Name: Macropatch focal gravações das correntes sinápticas da junção Neuromuscular Larval da drosófila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Aprenda a técnica de macropatch focal para registrar correntes sinápticas na junção neuromuscular larval de Drosophila. Este método permite monitorar a atividade de botões sinápticos individuais com alta resolução.

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Com a subvenção de NIH R01 MH 099557

1. fabricação de eletrodos de gravação <ol><li>puxando os eletrodos de vidro <ol><li>uso o seguinte protocolo para o extrator de microeletrodos (ver Tabela de materiais): <ol><li>linha 1: calor 510 puxar - velocidade 30 hora 250; Linha 2: Aqueça 490 Pull - velocidade 30 hora 250. 
			Nota: As unidades de tempo correspondem a 0,5 ms por unidade; as outras unidades são relativas. O valor do calor deve ser ajustado para cada filamento após o teste de rampa é executado.</li>
		</ol></li> <li>Usar um microscópio (ampliação de x 35) para garantir que o diâmetro interno do eletrodo puxado é na faixa de 7 a 10 µm ( figura 1A). Armazenar os capilares em recipientes hermeticamente fechados para evitar a acumulação de poeira.</li>
	</ol></li> <li>Fogo polimento <ol><li>capilares de polonês de fogo (80-90% do valor máximo de calor para 1-2 s) usando uma microforja (ver Tabela de materiais). Certifique-se o diâmetro interno final do eletrodo polido é de 5 µm ( figura 1A) 27.</li>
	</ol></li> <li>Dobra Nota: duas curvas são feitas a fim de posicionar os eletrodos na parte superior do músculo sob um objectivo de alta ampliação.
	<ol><li>Uso o aparelho mostrado na figura 1B. Fixar o eletrodo no manipulador e posicione a ponta sobre o filamento, não tocando la</li>
		<li>Conjunto valor para 60-70% do máximo de calor e pressione o pedal da microforja para 1-2 s (consulte a Tabela de materiais) para aquecer o filamento. Use uma agulha em forma de L para puxar suavemente a ponta do eletrodo ( figura 1B alargada). Faça a curva em cerca de 90 o ( Figura 1).</li>
		<li>Segure o eletrodo sobre a chama da tocha à mão usando a pinça e fazer a segunda curva a uma distância de 7-10 mm da primeira curva e em um ângulo de aproximadamente 120 ó ( Figura 1).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig1.jpg"> Figura 1. Passos finais da fabricação de micropipeta. (A) eletrodo dicas depois puxando e polimento de fogo. (B. 1) a instalação para a ponta dobra. (B. 2), a área de Box é alargada mostrado à direita. O eletrodo e o filamento são fixos para que a ponta do eletrodo é posicionado ligeiramente acima do fio e não tocar. (C. 1) o eletrodo de gravação. (C. 2), a área de Box é alargada mostrado à direita. A primeira curva tem um ângulo de aproximadamente 90°, e a distância entre a primeira curva e a ponta do eletrodo é de cerca de 1 mm. escala barra = 3 mm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig1large.jpg" target="_blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
 2. etapas preparatórias adicionais <ol><li>Prepare-se, como heamolymph (HL3) solução (em mM): NaCl 70, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 a trealose, 115 sacarose, 5 HEPES e 1mm CaCl 2; ajustar o pH para 7,3 - 7.4. manter a solução na geladeira e torná-lo fresco toda semana.</li>
	<li>Fazer o mesmo caminho como gravação de vidro de pipetas de estimulação pipetas, exceto que não há nenhuma necessidade de dobrá-los. 
	Nota: A preparação de eletrodos de estimulação é descrita detalhadamente em 28 e 27. O diâmetro final após polimento de fogo deve ser na faixa de 5-7 µm.</li>
	<li>Inserir uma pipeta de estimulação em um suporte de microeletrodos conectada a uma seringa.</li>
	<li>Placas de dissecação de fabrico de pequenos pratos de petri (35 x 10mm) revestidos com epóxi de borracha de silicone (consulte Tabela de materiais), conforme descrito em 28. 
	Nota: A borracha de Silicone deve ser completamente endurecida antes do uso.</li>
	<li>Escolher um errante larvas de terceiro instar e dissecá-lo conforme descrito em 27 , 28 , 29 , 30. 
	Nota: Para visualizar boutons, use a estirpe voar CD8-GFP (ver Tabela de materiais) <ol><li>usando fórceps (ver Tabela de materiais), escolher as 3 rd ínstar larvas de um frasco.</li>
		<li>Pin as larvas, colocando o primeiro pino posterior e outro pino anterior (fechar a boca hooks).</li>
		<li>Solução Adicionar HL3.</li>
		<li>Fazer um corte usando Primavera tesoura (ver Tabela de materiais) todo o caminho do pino de topo para o fundo um do lado dorsal das larvas.</li>
		<li>Pino o filete de larvas, colocação de 2 pinos adicionais sobre os lados esquerdo e direito das larvas.</li>
		<li>Remover a coragem e a tracheas usando fórceps.</li>
		<li>Cortar os nervos fora o cabo ventral do nervo usando tesouras primavera.</li>
	</ol></li></ol> 3. Gravações elétricas de EJCs <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig2.jpg"> Figura 2. A configuração de gravação. A amostra MNJ derrotou o silicone revestido de Petri (seta) é posicionado sobre o estágio móvel do vertical composto microscópio equipado com recursos de epifluorescência, um objectivo de alta ampliação e dois Micromanipuladores. O microscópio está estacionado em uma tabela de antivibração. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig2large.jpg" target="_blank"> clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol><li>Gravação <ol><li>lugar de Petri com a preparação na fase de microscópio ( Figura 2). Inserir o eléctrodo de referência no banho.</li>
		<li>Preencher o eletrodo gravação com HL3 solução. No âmbito do objectivo de 10x (consulte Tabela de materiais), mergulhe o eletrodo para o banho e coloque-o sobre os músculos, 6 e 7 dos segmentos abdominais 2, 3 ou 4 usando o micromanipulador ((ver Tabela de materiais) Figura 3 A. 1 e a. 2).</li>
