Name: Método do tubo de rolo modificados para precisamente localizadas e repetitivas imagens intermitentes durante a cultura a longo prazo de fatias de cérebro em um sistema fechado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Aprenda o método do tubo de rolo modificado para cultura de fatias de cérebro de roedores com imagem intermitente de alta resolução. Esta técnica preserva a viabilidade neuronal e permite o rastreamento de populações idênticas de neurônios ao longo do tempo.

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Método do tubo do rolo aqui descrito permite cultivo a longo prazo e de alta resolução de imagem ao vivo do tecido cerebral em fatias. Um grande problema com a técnica de fatia como aplicado aqui é na montagem e manutenção de fatias. Revestimentos de lamela que oferecem suporte a adesão de fatia, promover fatia desbaste, aumentando a consequência natural de neuritos e migração de células fora da fatia; assim, evitamos o uso destes substratos. A inserção de grupos aminoácidos para o vidro por tratamento com 3-aminopropylt...

Cultura primária de neurônios dissociadas de regiões do cérebro de roedor é uma importante ferramenta usada por pesquisadores para observar respostas para patologicamente implicado estímulos. No entanto, tais estudos têm a desvantagem de olhar para os neurônios em 2D única e sem seu sistema de apoio a glia. Além disso, a não ser crescidas sob condições de muito alta densidade (640 neurônios/mm2 ou cerca de 16% da superfície), no qual ele torna-se impossível acompanhar a consequência aleatória de um dendrito ou axônio para mais do que uma curta distância do corpo celular, hipocampo viabilidade neuronal durante 4 semanas diminui significativamente1, limitando o uso de culturas dissociadas de estendido estudos das patologias relacionadas com a idade. O cultivo de fatias preparadas a partir de cérebro de roedor é uma opção atraente que supera essas limitações, mantendo uma arquitetura organizada cell e viabilidade para semanas ou meses. As condições para a manutenção de muitas regiões diferentes do cérebro de roedor em fatia cultura foram descritos2.
Dois métodos principais são amplamente utilizados para a cultura a longo prazo de fatias de cérebro: cultivo nas membranas para a interface ar-líquido3 ou cultivo em lamelas em tubos fechados pode para girar em uma incubadora de rolo para fornecer aeração4. Fatias cultivadas nas membranas podem ser fotografadas diretamente com microscopia de fluorescência de alta resolução usando um microscópio vertical e de objectivos de imersão de água5. Alternativamente, fatias cultivadas nas membranas foram transferidas para pratos de fundo de vidro para obter uma boa resolução de espinhas dendríticas, usando um microscópio invertido6. No entanto, ambos os métodos de imagem fatias crescidas nas membranas são sistemas abertos que exigem mudanças de médio e costumam usam antifúngico e/ou antibióticos para evitar ou reduzir a contaminação5,6. Fatias de uma membrana na interface ar-médio mantêm excelente morfologia e sobrevivência, mas retornando para