, marque a caixa fluorescente e selecione os conjuntos de filtros fluorescentes de excitação e emissão apropriados.

Defina o campo de visão para D, a curvatura de pixels para oito, o F Stop para dois e o tempo de exposição para automático. Após a obtenção das imagens, permita que os animais se recuperem em uma almofada térmica com monitoramento até a recuperação total. Em seguida, no software de análise de imagem apropriado, selecione as unidades de eficiência radiante para a medição da fluorescência e as regiões de interesse para análise e quantifique os sinais fluorescentes de cada imagem.

Neste experimento representativo, cortes seriados da articulação do joelho de um rato induzido por osteoartrite do joelho foram avaliados por H & E e safranina O / Fast Green oito semanas após a cirurgia. A espessura da cartilagem articular é mais fina nos joelhos artríticos do que nas articulações contralaterais sem cirurgia, como observado nos cortes corados com H&E. Além disso, o proteoglicano é diminuído e o colágeno fibrilado é aumentado na articulação da artrite, conforme visualizado pela coloração de safranina O/Fast Green, indicando a progressão do fenótipo degenerativo da osteoartrite do joelho induzido pela cirurgia.

Uma hora após a coloração, as células mesenquimais derivadas do tecido adiposo humano marcadas com DiD exibem uma forma redonda in vitro. Após 24 horas, as células mesenquimais marcadas com DiD cultivadas demonstram uma forma de fuso longo, confirmando que o DiD não altera a capacidade de adesão das células. A imagem dos joelhos dos animais osteoartríticos oito semanas após a cirurgia revela a presença das células marcadas com DiD desde o dia zero até o dia 70 após a injeção.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da terapia com células-tronco determinarem a rotina e a dosagem ideais para a injeção segura e viável de células-tronco mesenquimais para o tratamento da osteoartrite do joelho em animais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rotular células-tronco mesenquimais humanas com DiD para a injeção e rastreamento in vivo no modelo KOA de rato induzido cirurgicamente.