		<li>Mudar o objetivo para 60 x (veja a Tabela de materiais). Focar a área de interesse usando epi-fluorescência ou óptica DIC. Colocar a ponta do eletrodo em cima bouton synaptic ( Figura 3 b. 1-3).</li>
		<li>Pressione o eletrodo muito suavemente para o músculo. A pressão excessiva pode danificar o MNJ ou induzir um aumento na atividade sináptica espontânea. Verifique se a ponta do eletrodo não está entupido - se substituí-lo, é</li>
		<li>Ligar o amplificador, placa A/D e o computador.</li>
		<li>Escolher o modo de grampo de tensão do amplificador.</li>
		<li>Iniciar o software de aquisição e escolha o ' sem lacunas ' modo.</li>
		<li>Observe a aparência do mEJCs na tela do computador.</li>
		<li>Assegure-se que a amplitude do mEJCs é na faixa de 0,2 - 0,7 nd. 
		Nota: EJCs menores indicam que o eléctrodo de gravação tem defeitos ou se ele não está posicionado corretamente.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig3.jpg"> Figura 3. Visualização de boutons sinápticas. (A), A imagem de brightfield de um hemi-segmento abaixo dos 10 x ampliação (a. 1) e a área ampliada Box mostrando os músculos 6 e 7 (a. 2, a seta marca o eléctrodo de gravação). Barra de escala = 50 µm. (B) sináptica boutons são visualizados em uma linha de drosófila com um marcador neuronal geneticamente codificado (CD8-GFP) usando imagens de epi-fluorescência (b. 1) ou óptica DIC (b. 2). Imagens são tiradas com o 60 x objetivo e o cubo do filtro para a imagem latente de GFP (ver Tabela de materiais). Synaptic boutons são marcados com as setas e uma sobreposição de imagens DIC e fluorescente é mostrada em b. 3. Barra de escala = 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig3large.jpg" target="_blank"> clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="2"> <li>estimulação <ol><li>usando um micromanipulador, sob um controle visual, coloque o eletrodo de estimulação perto do axônio que inervam segmentos abdominais 2-4.</li>
		<li>Aplicar pressão negativa puxando o êmbolo da seringa conectada ao titular do eletrodo, para que o axônio é puxado para dentro do eletrodo ( Figura 2).</li>
		<li>Ativar o estimulador. Gire o botão na unidade de isolamento (consulte a Tabela de materiais) para definir uma corrente zero e suavemente, aumente até EJCs aparecem (ou até que o limite é atingido).</li>
		<li>Realizar a estimulação em um regime de suprathreshold, com a estimulação atual aumentou aproximadamente duas vezes, em comparação com o limiar para a observação de EJCs. 
		Nota: Em nossa experiência, tal intensidade de estimulação é ideal para evitar falhas de potencial de ação e potencial de ação disparando. Por exemplo, se EJCs aparecem na corrente de estimulação de 0.2 mA, usar uma corrente de 0,4 mA durante todo o experimento.</li>
	</ol></li> <li>Selo resistência <ol><li>medir a resistência de selo do eletrodo gravação macropatch colocando o interruptor de resistência do eléctrodo do amplificador para " teste do selo " posição. Observe que o valor da resistência do selo em GΩ será exibido no " atual " janela.</li>
		Certifique-se da resistência do selo está no intervalo de 0,5 - 2 M <li>Ω. Valores fora desse intervalo indicam que o eletrodo é polido não corretamente ou não devidamente posicionado.</li>
		<li>Monitorar a resistência do selo em toda a gravação, certificando-se que permanece constante durante todo o experimento.</li>
	</ol></li></ol> 4. Análise <ol><li>analisar gravações empregando personalizado software para análise (ver Tabela de materiais). 
	Nota: Nosso laboratório utiliza software in-house Quantan 31, que é personalizado para a detecção de EJCs e mEJCs gravado focally ( Figura 4). Este software inclui um filtro Gaussian digital e permite a detecção de picos quantal em sobreposição multi quantal eventos ( Figura 4A). Outras abordagens são descritas em 17.</li>
</ol> <img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig4.jpg"> Figura 4. Análise de quantal. Deteção de mEJCs (A) e (B) de EJCs por Quantan software. A área do evento é marcada em verde, e picos são marcados por setas vermelhas. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig4large.jpg" target="_blank"> clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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<li>Delgado, R., Maureira, C., Oliva, C., Kidokoro, Y., Labarca, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+of+vesicle+pools%2C+rates+of+mobilization%2C+and+recycling+at+neuromuscular+synapses+of+a+Drosophila+mutant%2C+shibire%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Size of vesicle pools, rates of mobilization, and recycling at neuromuscular synapses of a Drosophila mutant, shibire.</a> Neuron. 28 (3), 941-953 (2000).</li>
<li>Melom, J. E., Akbergenova, Y., Gavornik, J. P., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+and+evoked+release+are+independently+regulated+at+individual+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous and evoked release are independently regulated at individual active zones.</a> J Neurosci. 33 (44), 17253-17263 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Drosófila representa um organismo modelo vantajoso para estudar a transmissão sináptica. Várias configurações de gravação foram usadas no MNJ larval, incluindo gravações intracelulares de potenciais sinápticos, gravações das correntes sinápticas com dois eletrodos tensão braçadeira33,34e macropatch focal gravações das correntes sinápticas descritas aqui. A última técnica permite a quantificação precisa da transmissão sináptica em boutons visualizados.</p...

