Macropatch focal gravações das correntes sinápticas da junção Neuromuscular Larval da drosófila

O objetivo geral desta técnica é monitorar a atividade sináptica de botões sinápticos visualizados na junção neuromuscular larval de drosófila. Um excelente sistema modelo facilmente passível de manipulação genética. Essa técnica pode abordar questões-chave em sua ciência.

Por exemplo, como as mutações das proteínas sinápticas regulam a transmissão sináptica. A principal vantagem desta técnica é que a atividade de um número limitado de locais de liberação pode ser monitorada e registrada correntes de cinética rápida e pode ser facilmente resolvida. Para iniciar o experimento: prepare o extrator de microeletrodo.

Use um microscópio com ampliação de 35X para garantir que o diâmetro interno do eletrodo puxado esteja na faixa de sete a dez micrômetros. Armazene os capilares em recipientes bem fechados para evitar o acúmulo de poeira. Em seguida, limpe os capilares usando uma microforja.

Certifique-se de que o diâmetro interno final do eletrodo polido seja de cinco micrômetros. Em seguida, passe para a dobra. Fixe o eletrodo no manipulador e posicione a ponta sobre o filamento sem tocá-lo.

Defina o valor de calor para 60-70% do máximo e pressione o pedal da micro forja por um a dois segundos para aquecer o filamento. Use uma agulha em forma de L para puxar suavemente a ponta do eletrodo para baixo e faça a dobra em aproximadamente 90 graus. Segure o eletrodo sobre a chama da tocha com a mão e faça a segunda curva a sete a dez milímetros da primeira curva e em um ângulo de aproximadamente 120 graus.

Prepare uma solução semelhante à hemolinfa ou HL3. Mantenha a solução no refigerador e deixe-a fresca todas as semanas. Prepare pipetas de estimulação da mesma forma que grava pipetas de vidro sem dobrá-las.

Em seguida, insira uma pipeta de estimulação em um suporte de microeletrodo conectado a uma seringa. Placas de dissecação fabricadas a partir de pequenas placas de Petri revestidas com epóxi de borracha de silicone. Em seguida, usando uma pinça, pegue uma larva de terceiro ínstar errante de um frasco.

Prenda as larvas colocando o primeiro pino na parte posterior e outro pino anterior perto dos ganchos da boca. Adicione a solução HL3. No lado dorsal das larvas, faça um corte usando uma tesoura de mola do pino superior ao pino inferior.

Prenda o filé das larvas colocando dois pinos adicionais nos lados esquerdo e direito das larvas. Remova as entranhas e a traqueia usando uma pinça. Corte os nervos do lado de fora do cordão nervoso ventral usando uma tesoura de mola.

Coloque a placa de Petri com a preparação no microscópio stage. Insira o eletrodo de referência no banho. Encha o eletrodo de registro com solução HL3.

Sob a objetiva 10X, mergulhe o eletrodo no banho e coloque-o sobre os músculos seis e sete dos segmentos abdominais de dois, três ou quatro usando o micro manipulador. Em seguida, mude a objetiva para 60X e concentre-se na área de interesse usando epiflorescência ou óptica DIC. Coloque a ponta do eletrodo em cima do botão sináptico e pressione o eletrodo muito suavemente sobre o músculo, pois a pressão excessiva pode danificar a JNM ou induzir um aumento na atividade sináptica espontânea.

Em seguida, ligue o amplificador, a placa AD e o computador. Em seguida, escolha o voltage clamp modo no amplificador. Inicie o software de aquisição e escolha o modo sem lacunas e observe a aparência dos MEJCs na tela do computador.

Certifique-se de que a amplitude dos MEJCs esteja na faixa de 0,2 a 0,7 nanoamperes. Usando um micromanipulador sob controle visual, coloque o eletrodo de estimulação próximo ao axônio, inervando os segmentos abdominais de dois a quatro. Aplique pressão negativa puxando o pistão da seringa conectada ao porta-eletrodo para que o axônio seja puxado para dentro do eletrodo.

Em seguida, ligue o estimulador. Gire o botão na unidade de isolamento para definir uma corrente zero e, em seguida, aumente-a suavemente até que os EJCs apareçam ou até que o limite seja atingido. Realize a estimulação em regime de superlimiar.

Com a corrente de estimulação, aumente aproximadamente duas vezes em relação ao limiar para a observação de EJCs. Meça a resistência de vedação do eletrodo de macro-patch de gravação girando o interruptor de resistência do eletrodo do amplificador para a posição de teste de vedação. Observe o valor da resistência da vedação em giga ohms que será exibido na janela atual.

As gravações de patch macro focal permitem monitorar a atividade sináptica de botões sinápticos selecionados. Quando o eletrodo é posicionado no topo de um botão sináptico, os MEJCs registrados têm amplitudes que excedem significativamente o nível de ruído e fases de subida acentuada em uma faixa inferior a um milissegundo. Quando o eletrodo de registro é afastado do botão sináptico por vários mícrons, as amplitudes dos MEJCs do gravador diminuem quase até o nível de ruído.

Os EJCs gravados mal podem ser distinguidos do ruído e têm fases ascendentes prolongadas. As gravações focais permitem a detecção precisa de MEJCs no complexo e no gnomo mutante. Enquanto as gravações intercelulares desse mutante exibem eventos de liberação que se sobrepõem e não podem ser detectados de forma confiável.

O ajuste dos ângulos do eletrochip é fundamental para o posicionamento do eletrodo. Após este procedimento, outros métodos, como a verificação de imagens de eventos de liberação individuais, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a integração da atividade de zonas ativas individuais.