Name: Na Vivo Rastreamento de adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas em um modelo de osteoartrite do joelho de rato com corante fluorescente membrana lipofílico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Aprenda a rastrear células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano em modelo de osteoartrite do joelho em ratos usando marcação fluorescente DiD. Este método permite avaliar a persistência e biodistribuição celular in vivo.

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O atual estudo foi suportado por Xangai inovação financiamento (1402H 294300) patrocinado pela ciência e tecnologia Comissão de Xangai município (CN) para o Dr. Wen Wang. Gostaríamos de agradecer Dr. Zhou de Guangdong (nacional tecido engenharia centro da China) pela sua assistência técnica e aconselhamento científico para este manuscrito. Também gostaríamos de agradecer o Sr. Huitang Xia (Hospital de Xangai nona das pessoas) por sua ajuda no bem-estar dos animal.

procedimentos envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de ética e local institucional Animal conta com um esforço para minimizar o sofrimento dos animais. O seguinte protocolo foi aprovado pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) em Shanghai Ninth pessoas &#8217; s Hospital afiliado para Shanghai JiaoTong University School of Medicine com o protocolo número [2017] 063.
 1. estabelecimento de um modelo de osteoartrite do joelho de rato Surgically-Induced <ol><li>para este procedimento cirúrgico, uso 8-12 semanas velhos ratos machos Sprague Dawley (SD) com peso entre 250 e 300 g.</li>
	<li>Anestesiar os animais com 40 mg/kg de tiletamina e eficiente de 40 mg/kg através de injeção intramuscular.</li>
	<li>Colocar o animal na posição de lateral esquerda num palco aquecida. Raspe o joelho direito completamente com uma navalha. Desinfetar a área cirúrgica com solução de iodo-providone de 10%, seguida por 70% de etanol, repita mais duas vezes e depois pintar com solução de providone-iodo 10% e cobrir a área não-cirúrgico com um bloco cirúrgico.</li>
	<li>Usando um bisturi cirúrgico, faça uma incisão de 2 cm lateralmente ao longo do tendão patelar para expor o jointcapsules.</li>
	<li>Usar um bisturi cirúrgico para transecto o ligamento colateral medial. Refletem o menisco em direção ao fêmur.</li>
	<li>Gotejar solução de cloreto de sódio 0,9% estéril na superfície da cartilagem articular durante a operação para impedir a cartilagem desseque.</li>
	<li>Pegar o menisco medial com fórceps e cortam o menisco em seu ponto mais estreito do acessório da tíbia com um bisturi ( figura 1A). Evitar ferir a cartilagem.</li>
	<li>Fecha a cápsula da articulação com uma sutura absorvível 4-0.</li>
	<li>Monitorar os ratos cirúrgicos até que recupere a consciência.</li>
	<li>Injetar gentamicina 20 mg/kg para evitar a infecção e a buprenorfina de 0,05 mg/kg, através de uma rota intramuscular para aliviar a dor após a cirurgia.</li>
	<li>Manter os ratos em instalações animais sob um ciclo de luz/escuro de 12 h por 3-8 semanas para início KOA temperatura controlada. Os animais continuam a receber medicação para a dor, incluindo mas não limitado a buprenorfina (0,05 mg/kg, IM) e gentamicina (20 mg/kg, i.m.), se persistirem os sintomas de dor.</li>