locais precisos durante repetitivo imaging na alta magnificação é extremamente difícil, a menos que a experiência está seguindo apenas pequenos grupos de células expressando um marcador fluorescente. Embora fatias cultivadas em membranas têm sido utilizadas com expressão viral mediada de transgenes5,6, protocolos de biossegurança podem exigir um sistema fechado de cultura ser empregado por certos vetores virais que são usados para expressando fluorescente etiquetado proteínas e repórteres da fisiologia celular. Além disso, objectivos de imersão exigem descontaminação entre amostras que será seguido em cultura5. Uma aplicação importante das culturas de interface da membrana é a combinação de imagem de alta resolução com eletrofisiologia em tempo único pontos7.
Método do tubo do rolo com lamelas dentro do tubo plástico não permite qualquer eletrofisiologia ou imagens de alta resolução sem remover a lamela. Assim, este método foi aplicado mais frequentemente para estudos de longo prazo em que a pós-fixação observações tenham sido feitas a8. Descrito aqui é um método que utiliza a técnica de cultura de tubo do rolo, mas nos tubos perfurados-out com fatias em lamelas que podem ser fotografadas repetidamente para contanto que as culturas é mantido. O sistema fechado não requer nenhuma mudança média para a imagem latente e utiliza as lamelas de photoetched para fornecer marcas fiduciais que permitem que a imagem em alta ampliação, após dias ou semanas, os campos precisos previamente fotografados.
Nós aplicamos esse método para examinar alterações em roedor hipocampo, uma região do cérebro importantes envolvido na aprendizagem e memória. O hipocampo de roedor frequentemente é estudado como um modelo para alterações patológicas ou relacionadas com a idade observada durante o desenvolvimento do impairment cognitive9, tais como aqueles que ocorrem no anúncio. Nosso método é particularmente adequado para estudar as alterações patológicas que se desenvolvem dentro de uma única fatia ao longo do tempo em resposta às mudanças ambientais, tais como aumentos de peptídeos Aβ, que é característica da AD8. Uma patologia associada com cérebro de AD de humanos e roedor é a presença de agregados de cofilin-actina e hastes, os último contendo feixes de filamentos no qual cofilin e actina são em um 1:1 relação molar10,11, 12. as hastes têm sido observadas em fixas fatias de hipocampo de ratos após o tratamento de Aβ, bem como dentro de uma fatia do cérebro de roedores vivos expressando GFP-cofilin submetida a hipóxia8, e eles podem contribuir para a disfunção sináptica vista em AD e acidente vascular cerebral. Aqui nós usamos este novo método de cultivo para observar a evolução temporal e distribuição dentro de fatias de exógenas quiméricoes fluorescentes proteínas expressas introduzidas por diferentes vírus. Então, nós utilizamos a expressão neuronal específica de uma construção de repórter de cofilin para acompanhar o desenvolvimento da haste cofilin e patologia agregada em fatias hippocampal em resposta ao tratamento com oligômeros Aβ solúveis (Aβó).

