Preparação de Drosophila Os neurônios centrais para In situ Patch aperto

O objetivo geral deste procedimento é preparar o neurônio motor de vôo cinco da Drosophila para gravações de patch clamp em C dois. Isso é feito visualizando primeiro o cordão nervoso ventral da drosófila com os neurônios motores de vôo marcados com GFP de um a cinco através de uma lente de imersão de água 40x. O segundo passo é usar uma pipeta de adesivo preenchida com protease quebrada para aplicar protease nos neurônios motores marcados com GFP, a fim de soltar os detritos glia e traqueia que obstruem o acesso ao neurônio motor cinco.

Em seguida, os detritos glia e traqueia são removidos sugando suavemente os detritos soltos e glia para dentro da pipeta e puxando a traqueia para fora do caminho com a aplicação de pressão positiva e negativa. Como alternativa, neste ponto, a luz brilhante é usada para remover os detritos restantes que não podem ser vistos com luz fluorescente através de um filtro GFP. Em última análise, o neurônio motor cinco limpo pode ser visto fracamente sob luz forte, mas bem visto usando luz fluorescente com um filtro GFP.

Depois de enxaguar as células com solução salina por 15 a 20 minutos, elas são preparadas para gravações subsequentes de dois patch clamps in situ. O procedimento que vou mostrar hoje ajudará a responder a questões-chave no campo da neurofisiologia, como quais canais iônicos estão subjacentes, quais correntes iônicas e, por sua vez, quais correntes iônicas estão subjacentes ao comportamento. Geralmente, os indivíduos novos nessa técnica terão dificuldades porque é difícil ver as mudanças sutis na aparência dos neurônios durante o procedimento de limpeza, o que é necessário antes do experimento do grampo do animal de estimação.

Uma membrana celular limpa é um pré-requisito crucial para gravações subsequentes de lâmpadas de animais de estimação in situ e, como é tão difícil julgar a limpeza da membrana celular, vou mostrar uma demonstração visual do procedimento. Como fazer isso hoje? Comece este procedimento montando a placa de Petri em um microscópio epifluorescente de estágio fixo vertical.

Em seguida, posicione o prato com a mosca de forma que a parte anterior fique voltada para o lado onde o porta-eletrodo está montado. Em seguida, visualize o cordão nervoso ventral com uma lente de imersão em água de alta ampliação, alta abertura numérica e um filtro GFP. Os neurônios motores cinco estão localizados bilateralmente na superfície dorsal do gânglio no neuroespelho mesotorácico, perto da linha média do gânglio entre os neurônios motores proeminentes da traqueia cinco com seus dendritos aparecem como uma área verde difusa.

O somato ficará mais distinto após a limpeza. No entanto, seus dendritos permanecerão embaçados devido ao tecido que os cobre. Aqui usamos filtros de densidade neutra para evitar a superexposição do tecido por muita luz fluorescente, especialmente luz azul.

Se ocorrer branqueamento, provavelmente a saída de luz é muito forte e a célula está danificada pela foto. Certifique-se de que a sucção seja constante e que a saída de solução salina esteja posicionada de forma que o nível da solução na câmara de registro não flutue para cima e para baixo. Uma perfusão constante e estável é refletida pelo som gorgolejante constante e nunca interrompido que é produzido pela sucção constante de solução salina para fora do banho.

Agora use uma torneira ou tubo de diâmetro específico para regular a taxa de perfusão da câmara de registro em aproximadamente dois mililitros por minuto. O volume da câmara deve ser o menor possível para garantir a troca rápida das soluções na câmara, o que garantirá a remoção rápida da protease e dos bloqueadores. A partir da câmara de registro, dobre e prenda as agulhas hipodérmicas aos tubos estreitos como entrada e saída de solução salina.

Em seguida, coloque-os perto da câmara de gravação com plasticina. Em seguida, puxe uma pipeta de patch com um extrator de pipeta. Quebre a ponta um pouco sob o microscópio com uma pinça limpa.

Em seguida, encha a pipeta com 2% de protease e tampão PBS sem entupi-la. Insira a pipeta no suporte do eletrodo. Para garantir o controle adequado da pressão aplicada, o suporte precisa ser hermeticamente vedado.

Em seguida, conecte um tubo à pequena saída no suporte da pipeta. Prenda-o de forma que puxar a extremidade livre do tubo não afete a pipeta inserida Verifique o movimento da pipeta sob o microscópio. Em seguida, insira uma ponta de pipeta de plástico na extremidade livre da tubulação para a aplicação de pressão positiva ou negativa na pipeta.

Agora, visualize a pipeta cheia de enzimas sob a lente de imersão em água 40 x com luz brilhante. Concentre-se na ponta da pipeta. Se estiver entupido, tente tirar a sujeira aplicando pressão positiva ou negativa.

Se a sujeira não sair, prepare uma nova pipeta cheia de enzimas. Em seguida, mude para a luz fluorescente. Abaixe a pipeta com enzima cuidadosamente e concentre novamente até que o corpo celular possa ser visto.

Quando a pipeta estiver próxima ao corpo celular, desligue a perfusão. Aplique pressão positiva em rajadas curtas em direção ao corpo celular para que tudo o que está dificultando o acesso à célula seja afrouxado. Em seguida, mova o dorsalmente para pegar os detritos soltos que podem ter sobrado da bainha ganglionar ao redor do cordão nervoso ventral com aplicação alternada de pressão positiva e negativa.

Use a pipeta como um aspirador de pó para limpar ao redor do corpo da célula. Este procedimento de limpeza é feito até que a membrana pareça livre de detritos. Em seguida, use luz fluorescente azul de alta intensidade para visualizar rapidamente a membrana e certificar-se de que ela esteja limpa, a fim de visualizar os neurônios motores mudarem para luz brilhante e remover as células e detritos que não puderam ser vistos com luz fluorescente.

Após o término do procedimento de limpeza, ligue novamente o sistema de perfusão e apague a luz. Em seguida, enxágue as células por cerca de 15 a 20 minutos com soro fisiológico ou com a solução que será usada. Puxe as pipetas de remendo dos capilares de vidro boro silícico com um extrator de pipeta vertical.

Em seguida, conduza gravações convencionais de grampo de patch de célula inteira no modo de grampo de tensão e grampo de corrente mostrado aqui é um exemplo das correntes de cálcio registradas do neurônio motor cinco. Existem pelo menos duas correntes de cálcio diferentes, uma corrente de cálcio transitória ativada por baixa tensão e uma corrente de cálcio de alta tensão sustentada. E este é um exemplo das correntes de potássio registradas do neurônio motor cinco.

A corrente de potássio total é mostrada nesta figura, e esta figura mostra apenas a corrente de potássio sustentada A corrente de potássio transitória pura é obtida subtraindo as correntes de potássio sustentadas da corrente de potássio total. Aqui está um exemplo dos padrões de disparo provocados por injeções de corrente somática no neurônio motor cinco. O potencial de membrana em repouso é negativo 59 milivolts Uma vez dominado, o procedimento pode ser feito em cinco minutos, excluindo a seção prévia do animal e o subsequente enxágue da preparação.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como limpar os neurônios identificados no cordão nervoso ventral TRALA para prepará-los para as gravações subsequentes dentro de sua lâmpada de contato.