Drosófila é um sistema excelente modelo para estudar os mecanismos moleculares de controle da transmissão sináptica. O sistema neuromuscular em Drosophila é glutamatérgico, e portanto a drosófila de junção neuromuscular (JNM) pode ser usada para estudar as características conservadas de lançamento glutamatérgico. Desde Jan e de Jan estudo1, as terceiro ínstar larvas tem sido amplamente costumava estudar evocado e espontânea transmissão sináptica monitorando potenciais de junção excitatória (EJPs) ou correntes (EJCs). EJPs são comumente registrados intracelular com um microeléctrodo de vidro afiado, e refletem a atividade do MNJ inteira, incluindo todos os boutons fazendo sinapses para a fibra muscular determinada.
Em contraste, a atividade de um número limitado dos sítios de lançamento pode ser gravada focally posicionando uma dica micropipeta perto de terminais neuronais ou varicosidades sinápticas. Esta técnica foi originalmente empregada por Katz e Miledi2, e gravações extracelulares focais têm sido empregadas com sucesso em várias preparações de JNM, incluindo sapo3,4,5, rato6 , 7 , 8, crustáceo,9,10,11,12,13,14,15,16e Drosófila17,18,19,20,21,22,23. Esta abordagem foi desenvolvida por Dudel, quem otimizado macropatch recodificação eletrodos24,25. Na implementação do Dudel, esta técnica estreitamente alinhados a solta-remendo-braçadeira método26.
O MNJ larvas de Drosophila definiu claramente boutons sinápticas e linhas transgénicas com geneticamente codificadas etiquetas fluorescentes neuronais (ver Tabela de materiais) estão prontamente disponíveis. Estas vantagens nos permitiram gravar EJCs e mEJCs de um selecionado bouton sináptica20,21,22. Aqui, descrevemos esta técnica em detalhe.

