Método do tubo de rolo modificados para precisamente localizadas e repetitivas imagens intermitentes durante a cultura a longo prazo de fatias de cérebro em um sistema fechado

O objetivo geral deste método de tubo de rolo modificado para cultura de fatias de cérebro é fornecer um sistema de cultura fechado para sobrevivência de fatias de longo prazo. com a capacidade de imagens repetitivas de florescência de alta resolução. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no desenvolvimento neuronal e distúrbios neurodegenerativos que requerem observações dos mesmos neurônios ao longo do tempo, como localizar proteínas-chave envolvidas na formação ou perda de sinapses.

As principais vantagens desta técnica são o sistema de cultura totalmente fechado que permite o uso seguro de vírus para expressão de proteínas e o uso de lamínulas fotogravadas para localizar as mesmas células para imagem. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando estávamos cultivando fatias em lamínulas dentro de tubos de rolos, mas precisávamos de uma maneira melhor de visualizar as mudanças que ocorrem em fatias vivas ao longo do tempo. O uso generalizado de vetores virais para expressar transgenes e populações de células específicas para imagens microscópicas nos levou a desenvolver um sistema fechado para proteger os usuários e eliminar a contaminação das objetivas do microscópio.

A capacidade de acompanhar a população idêntica de células dentro de fatias cerebrais ao longo do tempo permite estudos sobre o desenvolvimento de alterações patológicas e alterações de sinapses em modelos de roedores de distúrbios neurológicos humanos. Para começar, prepare o suporte para tubos de rolos e faça um gabarito para ajudar a fazer um furo nos tubos de rolos, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Usando o gabarito, segure na posição um tubo de cultura de plástico de um centímetro de lado plano, de modo que o lado plano fique voltado para cima.

Em seguida, faça um furo de seis milímetros de diâmetro com o centro a um centímetro do fundo e centralizado entre os lados do tubo. Com a ferramenta de rebarbação giratória, alise as bordas do furo e faça quatro ranhuras na borda interna do furo para facilitar a drenagem do furo durante a rotação. Em seguida, enxágue os tubos com etanol a 70% e seque-os ao ar em um gabinete de segurança biológica.

Esterilize os tubos em discos adesivos de borracha de silicone perfurados de 12 milímetros por 40 minutos sob a lâmpada UV. Após 20 minutos, reposicione os tubos e discos para que todas as superfícies expostas sejam esterilizadas. Em seguida, retire o suporte branco do disco adesivo, alinhe os orifícios e fixe a borracha de silicone na parte externa do tubo.

Uma vez obtidas as fatias, coloque dois microlitros de plasma de frango no centro do lado fotogravado de uma lamínula preparada. Espalhe o plasma ligeiramente para obter um ponto de três a quatro mililitros de diâmetro. Em seguida, use uma espátula estéril de ponta estreita para levantar uma fatia de cérebro preparada.

Use uma pinça fechada para manter a fatia na ponta da espátula enquanto levanta a fatia. Toque a espátula no ponto de plasma na lamínula e, com uma pinça fechada, empurre a fatia para a lamínula. Adicione uma fina camada de plasma de pintinho na lamínula antes de colocar a fatia e uma quantidade mínima de plasma tratado com trombina para cobrir a fatia.

Se a fatia flutuar, ela não permanecerá aderida quando a nuvem for removida. Em seguida, misture 2,5 microlitros de plasma e 2,5 microlitros de trombina em um tubo separado. Coloque rapidamente 2,5 microlitros desta mistura sobre e ao redor da fatia e pipete para cima e para baixo suavemente para misturá-la.

Remova a cobertura plástica transparente do lado exposto do adesivo de borracha de silicone previamente afixado no tubo do rolo. Em seguida, coloque a lamínula com a fatia de cérebro no adesivo, alinhando a fatia dentro do orifício. Para garantir a aderência, aplique uma pressão suave e uniforme na lamínula com o polegar, pressionando a lamínula uniformemente para baixo e segurando-a por cerca de um minuto enquanto a transfere para o gabinete de segurança biológica.

A pressão sobre a lamínula para aderir ao tubo sem vazamento deve ser correta e mantida por tempo suficiente para eliminar os canais de ar no saliente. Muita pressão quebrará a lamínula. Em uma cabine de segurança biológica, adicione 0,8 mililitros de meio de cultura neurobasal completo a cada tubo.