</ol> 2. Histologia do rato KOA modelo de avaliação <ol><li>sacrificar os ratos com excessiva CO 2 inalação (adicionar uma taxa de preenchimento de cerca de 30% do volume por minuto com dióxido de carbono para o ar existente na câmara câmara tornar a inconsciência animal dentro de 2-3 min. fluxo de CO2 manter por um período mínimo de 1 min após a respiração cessa.) no indicado pontos de tempo (representante os resultados são apresentados em 8 semanas de indução KOA, variando de 3 a 8 semanas) após a cirurgia...</li> <li>dissecar a pele e os músculos em torno das articulações do joelho e cortar as articulações de joelho com um bisturi.</li>
	<li>Corrigir as articulações de joelho em paraformaldeído 4% (PFA) por 3 dias à temperatura ambiente. Depois, descalcificar as amostras em 20% de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para cerca de 4 semanas a 4 ° C e alterar o EDTA a cada 3 dias. 
	Atenção: Paraformaldehyde é tóxico, usar equipamento de protecção adequado (EPI), tais como luvas e óculos.</li>
	<li>Desidratar as amostras usando um processador automático de tecidos. Definir o menu para iniciar um ciclo de descarga, da seguinte forma: 70% de etanol por 1h; Depois de 80% de etanol e 95% de etanol por 1h respectivamente; seguido por 2 ciclos de 100% de etanol por 1h; posteriormente, xileno duas vezes por 1h cada vez e parafina 3 vezes em 58 ° C, durante 1 h a cada vez. 
	Atenção: Xileno é tóxico, então use EPI apropriado, como luvas e óculos. 
	Nota: Opcionalmente, usar potes de Coplin para desidratação manual com a mesma afinação que o processador automático de tecidos.</li>
	<li>Coloque a face medial da face comum intacta para baixo e incorporá-lo no bloco de parafina com tecido incorporado centro. 
	Nota: Opcionalmente, usar fórceps para incorporar as amostras para o bloco de parafina manualmente.</li>
	<li>Começar a cortar 5 µm sagital seções da margem medial da articulação para intervalos de 30 µm com 2 seções seriais por micrótomo rotativo.</li>
	<li>Montar seções em lâminas de vidro e deparaffinize os slides em xilol. Entre as 2 seções seriais, manchar um slide com hematoxilina &#38; eosina (H &#38; E) coloração: 0,1% hematoxilina por 15 min, 1% de solução de ácido acético por 10 s e 0,5% eosina por 10 min. E manchar o outro slide com safranina O/Fast Green coloração: 0,1% hematoxilina por 15 min, 0,02% Fast Green por 3 min, 1% de solução de ácido acético por 10 s e 0.1% safranina O por 3 min. 
	Cuidado: O xileno é tóxico, vestir os EPI adequado, tais como luvas, óculos.</li>
	<li>Marcar as lâminas coradas utilizando o sistema de avaliação de histopatologia osteoartrite Research Society International (OARSI) em ratos 6.</li>
</ol> 3. Rotulagem de células-tronco mesenquimais humanas com o corante fluorescente fez <ol><li>preparar fez célula-rotulagem solução em etanol 100% na concentração de 1 mM. Proteger a solução de criação de etiquetas de célula de luz e armazená-lo em temperatura ambiente por mais 6 meses.</li>