<table><tbody><tr><td>Sutter P-97</td><td>Instrumento Sutter</td><td>P-97</td><td>Extrator de microeletrodos</td></tr><tr><td>Narishige MF-830</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Microforge</td></tr><tr><td>WPI MF200</td><td>WPI</td><td>MF200</td><td>Microforge</td></tr><tr><td>Glass capilaries</td><td>WPI</td><td>B150-86-10</td><td>Glass capilaries</td></tr><tr><td>Microtorch 1WG61</td><td>Grainer</td><td>1WG61</td><td>Microtorch</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit de elastômero de silicone</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td>Silicone para preparação de placas de dissecção</td></tr><tr><td>Pinos</td><td>de B00J5PMPJA</td><td>Amazon</td><td>Pinos para posicionamento de larvas</td></tr><tr><td>Pinças</td><td>WPIINC</td><td>500342</td><td>Pinças para colocação de pinos, remoção de vísceras e traqueias.</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>WPIINC</td><td>501778</td><td>Tesoura para cortar a cutícula das larvas e nervos.</td></tr><tr><td>Olympus BX61WI</td><td>Olympus</td><td>BX61WI</td><td>Microscópio vertical</td></tr><tr><td>Olympus Lumplan FL N 60x</td><td>Olympus</td><td>UPLFLN 60X</td><td>Objetiva de microscópio 60X</td></tr><tr><td>Olympus UPlan FL N 10x</td><td>Olympus</td><td>Uplanfl N 10X</td><td>Objetiva de microscópio 10X</td></tr><tr><td>Micromanipulador Narishige</td><td></td><td>MHW-3</td><td>Micromanipulador hidráulico de água de três eixos</td></tr><tr><td>npi Electronic GmbH ELC-03XS</td><td>npi Electronic GmbH</td><td>ELC-03XS</td><td>Amplificador eletrofisiológico</td></tr><tr><td>A.M.P.I Master 8</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master 8</td><td>Estimulador elétrico</td></tr><tr><td>A.M.P.I Iso-Flex</td><td>A.M.P.I.</td><td>Iso-Flex</td><td>Stimulus isolador</td></tr><tr><td>TMC mesa antivibração TMC</td><td></td><td>63-9090</td><td>Mesa antivibração</td></tr><tr><td>TMC Gaiola de Faraday</td><td>TMC</td><td>81-333-90</td><td>Gaiola de Faraday</td></tr><tr><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1322A Digidata</td><td></td></tr><tr><td>Computador</td><td>Dell</td><td>Dimension 5150</td><td>com Win XP</td></tr><tr><td>OS Suporte de eletrodo</td><td>WPI</td><td>MEH3SW</td><td>Suporte de eletrodo</td></tr><tr><td>Filtro óptico</td><td>Omega óptico</td><td>XF 115-2</td><td>Cubo de filtro para detecção de proteína fluorescente verde (GFP)</td></tr><tr><td>pCLAMP 8</td><td>Axon Instruments</td><td>8.0.0.81</td><td>Software para gravação de sinal</td></tr><tr><td>Quantan</td><td>Software interno</td> <td>-</td> <td>Software para processamento de sinal</td></tr><tr><td>Canton-S (Wildtype)</td> <td>Bloomington Stock Center</td><td>64349</td><td>Linha de controle cpx</td></tr><tr><td>SH1</td><td>Presente generoso de J.T. Littleton-Complexin</td><td></td> <td>knock-out linha de mosca com exocitose espontânea aumentada</td></tr><tr><td>CD8-GFP</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>5137</td><td>Linha de mosca com fluorescência neuronal (GFP) Tag</td></tr></tbody></table>