<table><tbody><tr><td>Fundos de pratos de cultura de 15 cm</td><td>VWR Scientific</td><td>25384-326</td><td></td></tr><tr><td>Parafusos de Máquina de Cabeça Phillips (#10-32)</td><td>Ace Hardware</td><td></td><td>2.5" de comprimento e 3/16" de diâmetro</td></tr><tr><td>Arruelas Planas #10</td> Porcas de Parafuso <td>de Máquina ACE Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(#10-32)</td><td>Ilhós de Borracha ACE Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>ACE Hardware</td><td></td><td>5/16", espessura; 5/8", diâmetro do furo; 1.125", tubulação</td></tr><tr><td>de polietileno OD (5/16"; OD, 3/16"; ID)</td><td>ACE Hardware</td><td></td><td>Corte para 1.8" de comprimento</td></tr><tr><td>Arruela de Travamento #10</td><td>ACE Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Furadeira, 5 velocidades&nbsp;</td><td>Ace Hardware</td><td>ProTech Modelo 1201</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Flat-Sided Tubes</td><td>VWR</td><td>62407-076</td><td></td></tr><tr><td>Brocas, 3 mm, 6 mm e 15 mm&nbsp;</td><td>Ace Hardware</td><td>Diablo freud marca</td><td>Brocas para corte de plástico.</td></tr><tr><td>Brocas para madeira, 1,5 cm e 1 mm</td><td>Ace Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lima de madeira, clipes de mola Ace Harware</td><td></td><td></td><td></td>redondos de 1/4</tr><tr><td>", suporte de pressão de 16 mm</td><td>Ferramenta</td> de rebarbação de cabeça giratória Ace Hardware<td></td><td></td></tr><tr><td>, 5"</td><td>Ace Hardware</td><td>26307</td><td></td></tr><tr><td>Folha de Silicone Adesivo (Selo Seguro)</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>666581</td><td>0,5 mm de espessura</td></tr><tr>Furador de <td>6 mm</td><td>Furador Office Max</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 mm</td><td>thepunchbunch.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% de etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas fototecizadas, diâmetro de 12 mm</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>1916-91012</td><td></td></tr><tr><td>Bico de Bunsen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol Absoluto</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água Nanopura</td> 3-aminopropiltrietoxilano <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>#5 Dumont Fórceps</td> Ferramentas <td>de Ciência Fina</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Cortador de Tecidos McIlwain</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de barbear de dupla borda</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro Whatman</td><td>VWR</td><td>28450-182</td><td>Cortado em círculos de 5,8 cm de diâmetro</td></tr><tr><td>Policloro-trifluoroetileno (Aclar)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>10501-10</td><td>Corte em círculos de 5,8 cm de diâmetro</td></tr><tr><td>#21 Lâmina Cirúrgica</td><td>VWR Scientific</td><td>25860-144</td><td></td></tr><tr><td>#5 Dumont Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Espátula, inoxidável com extremidade cônica</td><td>VWR</td><td>82027-518</td><td></td></tr><tr><td>Solução Salina Balanceada Gey's</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9779&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Glicose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15023-021</td><td>Solução de 25% (p/v), filtro de 0,2 mm esterilizado</td></tr><tr><td>Plasma de frango</td><td>Cocalico Biologicals</td><td>30-0300-5L</td><td>Reidrate em água estéril, centrifugue a 2500 x g 30 min a 4 &deg; C, congelamento rápido alíquotas em nitrogênio líquido e armazenamento em&nbsp; -80 &deg;C.</td></tr><tr><td>Trombina tópica (bovina)</td> <td>Pfizer</td><td>Trombina-JMI</td><td>Alíquotas de congelamento rápido em nitrogênio líquido a 1.000 unidades internacionais / mL em diluente fornecido e armazenar a -80 ° C. Use a 250 unidades/mL.</td></tr><tr><td>Sistema de Rolos Celulares</td><td>Bellco Biotech</td><td>SciERA</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>de Rolos</td><td>Modelo Forma 3956</td><td></td></tr><tr><td>N21-MAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AR008</td><td></td></tr><tr><td>Caneta/Strep (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>200 mM Glutamina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15023-021</td><td>Solução de 25% (p/v), filtro de 0,2 mm esterilizado</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10888-022&nbsp;</td><td>Meio completo: 48 mL de Neurobasal A, 1 mL de N21-MAX, 0,625 mL de 200 mM de glutamina, 0,180 mL de glicose a 25%, 0,250 mL de caneta / estreptococo 100x.</td></tr><tr><td>Embalagem de lentivírus de terceira geração</td><td>Life Technologies</td><td>K4975-00</td><td></td></tr><tr><td>159 K filtros centrífugos de corte (Centricon)</td>Sistema de clonagem <td>lentiviral EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(InFusion)</td><td>Clonetech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmids 30323, 50856, 51279</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corante de viabilidade celular neuronal (NeuO)</td><td>Stemcell technologies</td><td>1801</td><td>Descongele uma vez e congele rapidamente em 4 &micro; L alíquotas. Armazene a -20 > C</td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>Objetivas de microscópio</td><td>Ar Olympus</td><td>: 4X, 20; óleo: 40X, 60X,</td><td></td></tr> <tr><td>Sistema confocal de disco giratório</td><td>Yokagawa</td><td>CSU22</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio EMCCD</td><td>Câmera fotométrica</td><td>Cascata II</td><td></td></tr><tr><td>Codificação linear (x,y), piezo z estágio superior plano</td><td>ASI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lasers de microscópio e integração</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T células</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Plasmina humana</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1867</td><td>0,002 U/mL em albumina de soro bovino a 0,1% (filtro de 0,2 mm esterilizado), congelamento rápido em nitrogênio líquido e armazenamento a -80 °C.</td></tr></tbody></table>