	<li>Crescer haMSCs com procedimentos de cultura de pilha padrão em Dulbecco &#39; s modificado águia &#39; s suplementado (DMEM) com 1% penicilina e estreptomicina e 10% fetal soro de vitelo (FCS) em um prato de petri de 10 cm.</li>
	<li>Desanexar haMSCs com tripsina 0,25% de 2 mL com confluência de prévia para cerca de 80% de EDTA 1 mM.</li>
	<li>Neutralizar tripsina com 4 mL de meio de cultura e girar as células a 800 x g, durante 3 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Suspender as células em uma densidade de 1 x 10 6 células/mL em 5 mL de meio de cultura de soro livre.</li>
	<li>Rotular as células pela adição de 50 µ l fez solução de criação de etiquetas de célula em meio de cultura 5 mL soro livre a 37 ° C, durante 50 min.</li>
	<li>Girar as pilhas etiquetadas a 800 x g, durante 3 min.</li>
	<li>Lavar as células duas mais vezes com 5 mL fosfato tampão soro fisiológico (PBS) a x 800 g por 3 min cada.</li>
	<li>Olha o rotulado haMSCs usando um microscópio fluorescente com um conjunto de filtro de Cy5.</li>
	<li>Contar as células com coloração azul trypan e obter 2,5 x 10 6 células viáveis em 100 µ l PBS para injeção.</li>
</ol> 4. Na Vivo Fluorescente de Imaging para faixa haMSCs <ol><li>oito semanas após a cirurgia (etapa 1), anestesiar os ratos KOA pela injeção intramuscular de 25 mg/kg de tiletamina e eficiente de 25 mg/kg.</li>
	<li>Raspar o joelho direito cuidadosamente com uma lâmina de barbear para expor a área comum. Desinfetar a área conjunta com etanol a 70%.</li>
	<li>Usando uma agulha de seringa 26g, injetar 2,5 x 10 6 rotulado células suspendidas em 100 µ l PBS, no centro da área do triângulo formado pelo lado medial do ligamento patelar, o côndilo femoral medial e o côndilo medial da tíbia ( figura 1B).</li>
	<li>Abrir o software de imagem e inicializar a bioluminescência na vivo, sistema de imagem.</li>
	<li>Posição ratos em supino a posição na fase central do sistema de imagem e fechar a porta da câmara.</li>
	<li>Verificar o &#34; fluorescente &#34; caixa de seleção e selecione filtro fluorescente conjuntos de 640 nm para a excitação e 680 nm para emissão ( Figura 2A).</li>
	<li>Selecionar campo de visão de conjunto D. pixel binning para médio (8), F/Stop para exposição e 2 hora de auto. Manter o ideal tempo de exposição consistente para obter resultados comparáveis em todo o estudo inteiro ( Figura 2A).</li>
	<li>Retire o animal do palco e monitor para a recuperação da anestesia. 
	Nota: Animal lugar sobre uma almofada de aquecimento coberto com 2-3 camadas de toalha.</li>
	<li>Escolher as unidades de eficiência radiante para a medição de fluorescência ( Figura 2B). Selecione as regiões de interesse (ROI) para análise e quantificar os sinais fluorescentes de cada imagem ( Figura 2).</li>
	<li>Repita o procedimento da imagem latente na vivo para cada rato sequencialmente estudar haMSCs retenção longitudinal na articulação. 
	Nota: Sugerimos que os animais de imagem &#39; sinais fluorescentes pelo sistema de imagens in vivo, uma vez a cada dois dias para a primeira semana após a injeção e uma vez por semana até que o sinal não pode ser detectado.</li>
</ol>