macropatch focal gravações das correntes sinápticas da junção neuromuscular larval da drosófila

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosófila junção neuromuscular (JNM) é um sistema excelente modelo para estudar a transmissão sináptica glutamatérgico. Descrevemos a técnica de macropatch focal gravações das correntes sinápticas de boutons visualizados no MNJ larvas de Drosophila . Esta técnica requer a fabricação personalizada de micropipetas, bem como um microscópio composto, equipado com uma alta ampliação, objectivo de imersão de água de longa distância, óptica de interferência diferencial (DIC) de contraste e uma fluorescente de gravação acessório. O eletrodo de gravação está posicionado no topo de um selecionado bouton sináptica visualizado com óptica DIC, epi-fluorescência ou ambos. A vantagem desta técnica é que permite monitorar a atividade sináptica de um número limitado de sítios de lançamento. O eletrodo de gravação tem um diâmetro de vários micra, e os locais de lançamento posicionados fora da borda do eletrodo não afetam significativamente as correntes gravadas. As correntes sinápticas gravadas tem cinética rápida e podem ser facilmente resolvidas. Estas vantagens são especialmente importantes para os estudos de linhas de mosca mutantes com maior atividade sináptica espontânea ou assíncrona.

Macropatch focal gravações permitem monitoramento atividade sináptica de boutons sinápticas selecionados (Figura 5). Quando o eletrodo é posicionado na parte superior uma bouton synaptic (Figura 5A, site 1), os mEJCs gravados (Figura 5, local 1) têm uma amplitudes exceda significativamente o nível de ruído e em ponto de aumentação fases (em uma escala do milissegundo sub). Quando o eletrodo gravação ...

Correntes sinápticas podem ser gravadas focally de boutons sinápticas visualizados na drosófila terceiro ínstar larvas junção neuromuscular. Esta técnica permite monitorar a atividade de um único bouton sináptica.

Macropatch focal gravações das correntes sinápticas da junção Neuromuscular Larval da drosófila