método do tubo de rolo modificados para precisamente localizadas e repetitivas imagens intermitentes durante a cultura a longo prazo de fatias de cérebro em um sistema fechado

Modified Roller Tube Method for Precisely Localized and Repetitive Intermittent Imaging During Long-term Culture of Brain Slices in an Enclosed System

Fatias de cérebro de roedor cultivadas são úteis para estudar o comportamento de neurônios e glia em um ambiente que mantém muitas das suas interações normais na vivo celular e molecular. Fatias obtidas a partir de uma variedade de linhas de rato geneticamente modificado ou o uso de vetores virais para expressão de proteínas fluorescente etiquetadas ou repórteres em fatias de cérebro de tipo selvagem permitem imagens de alta resolução por microscopia de fluorescência. Embora vários métodos têm sido desenvolvidos para imagem fatias do cérebro, combinando cultura fatia com a capacidade de realizar imagens de alta resolução repetitiva de células específicas em fatias ao vivo durante longos períodos de tempo tem colocado problemas. Isto é especialmente verdadeiro quando os vetores virais são utilizados para a expressão de proteínas exógenas desde que isto é feito melhor em um sistema fechado para proteger os usuários e evitar a contaminação cruzada. Simples modificações feitas ao método de cultura rolo tubo cérebro fatia que permitem imagens de alta resolução repetitiva de fatias durante muitas semanas em um sistema fechado são relatadas. Cultivo de fatias em photoetched lamelas permite o uso de marcas fiduciais rapidamente e precisamente reposicionar o palco para o campo idêntico de imagem ao longo do tempo, antes e depois de tratamentos diferentes. Exemplos são mostrados para o uso desse método combinado com coloração neuronal específica e expressão para observar alterações em fatias hippocampal arquitetura, expressão neuronal mediada por viral de proteínas fluorescentes e o desenvolvimento de patologia cofilin, que anteriormente foi observada no hipocampo de doença de Alzheimer (AD) em resposta ao tratamento da fatia com oligômeros de peptídeo de amiloide-β (Aβ).

Para determinar exatamente como marcas fiduciais podem ser utilizadas para recriar as mesmas células dentro das mesmas áreas ao longo do tempo, nós examinamos fatias cultivadas em photoetched lamelas (Figura 6A). Os neurônios foram visualizados por coloração com um corante vital (100 nM para 2h; não mancha células não-neuronais), que desaparece de neurônios ao longo do tempo, sem prejudicar as células25. Nós identifica...

Apresentado aqui é um método de tubo de rolo modificado para cultivo e intermitente de imagem de alta resolução do cérebro de roedor fatias muitas semanas com reposicionamento exacto em lamelas de photoetched. Viabilidade neuronal e morfologia da fatia são bem mantidos. Aplicações deste sistema completamente fechado usando vírus para expressão específica do tipo de célula são fornecidas.

Método do tubo de rolo modificados para precisamente localizadas e repetitivas imagens intermitentes durante a cultura a longo prazo de fatias de cérebro em um sistema fechado

Cultured rodent brain slices are useful for studying the cellular and molecular behavior of neurons and glia in an environment that maintains many of ...