Em seguida, flua uma mistura de 5% de dióxido de carbono 95% de ar através de uma pipeta Pasteur estéril com plugue de algodão presa com segurança por uma braçadeira. Use-o para lavar o tubo do rolo com a mistura de gases e tampe rapidamente o tubo à medida que ele é retirado ao redor da pipeta. Em seguida, rotule os tubos com o número da fatia e o número do rack.

Insira os tubos em um rack de rolos; garantir que eles sejam geometricamente equilibrados. Se houver um número ímpar de tubos, adicione tubos vazios para equilibrar. Coloque os racks em uma incubadora de rolos de 35 graus Celsius, com os rolos girando o rack de rolos de 10 a 13 rotações por hora.

Incline a incubadora para trás aproximadamente 5 graus, levantando sua frente sobre uma tábua. Transfira um tubo com uma cultura de fatia para um suporte de tubo feito sob medida, como o mostrado aqui. Em seguida, coloque o suporte do tubo no adaptador de platina para manter a lamínula perpendicular à objetiva durante a geração de imagens.

Em seguida, empurre o controle deslizante no stage adaptador firmemente contra o tubo para manter o tubo na posição. Usando uma objetiva de quatro vezes sob transiluminação de campo claro, concentre-se no período da grade gravada na foto sob a fatia. Para a sessão inicial de imagem, examine rapidamente ao redor da fatia para localizar e registrar o número das várias regiões onde a imagem de maior ampliação é desejada.

Depois que as regiões de interesse forem identificadas, mova o palco para o primeiro quadrado da grade que contém uma região de interesse. Em seguida, mude para o objetivo de erro de força 20 e localize uma marca fiducial. Em seguida, mude para uma objetiva de maior potência, localize a mesma marca fiducial e registre a posição x e y do palco.

Mova o palco para encontrar os outros campos de interesse próximos e registre seus deslocamentos x e y da marca fiducial. As posições de deslocamento permitem uma localização consistente da mesma lamínula quando a fatia é fotografada, mesmo que a configuração x, y original da marca fiducial mude quando o tubo ou o adaptador de platina são removidos e substituídos. Capture um Z-stick de imagem dentro de cada campo selecionado usando o controle de objetiva do microscópio ou um controle de estágio Piezo, se disponível.

Usando um corante vital neuronal, a pilha confocal de imagens mostrada aqui, destaca a arquitetura 3D dos neuritos e do corpo celular, mas a mancha é excluída do núcleo. Para examinar as mudanças dependentes do tempo na morfologia e viabilidade da fatia de crescimento dentro das fatias durante a cultura de longo prazo, a mesma fatia foi marcada com corante vital neuronal fluorescente uma vez por semana, 24 horas antes da imagem. Para demonstrar a reprodutibilidade da imagem das células idênticas ao longo do tempo, o mesmo campo de uma fatia marcada com corante vital neuronal no dia 13 foi fotografado nos dias 14, 15, 16 e 17.

A posição de três células em cada dia é mostrada por um símbolo sobre o núcleo. Além do corante vital neuronal, proteínas fluorescentes mediadas por vírus podem ser utilizadas com este sistema para marcar células. Aqui, tanto um repórter sensível ao cálcio quanto bastonetes contendo cofilina podem ser claramente identificados 10 dias após a infecção.

A implementação bem-sucedida deste procedimento requer a preparação antecipada de todos os tubos, lamínulas e soluções. Ser capaz de obter fatias em um curto intervalo post-mortem também é crucial para o sucesso e requer muita prática. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de 90 minutos para obter 12-18 fatias de hipocampo de um filhote de camundongo, incluindo tempos de dissecação e plaqueamento.

Após este procedimento, as fatias do cérebro podem ser infectadas em vários momentos com vírus para alcançar a expressão específica do tipo de célula de proteínas marcadas com fluorescência ou silêncio para expressão gênica com RNA interferente pequeno ou RNA em grampo curto para sondar a função do gene. Não se esqueça de que trabalhar com vírus recombinantes pode ser perigoso e precauções como usar proteção para os olhos devem sempre ser tomadas ao trabalhar com esses reagentes.