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

O objetivo geral desta técnica é monitorar a atividade sináptica de botões sinápticos visualizados na junção neuromuscular larval de drosófila. Um excelente sistema modelo facilmente passível de manipulação genética. Essa técnica pode abordar questões-chave em sua ciência.Por exemplo, como as mutações das proteínas sinápticas regulam a transmissão sináptica. A principal vantagem desta técnica é que a atividade de um número limitado de locais de liberação pode ser monitorada e registrada correntes de cinética rápida e pode ser facilmente resolvida. Para iniciar o experimento: prepare o extrator de microeletrodo.Use um microscópio com ampliação de 35X para garantir que o diâmetro interno do eletrodo puxado esteja na faixa de sete a dez micrômetros. Armazene os capilares em recipientes bem fechados para evitar o acúmulo de poeira. Em seguida, limpe os capilares usando uma microforja.Certifique-se de que o diâmetro interno final do eletrodo polido seja de cinco micrômetros. Em seguida, passe para a dobra. Fixe o eletrodo no manipulador e posicione a ponta sobre o filamento sem tocá-lo.Defina o valor de calor para 60-70% do máximo e pressione o pedal da micro forja por um a dois segundos para aquecer o filamento. Use uma agulha em forma de L para puxar suavemente a ponta do eletrodo para baixo e faça a dobra em aproximadamente 90 graus. Segure o eletrodo sobre a chama da tocha com a mão e faça a segunda curva a sete a dez milímetros da primeira curva e em um ângulo de aproximadamente 120 graus.Prepare uma solução semelhante à hemolinfa ou HL3. Mantenha a solução no refigerador e deixe-a fresca todas as semanas. Prepare pipetas de estimulação da mesma forma que grava pipetas de vidro sem dobrá-las.Em seguida, insira uma pipeta de estimulação em um suporte de microeletrodo conectado a uma seringa. Placas de dissecação fabricadas a partir de pequenas placas de Petri revestidas com epóxi de borracha de silicone. Em seguida, usando uma pinça, pegue uma larva de terceiro ínstar errante de um frasco.Prenda as larvas colocando o primeiro pino na parte posterior e outro pino anterior perto dos ganchos da boca. Adicione a solução HL3. No lado dorsal das larvas, faça um corte usando uma tesoura de mola do pino superior ao pino inferior.Prenda o filé das larvas colocando dois pinos adicionais nos lados esquerdo e direito das larvas. Remova as entranhas e a traqueia usando uma pinça. Corte os nervos do lado de fora do cordão nervoso ventral usando uma tesoura de mola.Coloque a placa de Petri com a preparação no microscópio stage. Insira o eletrodo de referência no banho. Encha o eletrodo de registro com solução HL3.Sob a objetiva 10X, mergulhe o eletrodo no banho e coloque-o sobre os músculos seis e sete dos segmentos abdominais de dois, três ou quatro usando o micro manipulador. Em seguida, mude a objetiva para 60X e concentre-se na área de interesse usando epiflorescência ou óptica DIC. Coloque a ponta do eletrodo em cima do botão sináptico e pressione o eletrodo muito suavemente sobre o músculo, pois a pressão excessiva pode danificar a JNM ou induzir um aumento na atividade sináptica espontânea.Em seguida, ligue o amplificador, a placa AD e o computador. Em seguida, escolha o voltage clamp modo no amplificador. Inicie o software de aquisição e escolha o modo sem lacunas e observe a aparência dos MEJCs na tela do computador.Certifique-se de que a amplitude dos MEJCs esteja na faixa de 0,2 a 0,7 nanoamperes. Usando um micromanipulador sob controle visual, coloque o eletrodo de estimulação próximo ao axônio, inervando os segmentos abdominais de dois a quatro. Aplique pressão negativa puxando o pistão da seringa conectada ao porta-eletrodo para que o axônio seja puxado para dentro do eletrodo.Em seguida, ligue o estimulador. Gire o botão na unidade de isolamento para definir uma corrente zero e, em seguida, aumente-a suavemente até que os EJCs apareçam ou até que o limite seja atingido. Realize a estimulação em regime de superlimiar.Com a corrente de estimulação, aumente aproximadamente duas vezes em relação ao limiar para a observação de EJCs. Meça a resistência de vedação do eletrodo de macro-patch de gravação girando o interruptor de resistência do eletrodo do amplificador para a posição de teste de vedação. Observe o valor da resistência da vedação em giga ohms que será exibido na janela atual.As gravações de patch macro focal permitem monitorar a atividade sináptica de botões sinápticos selecionados. Quando o eletrodo é posicionado no topo de um botão sináptico, os MEJCs registrados têm amplitudes que excedem significativamente o nível de ruído e fases de subida acentuada em uma faixa inferior a um milissegundo. Quando o eletrodo de registro é afastado do botão sináptico por vários mícrons, as amplitudes dos MEJCs do gravador diminuem quase até o nível de ruído.Os EJCs gravados mal podem ser distinguidos do ruído e têm fases ascendentes prolongadas. As gravações focais permitem a detecção precisa de MEJCs no complexo e no gnomo mutante. Enquanto as gravações intercelulares desse mutante exibem eventos de liberação que se sobrepõem e não podem ser detectados de forma confiável.O ajuste dos ângulos do eletrochip é fundamental para o posicionamento do eletrodo. Após este procedimento, outros métodos, como a verificação de imagens de eventos de liberação individuais, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a integração da atividade de zonas ativas individuais.

focal-macropatch-recordings-synaptic-currents-from-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui nós descrevemos métodos eletrofisiológicos para medir a transmissão sináptica na junção neuromuscular de larva Drosophila. Liberação evocada é iniciado artificialmente estimulando os axônios do neurônio motor ea transmissão através do MNJ pode ser medida pela resposta pós-sináptica evocado no músculo.