O objetivo geral deste método de tubo de rolo modificado para cultura de fatias de cérebro é fornecer um sistema de cultura fechado para sobrevivência de fatias de longo prazo. com a capacidade de imagens repetitivas de florescência de alta resolução. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no desenvolvimento neuronal e distúrbios neurodegenerativos que requerem observações dos mesmos neurônios ao longo do tempo, como localizar proteínas-chave envolvidas na formação ou perda de sinapses.As principais vantagens desta técnica são o sistema de cultura totalmente fechado que permite o uso seguro de vírus para expressão de proteínas e o uso de lamínulas fotogravadas para localizar as mesmas células para imagem. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando estávamos cultivando fatias em lamínulas dentro de tubos de rolos, mas precisávamos de uma maneira melhor de visualizar as mudanças que ocorrem em fatias vivas ao longo do tempo. O uso generalizado de vetores virais para expressar transgenes e populações de células específicas para imagens microscópicas nos levou a desenvolver um sistema fechado para proteger os usuários e eliminar a contaminação das objetivas do microscópio.A capacidade de acompanhar a população idêntica de células dentro de fatias cerebrais ao longo do tempo permite estudos sobre o desenvolvimento de alterações patológicas e alterações de sinapses em modelos de roedores de distúrbios neurológicos humanos. Para começar, prepare o suporte para tubos de rolos e faça um gabarito para ajudar a fazer um furo nos tubos de rolos, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Usando o gabarito, segure na posição um tubo de cultura de plástico de um centímetro de lado plano, de modo que o lado plano fique voltado para cima.Em seguida, faça um furo de seis milímetros de diâmetro com o centro a um centímetro do fundo e centralizado entre os lados do tubo. Com a ferramenta de rebarbação giratória, alise as bordas do furo e faça quatro ranhuras na borda interna do furo para facilitar a drenagem do furo durante a rotação. Em seguida, enxágue os tubos com etanol a 70% e seque-os ao ar em um gabinete de segurança biológica.Esterilize os tubos em discos adesivos de borracha de silicone perfurados de 12 milímetros por 40 minutos sob a lâmpada UV. Após 20 minutos, reposicione os tubos e discos para que todas as superfícies expostas sejam esterilizadas. Em seguida, retire o suporte branco do disco adesivo, alinhe os orifícios e fixe a borracha de silicone na parte externa do tubo.Uma vez obtidas as fatias, coloque dois microlitros de plasma de frango no centro do lado fotogravado de uma lamínula preparada. Espalhe o plasma ligeiramente para obter um ponto de três a quatro mililitros de diâmetro. Em seguida, use uma espátula estéril de ponta estreita para levantar uma fatia de cérebro preparada.Use uma pinça fechada para manter a fatia na ponta da espátula enquanto levanta a fatia. Toque a espátula no ponto de plasma na lamínula e, com uma pinça fechada, empurre a fatia para a lamínula. Adicione uma fina camada de plasma de pintinho na lamínula antes de colocar a fatia e uma quantidade mínima de plasma tratado com trombina para cobrir a fatia.Se a fatia flutuar, ela não permanecerá aderida quando a nuvem for removida. Em seguida, misture 2,5 microlitros de plasma e 2,5 microlitros de trombina em um tubo separado. Coloque rapidamente 2,5 microlitros desta mistura sobre e ao redor da fatia e pipete para cima e para baixo suavemente para misturá-la.Remova a cobertura plástica transparente do lado exposto do adesivo de borracha de silicone previamente afixado no tubo do rolo. Em seguida, coloque a lamínula com a fatia de cérebro no adesivo, alinhando a fatia dentro do orifício. Para garantir a aderência, aplique uma pressão suave e uniforme na lamínula com o polegar, pressionando a lamínula uniformemente para baixo e segurando-a por cerca de um minuto enquanto a transfere para o gabinete de segurança biológica.A pressão sobre a lamínula para aderir ao tubo sem vazamento deve ser correta e mantida por tempo suficiente para eliminar os canais de ar no saliente. Muita pressão quebrará a lamínula. Em uma cabine de segurança biológica, adicione 0,8 