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Li Meng, Hao Ming e Wen Wang são empregados atuais e detentores de outorga de opção de celular grupo de Biomedicina (Nasdaq: CBMG). Os outros autores não declaram nenhum conflito de interesses.

Normas de segurança e estudos de biodistribuição de terapia com células estaminais são urgentemente necessários antes de trazermos o tratamento de células-tronco regenerativa para KOA do banco ao lado do cama. No entanto, o ambiente patológico de doença desempenha um papel importante na persistência e biodistribuição de transplantado haMSCs10. Recentemente, nosso grupo demonstrou que injeção intra-articular de haMSCs mais persistentes em um ambiente de KOA patológico do que injeções sob condições ...

Osteoartrose do joelho (KOA) é uma doença degenerativa resultante da perda de cartilagem articular e inflamação progressiva, que se tornou das principais doenças crônica em idosos ao redor do mundo1. No entanto, terapias atuais usando anti-inflamatórios, suplementos de físicos e procedimentos cirúrgicos somente podem proporcionar alívio temporário para sintomáticos dor2.
Adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas (haMSCs) tornaram-se um remédio promissor regenerativo para osteoartrite do joelho, devido à sua diferenciação multipotent potencial para regeneração de cartilagem e imunomoduladores propriedades3, 4. Comparado com rotas farmacológicas para investigar os mecanismos de ação na vivo, acompanhamento ao vivo haMSCs em modelos animais de pequeno KOA é atualmente instrutivo para estabelecer a fundamentação e a viabilidade da terapia haMSC antes da aplicação clínica. Para testes pré-clínicos, meniscectomia medial (MM) desestabiliza a carga mecânica da articulação para induzir KOA em ratos, que fornece um modelo relativamente viável com reprodutibilidade consistente5. O aparecimento de KOA induzida por MM é anterior à transecção do ligamento cruzado anterior, sozinha ou combinada com meniscectomia medial parcial6. Portanto, as longo prazo interações entre haMSCs injetado com o microambiente patológica de KOA frequentemente são avaliadas em ratos induzidos por MM7,8.
Embora a eficácia terapêutica de haMSCs tem sido amplamente relatado, relevante o conhecimento sobre a persistência na vivo do haMSCs implantado através de injeção intra-articular de (IA) é escasso9,10. Assim, vários métodos de rotulagem celulares foram desenvolvidos, incluindo immunohistology11luciferase12, transfecção de13 proteína verde fluorescente, óxido de ferro, rotulagem por ressonância magnética (MRI)14 e numerosas células fluorescentes corantes8,15,16. Em comparação com análises de trabalho intensivo de histologia, na vivo não-invasivo imagem emprega dispositivos ópticos para detectar a distribuição em tempo real e a dinâmica das células rotuladas com sinais fluorescentes10,17. Para a imagem latente funcional de células vivas, cytocompatible fluorescente rotulagem é uma técnica de rastreamento sofisticado radioativo livre para revelar atividades celulares após transplante de células-tronco18. Além disso, multicoloridos fluorescentes corantes lipofílicos possuem vantagens sobre amino-hidrofílicos corantes ou proteínas fluorescentes, incluindo sua permeabilidade celular melhorada e reforçada fluorescência quântica rendimentos19.
Assim, os protocolos incluídos aqui utilizam um vermelho laser para excitar as células rotuladas com carbocyanines lipofílicos fez (DilC18(5)), que é um far-red fluorescente Dil (dialkylcarbocyanines) analógico20. Os espectros avermelhado da excitação e emissão de evita a interferência de autofluorescent e permite que a imagem latente durante um longo período de tempo em animais vivos8tecidos profundos. Esse método de rastreamento de células na vivo rotulado com que é válido para monitoramento transplantadas células-tronco, tais como haMSCs, em modelos animais, que é essencial para compreender e melhorar a atual terapia regenerativa de células-tronco.

<table><tbody><tr><td>Sistema de anestesia animal Matrx VMR</td><td>Midmark</td><td>VIP3000</td><td></td></tr><tr><td>4-0 sutura</td><td>Shanghai Jinhuan</td><td>KC439</td><td></td></tr><tr><td>Navalha</td><td>Pritech</td><td>LD-9987</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd.</td><td>Nenhum</td><td></td></tr><tr><td>solução de cloreto de sódio a 0,9%</td><td>Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td></td><td></td>H43020455</tr><tr><td>Penicilina</td><td>Shanghai Kangfu química farmacêutica Co., Ltd.</td><td>Nenhum</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>Nenhum</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td>Diluir até a concentração final de 10% em PBS</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>Diluir até a concentração final de 20% em PBS</td></tr><tr><td>0,1% Solução de Hematoxilina, Mayer' s</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Eosin Y solução, álcool</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110116</td><td></td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8884</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Excelsior ESTM Processador de Tecidos</td><td>Thermo Fisher</td><td>A78400006</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Histocentre&trade; 3 Tissue Embedding Centro</td><td>Thermo Fisher</td><td>B64100010</td><td></td></tr><tr><td>micrótomo rotativo totalmente automatizado</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DiD Molecular Probes, Life Technologies</td><td>V-22887</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM High Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-114</td><td></td></tr><tr>Centrífuga <td>de V118877</td><td></td><td>Corning</td> de<td>placa de Petri de 10 cm</td></tr> Microscópio fluorescente <tr><td></td><td>Beckman</td><td>Optima MAX-TL</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Solução de azul de tripano a 0,4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>Titetamme</td><td>Virbac (Zoletil 50)</td><td>1000000188</td><td></td></tr><tr><td>Zolazepam</td><td>Virbac (Zoletil 50)</td><td>1000000188</td><td></td></tr><tr><td>Seringa hiposérmica estéril para uso único 26G</td><td>Shanghai Misawa Medical Industry</td><td>Nenhum</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem in vivo IVIS Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Living Imaging 4.0 software</td><td>PerkinElmer</td><td>Nenhum</td><td></td></tr></tbody></table>

na vivo rastreamento de adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas em um modelo de osteoartrite do joelho de rato com corante fluorescente membrana lipofílico