Métodos eletrofisiológicos de gravação Potenciais Synaptic do MNJ de larvas de Drosophila

Aplicação de eletrofisiologia às sinapses acessível fornece uma medida quantificável de atividade sináptica, útil na análise de mutantes sináptica. Este artigo descreve um método de dissecação usada para expor as junções neuromusculares (MNJ)...

Dissecação e gravação a partir da junção neuromuscular C. Elegans

Gravação eletrofisiológicas na Drosophila Embrião

Larval zebrafish representar o sistema primeiro modelo vertebrados para permitir a gravação simultânea patch clamp um músculo do neurônio motor e alvo espinhal esquelético. Este vídeo demonstra os métodos microscópicos utilizados para identificar uma CaP segmentar do neurônio motor e células do músculo-alvo, bem como as metodologias para a gravação de cada tipo de célula.

Gravações patch emparelhado Grampo da Motor-neurônio e músculo alvo ósseas em Zebrafish

Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

No patch situ gravações de fixação são usados ​​para a caracterização eletrofisiológica dos neurônios no circuito intacto. No modelo genético Drosophila patch clamping é difícil, porque o SNC é pequeno e está rodeado por uma bainha robusto. Este artigo descreve o procedimento para remover os neurônios bainha e limpa para gravações posteriores braçadeira de patches.

Preparação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Os neurônios centrais para<em&gt; In situ</em&gt; Patch aperto

A junção neuromuscular da Drosophila (NMJ) é usada como modelo para estudar a morfologia e a função das sinapses. Este vídeo descreve características importantes que os pesquisadores quantificam para caracterizar o NMJ. O protocolo de exemplo demonstra um software capaz de realizar a quantificação automaticamente.

drosófila Quantificação da Junção Neuromuscular (NMJ): Um Método para Avaliar a Morfologia e Função Sináptica

Este vídeo demonstra a técnica para registrar correntes sinápticas de um botão sináptico na junção neuromuscular da larva de Drosophila. Esta técnica permite monitorar a atividade de um único botão sináptico, o que é importante para o estudo de linhas de mosca mutantes com atividade sináptica espontânea ou assíncrona aumentada.

Registrando correntes sinápticas na junção neuromuscular larval de Drosophila

Nós desenvolvemos uma preparação cordão intacto cérebro espinhal para gravar e monitorar a atividade elétrica através de patches gravação braçadeira dos neurônios e outras células Mauthner reticulospinais em embriões de peixe-zebra. Assim, somos capazes de gravar correntes sinápticas excitatórias e inibitórias, a atividade do canal voltagem-dependentes e potenciais de ação dos neurônios-chave em um embrião em desenvolvimento.

Grampo patch Gravações de Embryonic Cells Zebrafish Mauthner

Registrar correntes de Ca2+ na membrana facial de liberação pré-sináptica é a chave para uma compreensão precisa da entrada de Ca2+ e da liberação de neurotransmissores. Apresentamos uma dissociação aguda da medula espinhal da lampreia que produz axônios reticuloespinhais isolados funcionais, permitindo o registro diretamente da membrana facial de liberação de terminais pré-sinápticos individuais.

Aguda dissociação de lampreia reticulospinais axônios para permitir a gravação do lançamento Rosto Membrana de terminais pré-sinápticos funcionais individuais

A junção neuromuscular larval do peixe-zebra é um modelo atraente para o estudo da fisiologia sináptica. É passível de muitas técnicas experimentais, incluindo eletrofisiologia e imagens ópticas. Aqui, descrevemos um protocolo para transmissão sináptica de imagem usando uma sonda baseada em pHluorina sob um microscópio de epifluorescência vertical.

Imagens ao vivo da reciclagem de vesículas sinápticas na junção neuromuscular de larvas dissecadas de peixe-zebra

Aprenda a técnica de macropatch focal para registrar correntes sinápticas na junção neuromuscular larval de Drosophila. Este método permite monitorar a atividade de botões sinápticos individuais com alta resolução.

Macropatch focal gravações das correntes sinápticas da junção Neuromuscular Larval da drosófila

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