mililitros de meio de cultura neurobasal completo a cada tubo.Em seguida, flua uma mistura de 5% de dióxido de carbono 95% de ar através de uma pipeta Pasteur estéril com plugue de algodão presa com segurança por uma braçadeira. Use-o para lavar o tubo do rolo com a mistura de gases e tampe rapidamente o tubo à medida que ele é retirado ao redor da pipeta. Em seguida, rotule os tubos com o número da fatia e o número do rack.Insira os tubos em um rack de rolos; garantir que eles sejam geometricamente equilibrados. Se houver um número ímpar de tubos, adicione tubos vazios para equilibrar. Coloque os racks em uma incubadora de rolos de 35 graus Celsius, com os rolos girando o rack de rolos de 10 a 13 rotações por hora.Incline a incubadora para trás aproximadamente 5 graus, levantando sua frente sobre uma tábua. Transfira um tubo com uma cultura de fatia para um suporte de tubo feito sob medida, como o mostrado aqui. Em seguida, coloque o suporte do tubo no adaptador de platina para manter a lamínula perpendicular à objetiva durante a geração de imagens.Em seguida, empurre o controle deslizante no stage adaptador firmemente contra o tubo para manter o tubo na posição. Usando uma objetiva de quatro vezes sob transiluminação de campo claro, concentre-se no período da grade gravada na foto sob a fatia. Para a sessão inicial de imagem, examine rapidamente ao redor da fatia para localizar e registrar o número das várias regiões onde a imagem de maior ampliação é desejada.Depois que as regiões de interesse forem identificadas, mova o palco para o primeiro quadrado da grade que contém uma região de interesse. Em seguida, mude para o objetivo de erro de força 20 e localize uma marca fiducial. Em seguida, mude para uma objetiva de maior potência, localize a mesma marca fiducial e registre a posição x e y do palco.Mova o palco para encontrar os outros campos de interesse próximos e registre seus deslocamentos x e y da marca fiducial. As posições de deslocamento permitem uma localização consistente da mesma lamínula quando a fatia é fotografada, mesmo que a configuração x, y original da marca fiducial mude quando o tubo ou o adaptador de platina são removidos e substituídos. Capture um Z-stick de imagem dentro de cada campo selecionado usando o controle de objetiva do microscópio ou um controle de estágio Piezo, se disponível.Usando um corante vital neuronal, a pilha confocal de imagens mostrada aqui, destaca a arquitetura 3D dos neuritos e do corpo celular, mas a mancha é excluída do núcleo. Para examinar as mudanças dependentes do tempo na morfologia e viabilidade da fatia de crescimento dentro das fatias durante a cultura de longo prazo, a mesma fatia foi marcada com corante vital neuronal fluorescente uma vez por semana, 24 horas antes da imagem. Para demonstrar a reprodutibilidade da imagem das células idênticas ao longo do tempo, o mesmo campo de uma fatia marcada com corante vital neuronal no dia 13 foi fotografado nos dias 14, 15, 16 e 17.A posição de três células em cada dia é mostrada por um símbolo sobre o núcleo. Além do corante vital neuronal, proteínas fluorescentes mediadas por vírus podem ser utilizadas com este sistema para marcar células. Aqui, tanto um repórter sensível ao cálcio quanto bastonetes contendo cofilina podem ser claramente identificados 10 dias após a infecção.A implementação bem-sucedida deste procedimento requer a preparação antecipada de todos os tubos, lamínulas e soluções. Ser capaz de obter fatias em um curto intervalo post-mortem também é crucial para o sucesso e requer muita prática. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de 90 minutos para obter 12-18 fatias de hipocampo de um filhote de camundongo, incluindo tempos de dissecação e plaqueamento.Após este procedimento, as fatias do cérebro podem ser infectadas em vários momentos com vírus para alcançar a expressão específica do tipo de célula de proteínas marcadas com fluorescência ou silêncio para expressão gênica com RNA interferente pequeno ou RNA em grampo curto para sondar a função do gene. Não se esqueça de que trabalhar com vírus recombinantes pode ser perigoso e precauções como usar proteção para os olhos devem sempre ser tomadas ao trabalhar com esses reagentes.