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

Para oferecer suporte a aplicação clínica da terapia humana adiposo-derivados mesenquimais células-tronco (haMSC) para osteoartrite do joelho (KOA), examinamos a eficácia da persistência de célula e biodistribuição de haMSCs em modelos animais. Demonstrámos um método para rotular a membrana da célula de haMSCs com corante lipofílico fluorescente. Posteriormente, injeção intra-articular das pilhas etiquetadas em ratos com KOA cirurgicamente induzida dinamicamente foi monitorada por um na vivo sistema de imagem. Utilizamos o lipofílico carbocyanines fez (DilC18 (5)), um análogo de Dil (dialkylcarbocyanines) far-red fluorescente, que utilizou um laser vermelho para evitar a excitação da autofluorescência verde natural dos tecidos circundantes. Além disso, os espectros de emissão avermelhado de permitiu a imagem do profundo-tecido de animais vivos e o processo de rotulagem não causaram nenhum efeitos citotóxicos ou dano funcional ao haMSCs. Esta abordagem tem demonstrada ser um método de controle eficiente para haMSCs em um modelo do rato KOA. A aplicação deste método também pode ser usada para determinar a rota ideal de administração e dosagem de MSCs provenientes de outras fontes em estudos pré-clínicos.

A fim de induzir modelo KOA, MM realizou-se na articulação do joelho direito de ratos SD (Figura 3). Oito semanas após a cirurgia, ratos foram sacrificados e as seções série de articulações de joelho foram avaliadas com as duas H &#38; E e safranina O/Fast Green coloração (Figura 4). Para H &#38; E coloração, a superfície da cartilagem articular exibiu fronteiras mais ásperos nos joelhos cirurgia do que a articulação normal sem c...

Este protocolo descreve uma maneira eficiente para monitorar a persistência de célula e biodistribuição do adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas (haMSCs) por fluorescência far-red rotulagem em um modelo de osteoartrite (KOA) de joelho do rato através de injeção intra-articular de (IA).

Na Vivo Rastreamento de adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas em um modelo de osteoartrite do joelho de rato com corante fluorescente membrana lipofílico