modified-roller-tube-method-for-precisely-localized-repetitive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo descreve um ensaio fatia organotípicas otimizado para o cérebro pós-natal e imagens de alta resolução de lapso de tempo de migração neuroblastos no fluxo migratório rostral.

Um Ensaio Slice organotípicas para High-Resolution Imaging Time Lapse de migração neuronal no cérebro pós-natal

Aqui nós descrevemos um método rápido e simples de células de imagem fluorescente etiquetado em fatias grossas semi-cérebro. Através da fixação, corte, limpeza e opticamente tecido cerebral descrevemos como imagens de epifluorescência ou confocal padrão pode ser usado para visualizar as células individuais e redes neuronal no tecido nervoso intacto.

Uma abordagem rápida para alta resolução de imagem de fluorescência em fatias grossas Semi-Cérebro

Neste protocolo, atualizar o progresso recente na imagem...

Respostas de imagem de cálcio nos neurônios GFP-tagged fatias de cérebro de rato Hipotalâmicos

Este vídeo demonstra um método de tubo de rolo modificado para a cultura a longo prazo de fatias de cérebro de um modelo de roedor. Primeiro, as fatias do cérebro são presas a lamínulas. Em seguida, são retirados tubos de rolos de lados planos com um orifício no lado plano e as lamínulas são posicionadas no orifício usando discos adesivos. Finalmente, um meio nutriente e uma mistura de dióxido de carbono e ar são adicionados ao tubo, e os tubos são incubados com um movimento de rolamento.

Um método de tubo de rolo modificado para a cultura de longo prazo de fatias de cérebro de roedores

Source:&lt;a style='text-decoration:none;' href='https://dx.doi.org/10.3791/55886-v'&gt; Wiegreffe, C., et. al.,  Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (2017) Este vídeo demonstra a microscopia confocal de lapso de tempo para observar a migração radial do neurônio cortical da zona subventricular para a placa cortical por meio de andaimes gliais radiais em fatias de cérebro embrionário de...

Imagem de lapso de tempo da migração radial de neurônios corticais em fatias de cérebro embrionário de camundongo transduzidas

Uma técnica para estudar células NG2 e oligodendrócitos usando um sistema de cultura de fatias do prosencéfalo e cerebelo é descrita.  Este método permite o exame da dinâmica de proliferação e diferenciação de células dentro da linhagem de oligodendrócitos, onde o ambiente extracelular pode ser facilmente manipulado, mantendo a citoarquitetura do tecido.

Culturas Organotípicas fatia para Estudar Oligodendrocyte Dynamics e Myelination

O uso de vários ângulos para cortar o cérebro do rato filhote, podemos melhorar em cima de uma fatia cerebral aguda anteriormente descrito que captura as conexões entre a maioria dos principais mesencéfalo e prosencéfalo estruturas auditivas.

A modificação de um Colliculo-tálamo-cortical do cérebro do rato Fatia, Incorporando a impressão 3-D da Câmara Components and Imaging Optical Multi-escala

Este protocolo fornece instruções para a observação direta de neurônios corticais que migram radialmente. A eletroporação in utero , a cultura de fatia organotípica e a imagem confocal de lapso de tempo são combinadas para estudar de forma direta e dinâmica os efeitos da sobre-expressão ou downregulation de genes de interesse em neurônios migratórios e analisar sua diferenciação durante o desenvolvimento.

Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando<em&gt; Em Utero</em&gt; Electroporação

Microglia, as residentes células imunes do cérebro, responder rapidamente com alterações morfológicas às modificações do seu ambiente. Este protocolo descreve como usar dois fotões microscopia para estudar a atração dos processos microglial em direção a serotonina ou ATP em fatias aguda do cérebro de ratos.

Imagem de dois fotões de atração Microglial processos para ATP ou de serotonina no cérebro aguda fatias

Descrevemos um protocolo para a expressão específica do tipo celular do sensor geneticamente codificado baseado em FRET ATeam1.03YEMK em culturas organotípicas do antecérebro do rato. Além disso, mostramos como usar este sensor para imagens dinâmicas dos níveis de ATP celular em neurônios e astrócitos.

Imagem de ATP intracelular em fatias organotípicas do tecido do cérebro do rato usando o sensor ateam1.03yEMK baseado em FRET

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, os neurônios e as células gliais se originam na zona ventricular que reveste o ventrículo e migram em direção à superfície do cérebro. Muitos genes estão envolvidos neste processo. Este protocolo apresenta a técnica para a imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais.

Imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais em fatias de cérebro de camundongo embrionário

Aprenda o método do tubo de rolo modificado para cultura de fatias de cérebro de roedores com imagem intermitente de alta resolução. Esta técnica preserva a viabilidade neuronal e permite o rastreamento de populações idênticas de neurônios ao longo do tempo.

Método do tubo de rolo modificados para precisamente localizadas e repetitivas imagens intermitentes durante a cultura a longo prazo de fatias de cérebro em um sistema fechado (Vídeo) | JoVE Journal

Método do tubo de rolo modificados para precisamente localizadas e repetitivas imagens intermitentes durante a cultura a longo prazo de fatias de cérebro em um sistema fechado

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