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a eficácia da persistência celular e a biodistribuição de células-tronco mesenquimais derivadas de adipócitos humanos em um modelo de osteoartrite do joelho em ratos, ou modelo de OAK, utilizando imagem fluorescente in vivo. O rastreamento in vivo de células-tronco pode ajudar a responder questões fundamentais na área de medicina regenerativa sobre a irritação e distribuição de células-tronco mesenquimais derivadas de adipócitos humanos em modelos animais de OAK. A principal vantagem do uso do DiD é que seu espectro de emissão deslocado para o vermelho permite a obtenção de imagens em tecidos profundos em animais vivos, sem efeitos citotóxicos ou danos funcionais às células marcadas com o corante.Inicie posicionando um rato macho Sprague Dawley anestesiado, com peso entre 250 e 300 gramas e com idade entre oito e 12 semanas, em posição lateral esquerda sobre uma placa aquecida. Utilize uma lâmina de barbear para depilar completamente o joelho direito e desinfete a área cirúrgica com solução de iodopovidona a 10% e etanol a 70%. Cubra a área não cirúrgica com um campo cirúrgico.E use um bisturi para fazer uma incisão de dois centímetros ao longo do tendão patelar, lateralmente, a fim de expor as cápsulas articulares. Em seguida, use um bisturi cirúrgico para seccionar o ligamento colateral medial, refletindo o menisco em direção ao fêmur, e segure o menisco medial com pinça. Use um bisturi para cortar através do menisco em seu ponto mais estreito, partindo da inserção tibial.Para obter um início confiável e viável de OAQ, o lado femoral do menisco deve ser completamente cortado em cada animal experimental. Em seguida, feche a cápsula articular com um fio observável quatro-O e monitore a rata até que ela esteja totalmente recuperada. Oito semanas após a cirurgia, desprenda células mesenquimais derivadas de adipócitos humanos de uma cultura com 80% de confluência utilizando dois mililitros de tripsina mais EDTA durante três minutos a 37 graus celsius.Após alguns minutos, neutralize a tripsina com quatro mililitros de meio de cultura completo e recolha as células por centrifugação. Suspender o pellet em uma concentração de um vezes 10 à sexta células por mililitro em cinco mililitros de meio de cultura sem soro. E marque as células com 50 microlitros de solução de marcação celular DiD durante 50 minutos a 37 graus celsius.No final da incubação, recolha as células por centrifugação e lave-as duas vezes em cinco mililitros de PBS por lavagem. Após a última centrifugação, dilua as células para uma concentração de 2,5 vezes 10 à sexta potência de células viáveis por 100 microlitros de PBS e carregue as células em uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 26. Em seguida, reexponha o joelho artrítico do primeiro animal experimental para expor a área da articulação e desinfete a pele exposta com etanol 70%.Injecte as células marcadas no centro do triângulo formado pelo lado medial do ligamento patelar, o côndilo femoral medial e o côndilo tibial medial, e abra o software de imagem. Inicialize o sistema de imagem de bioluminescência in vivo e posicione os animais em posição supina sobre a plataforma central do sistema de imagem. Com a porta da câmara fechada, verifique a caixa fluorescente e selecione os conjuntos adequados de filtros de excitação e emissão fluorescentes.Defina o campo de visão como D, o pixel bending como oito, o F Stop como dois e o tempo de exposição como automático. Após obter as imagens, permita que os animais se recuperem em uma placa aquecida com monitoramento até a recuperação completa. Em seguida, no software apropriado de análise de imagem, selecione as unidades de eficiência radiante para a medição da fluorescência e as regiões de interesse para análise, e quantifique os sinais fluorescentes de cada imagem.Neste experimento representativo, seções seriadas da articulação do joelho de um rato com osteoartrite induzida foram avaliadas por coloração com H&E e safranina O/verde rápido oito semanas após a cirurgia. A espessura da cartilagem articular é menor nos joelhos artríticos do que nas articulações contralaterais sem cirurgia, conforme observado nas seções coradas com H&E. Além disso, os proteoglicanos estão reduzidos e o colágeno fibrilado está aumentado na articulação artrítica, conforme visualizado pela coloração com safranina O/verde rápido, indicando a progressão do fenótipo degenerativo de osteoartrite do joelho induzido pela cirurgia.Uma hora após a coloração, células mesenquimais derivadas de adipócitos humanos marcadas com DiD exibem formato arredondado in vitro. Após 24 horas, as células mesenquimais marcadas com DiD em cultura demonstram formato alongado em fuso, confirmando que o DiD não altera a capacidade de aderência das células. A imagem dos joelhos dos animais com osteoartrite oito semanas após a cirurgia revela a presença das células marcadas com DiD desde o dia zero até o dia 70 pós-injeção.Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de terapia com células-tronco determinarem a rotina e dosagem ideais para a injeção segura e viável de células-tronco mesenquimais no tratamento da osteoartrite do joelho em animais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como marcar células-tronco mesenquimais humanas com DiD para injeção e rastreamento in vivo no modelo de osteoartrite do joelho induzida cirurgicamente em ratos.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo mostra as técnicas para a rotulagem de células-tronco embrionárias e células-tronco mesenquimais com corantes fluorescentes. Esta técnica pode ser usada para um monitoramento in vivo de células-tronco transplantadas com imagens ópticas e para as correlações histopatológico com microscopia de fluorescência.

Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

Rastreamento de Dinâmica de enxerto muscular em animais de pequeno In Vivo Fluorescent Imagem

Descreve-se um sistema (Maroi) para in vivo quantificação de um marcador fluorescente entregue por saposina C (SAPC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesículas multi-ângulo de rotação de imagem óptica. Utilizando modelos de ratinho de cancro e artrite, é mostrado como a análise da curva de sinal Maroi pode ser utilizado para o mapeamento preciso e caracterização biológica de processos de doença.

In Vivo Imagem Óptico de tumores cerebrais e artrite Usando fluorescente SAPC-DOPS nanovesículas

Os monócitos são os principais reguladores da imunidade inata e desempenham um papel crítico na renovação do sistema fagocítico mononuclear periférico e em caso de inflamação. Este manuscrito descreve o procedimento de imagem em tempo real da medula óssea da calvária de camundongos para estudar o mecanismo de mobilização de monócitos.

Acompanhando Rato Medula Óssea monócitos<em&gt; In Vivo</em

Este protocolo descreve a radiomarcação de células-tronco mesenquimais equinas e sua implantação em lesões tendinosas no cavalo, a fim de determinar a sobrevivência celular e a distribuição tecidual usando cintilografia gama.

In Vivo Imaging and Rastreamento de Tecnécio-99m Rotulado de Medula Óssea Células-Tronco Mesenquimais em Equine Tendinopatia

O protocolo descreve um novo modelo de câmara de janela de fêmur murino que pode ser usado para rastrear o movimento de células na medula óssea femoral in vivo. A microscopia de fluorescência multifotônica intravital é usada para obter imagens de três componentes da medula óssea femoral (vasculatura, matriz de colágeno e neutrófilos) ao longo do tempo.

Modelo Câmara fêmur Janela para<em&gt; In Vivo</em&gt; Acompanhamento de celular na Murino de Medula Óssea

Murino estudos em modelos de inflamação do cólon têm demonstrado que uma pequena porcentagem (1-5%) de células-tronco mesenquimais (MSC) injetada por via intravenosa ou intraperitonealmente home ao cólon inflamado1,2. Este estudo mostra que guiada por ultra-som intracardíacos injeções de MSCs resultam em aumentada localização até o intestino.

Guiada por ultra-som intracardíaca injeção de células-tronco mesenquimais humanas para aumentar Homing para o intestino para uso em modelos murino de doenças intestinais inflamatórias Experimental

Os métodos tradicionais de avaliação adipogenic diferenciação são baratos e fáceis de usar, mas não são específicos para alterações na expressão gênica. Nós desenvolvemos um ensaio para quantificar a diferenciação de células mesenquimais em adipócitos maduros, usando um marcador específico de linhagem. Este ensaio tem diversas aplicações através de pesquisa básica e clínica médica.

Visualização e quantificação de células mesenquimais Adipogenic diferenciação potencial com um marcador específico da linhagem

Aqui, descrevemos um protocolo para isolar, cultivar e fenotipar células endoteliais microvasculares do tecido adiposo subcutâneo humano (hSATMVECs). Além disso, descrevemos um modelo experimental de diafonia hSATMVEC-adipócitos.

Estudando a conversa cruzada de células endoteliais adiposas/adipócitos no tecido adiposo subcutâneo humano

Usando um modelo explantado ex vivo , pequenos pedaços da porção rostral do tecido adiposo branco visceral de camundongos magros são cultivados por 7 a 10 dias, permitindo a indução e o estudo da inflamação do tecido adiposo conforme ocorre durante a alimentação rica em gordura.

Um modelo de camundongo ex vivo para inflamação do tecido adiposo com dieta rica em gordura

Aprenda a rastrear células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano em modelo de osteoartrite do joelho em ratos usando marcação fluorescente DiD. Este método permite avaliar a persistência e biodistribuição celular in vivo.

Na Vivo Rastreamento de adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas em um modelo de osteoartrite do joelho de rato com corante fluorescente membrana lipofílico (Vídeo) | JoVE Journal

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